肖傳豪，穆之琳，陳鄭博

(1. 濮陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南大學(xué) 濮陽工學(xué)院，河南 濮陽 457000；2. 首都師范大學(xué) 化學(xué)系，北京 100048)

谷胱甘肽（GSH）是細(xì)胞內(nèi)最豐富的巰基化合物，細(xì)胞GSH 濃度的變化與衰老、心臟病、癌癥、白細(xì)胞減少、肝損傷、HIV 和神經(jīng)退化性疾病有關(guān)[1-2]. 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）在肝細(xì)胞液中含量較高，通過催化GSH 與活性代謝產(chǎn)物結(jié)合，在降低毒性和促進(jìn)尿排泄方面發(fā)揮重要作用[3]. GST 已被證明是肺癌、卵巢癌、乳腺癌和胃癌等腫瘤的重要標(biāo)志物[4].

目前已發(fā)展了多種分析方法檢測GSH，如色譜法[5-6]、光度法[7]、質(zhì)譜法[8]和免疫發(fā)光法[9]等.對于GST 檢測，目前已發(fā)展了一些檢測方法，包括比色法、生物發(fā)光探針法、熒光微板法、金屬有機(jī)抑制劑和光學(xué)方法[10-14]. 然而，這些方法由于存在成本高、靈敏度低、預(yù)處理繁瑣等缺點[15]，限制了它們在生化分析中的應(yīng)用. 而比色法因其可簡單地用肉眼讀出而備受關(guān)注[16-17].

本文以制備的具有過氧化物酶活性的球形Ag-Au 納米籠作為催化劑，催化3,3′,5,5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和過氧化氫（H2O2）反應(yīng)，生成藍(lán)色的TMB 氧化產(chǎn)物（oxTMB）并在652 nm 出現(xiàn)紫外吸收峰. 不同濃度GSH 的加入造成oxTMB 被還原，從而引起溶液由藍(lán)色變淺，652 nm 處的吸光強(qiáng)度減小. GST 和GSH 的特異性作用使得GSH 對TMB和H2O2的反應(yīng)抑制程度減弱，顏色由淺變成深藍(lán)色，652 nm 處的吸光度增強(qiáng). 從而實現(xiàn)了一種簡單、快速、靈敏、專一檢測GSH 和GST 的比色方法，并用于人血清樣品中的GSH 和GST 的測定，獲得了滿意的結(jié)果.

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑UV-2550 型紫外可見（UVvis）吸收光譜儀（蘇州生產(chǎn)）；H-7560 型透射電子顯微鏡（日本日立公司）；SU-8000 型透射電子顯微鏡（日本日立公司）.

硝酸銀（99.7%）、氯金酸（99.9%）、檸檬酸鈉（99%）、醋酸（98%）、醋酸鈉（99.5%）、過氧化氫、3,3′,5,5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）（99%）、谷胱甘肽（GSH）（98%）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）（阿拉丁試劑（上海）有限公司）, 試劑均為分析純，無任何純化步驟.

1.2 球形納米Ag 的制備基于AgNO3還原法[18]，將油浴鍋加熱至95 ℃，向油浴加熱的燒瓶中加入50 mL 甘油-水混合物（10 mL 甘油+40 mL 水），在1 200 r/min 的 劇 烈 攪 拌 下，向 溶 液 中 添 加9 mg AgNO3. 然后迅速向溶液中加入1 mL 3%檸檬酸鈉溶液，在95 ℃下反應(yīng)1 h 后，自然冷卻到室溫，得到粒徑為40 nm 球形銀溶液.

1.3 球形Ag-Au 納米籠的制備取1.2 mL 上述制備好的納米銀溶液和3.6 mL 蒸餾水于10 mL 離心管中. 將0.1 mol/L 的氯金酸溶液稀釋至3.75 mmol/L，然后移取1.2 mL 氯金酸（3.75 mmol/L）分5 次加入到上述溶液中，每次240 μL，每隔10 min 加一次，直至加完. 由此得到HAuCl4刻蝕納米銀形成的球形Ag-Au 納米籠溶液，放置在4 ℃條件下備用.

1.4 實驗方法對于GSH 的檢測，通常將100 μL Ag-Au 溶液、300 μL 5 mmol/L TMB、300 μL 5 mmol/L H2O2、300 μL HAc-NaAc（pH 3.6）混合均勻，并在室溫下孵化30 min. 然后加入100 μL 不同濃度的GSH溶液并在常溫下反應(yīng)5 min，在室溫下記錄 400～800 nm 處的紫外吸收光譜，記錄652 nm 波長處的oxTMB 的吸光度值. 以該值為縱坐標(biāo)（y），GSH 濃度c為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以測定樣品GSH含量.

