王鑫,魏琴*,莫開林

1.宜賓學(xué)院，四川宜賓 644000；

2.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川成都 610081

油樟，學(xué)名Cinnamomum longipaniculatum(Gamble) N.Chao ex H.W.Li，是我國能夠生產(chǎn)天然芳香油的特有樹種，該樹種于1974年由四川省林業(yè)科學(xué)院森林植物分類專家趙良能發(fā)現(xiàn)并命名[1]。油樟精油中含55%以上的1,8-桉葉油素，1,8-桉葉油素應(yīng)用面廣，需求量大，但從香料植物油樟中提取收原材料資源限制，其產(chǎn)量有限。因此，探索一種使用油樟內(nèi)生細(xì)菌通過發(fā)酵工程直接生產(chǎn)1,8-桉葉油素的生產(chǎn)工藝具有較廣闊的研究空間。本文在前期篩選出高產(chǎn)1,8-桉葉油素油樟內(nèi)生細(xì)菌的基礎(chǔ)上[2,3]，對發(fā)酵條件優(yōu)化做了一個較為系統(tǒng)的研究，優(yōu)選出1,8-桉葉油素內(nèi)生細(xì)菌最佳發(fā)酵條件，為發(fā)酵工程人工生產(chǎn)1,8-桉葉油素奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 生物材料

油樟1,8-桉葉油素內(nèi)生細(xì)菌，自制。

1.1.2 藥品試劑

表1 藥品試劑Tab.1 Pharmaceutical reagents

1.2 儀器設(shè)備

表2 主要儀器Tab.2 Main equipments

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 發(fā)酵時間的確定

取15個100 mL錐形瓶，超聲波清洗干凈，70℃烘干備用。每個錐形瓶冷卻至室溫，分別加入40 mL LB液體培養(yǎng)基，封口膜覆蓋、橡皮筋纏繞密封，置于高壓滅菌鍋設(shè)置溫度121℃、滅菌時間20 min，滅菌結(jié)束后取出錐形瓶，置于超凈工作臺紫外線照射冷卻至室溫。設(shè)置發(fā)酵時間為五個梯度水平，即10 h、15 h、20 h、25 h、30 h，無菌條件下接種目標(biāo)菌株，置于35℃，140 r·min?1恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中按發(fā)酵時間梯度分別進行發(fā)酵，每一個發(fā)酵時間水平內(nèi)發(fā)酵3個錐形瓶，作為平行實驗。發(fā)酵完成后測定1,8-桉葉油素產(chǎn)量，優(yōu)選出最適宜的發(fā)酵溫度。

1.3.2 發(fā)酵轉(zhuǎn)速（溶氧）的確定

對發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速優(yōu)選的實驗設(shè)計5個梯度，即轉(zhuǎn)速為120 r·min?1、130 r·min?1、140 r·min?1、150 r·min?1、160 r·min?1。在篩選出的發(fā)酵時間為20 h的基礎(chǔ)上，每個轉(zhuǎn)速梯度設(shè)置3個平行。發(fā)酵結(jié)束后測定1,8-桉葉油素產(chǎn)量，優(yōu)選出最適宜的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。

1.3.3 發(fā)酵pH值的確定

對發(fā)酵pH值優(yōu)選的實驗設(shè)計5個梯度，pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。在篩選出的發(fā)酵時間為20 h、發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150 r·min?1的基礎(chǔ)上，每個pH值梯度設(shè)置3個平行實驗。發(fā)酵結(jié)束后測定1,8-桉葉油素產(chǎn)量，優(yōu)選出最適宜的發(fā)酵pH值。

1.3.4 發(fā)酵溫度的確定

對發(fā)酵溫度優(yōu)選的實驗設(shè)計5個梯度，即29℃、31℃、33℃、35℃、37℃。在篩選出的發(fā)酵時間為20 h、發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150 r·min?1、發(fā)酵pH為6.5的基礎(chǔ)上，每個溫度梯度設(shè)置3個平行實驗。發(fā)酵結(jié)束后測定1,8-桉葉油素產(chǎn)量，優(yōu)選出最適宜的發(fā)酵溫度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件和SPSS軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時間對1,8-桉葉油素產(chǎn)量的影響

以不同的發(fā)酵時間為基礎(chǔ)進行的發(fā)酵時間優(yōu)化實驗，所得1,8-桉葉油素的產(chǎn)量情況如圖1（a）所示。以5個梯度水平的發(fā)酵時間對目標(biāo)菌株進行發(fā)酵時間優(yōu)化，隨著發(fā)酵時間增加，產(chǎn)量由最開始的10 h時1.80 mg·L?1開始呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢，在發(fā)酵時間為20 h時，1,8-桉葉油素產(chǎn)量達(dá)到最高為2.67 mg·L?1，發(fā)酵時間繼續(xù)延長，當(dāng)超過20 h后，其產(chǎn)量顯著降低。因此發(fā)酵時間過短或者過長，都會影響1,8-桉葉油素的產(chǎn)量，發(fā)酵時間確定為20 h最為適宜。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對1,8-桉葉油素產(chǎn)量的影響

以不同的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為基礎(chǔ)進行的發(fā)酵轉(zhuǎn)速優(yōu)化實驗，所得1,8-桉葉油素的產(chǎn)量情況如圖1（b）所示。以5個梯度水平的發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對目標(biāo)菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化，隨著發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速增加，產(chǎn)量由最低的120 r·min?1時1.08 mg·L?1開始呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢，在150 r·min?1時達(dá)到最高產(chǎn)量3.08 mg·L?1，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速超過150 r·min?1后，產(chǎn)量顯著降低。因此發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速過低或者過高，都會影響1,8-桉葉油素的產(chǎn)量，發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速確定為150 r·min?1最為適宜。

2.3 發(fā)酵p H值對1,8-桉葉油素產(chǎn)量的影響

以不同的發(fā)酵pH值為基礎(chǔ)進行的發(fā)酵pH值優(yōu)化實驗，所得1,8-桉葉油素的產(chǎn)量情況如圖1（c）所示。以5個梯度水平的發(fā)酵pH值對目標(biāo)菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化，隨著發(fā)酵pH值增加，產(chǎn)量由初始的pH值=6.0時2.00 mg·L?1呈現(xiàn)上升趨勢，在pH值=6.5時達(dá)到最高產(chǎn)量6.53 mg·L?1，當(dāng)發(fā)酵pH值超過6.5后，產(chǎn)量顯著降低并趨于穩(wěn)定。因此發(fā)酵pH值過低或者過高，都會影響1,8-桉葉油素的產(chǎn)量，發(fā)酵pH值確定為6.5最為適宜。

圖1 發(fā)酵工藝條件對產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of fermentation conditionson yield

2.4 培養(yǎng)溫度對1,8-桉葉油素產(chǎn)量的影響

以不同的發(fā)酵溫度為基礎(chǔ)進行的發(fā)酵溫度優(yōu)化實驗，所得1,8-桉葉油素的產(chǎn)量情況如圖1（d）所示。以5個梯度水平的發(fā)酵溫度對目標(biāo)菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化，隨著發(fā)酵溫度增加，產(chǎn)量由初始的溫度29℃時5.26 mg·L?1呈現(xiàn)為上升趨勢，在31℃時達(dá)到最高產(chǎn)量9.68 mg·L?1，當(dāng)發(fā)酵溫度超過31℃后，產(chǎn)量顯著降低并趨于穩(wěn)定。因此發(fā)酵溫度過低或者過高，都會影響1,8-桉葉油素的產(chǎn)量，發(fā)酵溫度確定為31℃最為適宜。

3 結(jié)論

本研究通過單因素優(yōu)化實驗，確定了油樟1,8-桉葉油素內(nèi)生細(xì)菌最佳發(fā)酵條件工藝參數(shù)為：發(fā)酵溫度為31℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速（溶氧）為150 r·min?1、發(fā)酵為pH值6.5、發(fā)酵時間為20 h。在單因素優(yōu)化實驗篩選出的最佳發(fā)酵條件下，產(chǎn)量由未優(yōu)化時的2.30 mg·L?1增長至9.68 mg·L?1，產(chǎn)量增長率為320.8%。