對于GST 的檢測，分別將100 μL 900 μmol/L GSH 溶液和100 μL 不同濃度的GST 溶液混合，在37 °C 下孵化3 h. 然后向上述溶液再加入300 μL HAc-NaAc（pH 3.6）、300 μL 5 mmol·L-1TMB、300 μL 5 mmol/L H2O2、100 μL Ag-Au 溶液. 充分混合后反應(yīng)10 min，記錄 400～800 nm 處的紫外吸收光譜，記錄652 nm 波長處的oxTMB 的吸光度值. 以該值為縱坐標(biāo)（y），GST 質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此測定樣品GST 含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理如圖1，具有大表面積的球形Ag-Au 納米籠作為催化劑，催化TMB 和H2O2反應(yīng)，無色的TMB 被氧化成藍(lán)色的oxTMB，并在652 nm處觀察到清晰的紫外吸收峰. 在Ag-Au 納米籠-TMB-H2O2體系中加入GSH 后，652 nm 處的吸光度降低，溶液顏色從藍(lán)色變?yōu)闇\藍(lán)色，最后到無色.這種現(xiàn)象是由于oxTMB 被GSH 還原所致[19]. 對于GST，它能夠特異性結(jié)合GSH，因此，GST 的加入將有效地抑制oxTMB 被GSH 還原，導(dǎo)致652 nm處的吸光度增加，溶液顏色從無色變?yōu)樗{(lán)色. 因此，可以通過652 nm 處的oxTMB 的吸光度和顏色的變化來測定GSH 和GST 的含量.

圖1 利用Ag-Au 納米籠催化TMB-H2O2 反應(yīng)比色檢測GSH 和GST 示意圖Fig. 1 Schematic of colorimetric detection of GSH and GST based on TMB-H2O2 reaction catalyzed by Ag-Au nanocage

2.2 Ag-Au 納米粒子表征如圖2，TEM（圖2（a））和SEM（圖2（c））圖像顯示了Ag-Au 空心籠的納米結(jié)構(gòu). HRTEM 圖像也清楚地顯示了Au-Ag 納米籠的形成（圖2（b））. 加入氯金酸前后形成的納米Ag和Ag-Au 納米籠的UV-vis 吸收光譜如圖2（d）所示，隨著氯金酸的加入，溶液的吸收峰從427 nm 處紅移到544 nm. 這些結(jié)果都證實了球形納米銀成功被氯金酸刻蝕，同時氯金酸還原后生成的納米金沉積在刻蝕的納米銀表面形成Ag-Au 納米籠.

圖2 Ag-Au 納米籠的納米粒子表征Fig. 2 Characterization of nanoparticles in Ag-Au nanocages

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化考察了不同濃度（0.25，0.5，0.75，1 mmol/L）氯金酸對Ag-Au 納米籠的吸光度的影響（圖3）. 實驗結(jié)果表明，隨著氯金酸濃度的增加，溶液的吸光度先增大后減小. 當(dāng)氯金酸濃度為0.75 mmol/L 時，此時544 nm 處的溶液吸光度達(dá)到最大，表明此濃度下的Ag-Au 納米粒子催化能力最強(qiáng). 所以，0.75 mmol/L 為氯金酸的最佳反應(yīng)濃度. 考察了不同c(TMB)/c(H2O)（1∶1，1∶2，1∶10，1∶20，5∶1，10∶1）對溶液吸光度的影響. 如圖4，當(dāng)TMB 為10 mmol/L，H2O2濃度為10 mmol/L 時，652 nm 處的吸光度接近最大，又鑒于如果H2O2過剩，過剩的H2O2將和GSH 反應(yīng)，故選用10 mmol/L TMB 和10 mmol/L H2O2用 于 后 續(xù) 實 驗. 根 據(jù) 文獻(xiàn)[20]，當(dāng)pH 高于4 時，Ag 納米粒子的催化效果會使H2O2會分解為H2O 和O2，而不是OH 自由基，故將pH 控制在3.6 左右. 因此，本實驗選擇pH 3.6的HAc-NaAc 緩沖溶液.

圖3 不同濃度氯金酸對Ag-Au 納米籠吸光度的影響Fig. 3 Effect of different concentrations of chloroauric acid on the absorbance of Ag-Au nanocages

圖4 TMB/H2O2 濃度比對oxTMB 溶液吸光度的影響Fig. 4 Effect of TMB/H2O2 concentrations on the absorbance of oxTMB

2.4 靈敏度與線性范圍在最佳反應(yīng)條件下，對不同濃度的GSH（終濃度：0，0.5，0.6，0.7，0.8，1.0，2.0 μmol/L）進(jìn)行了定量檢測，結(jié)果如圖5 所示. 無GSH 存在時，Ag-Au 納米籠很容易催化TMB 和H2O2反應(yīng)，生成藍(lán)色的oxTMB 溶液，且在652 nm處存在出現(xiàn)很強(qiáng)的吸收峰；隨著GSH 濃度的增加，652 nm 處的吸光度逐漸降低，相應(yīng)地，溶液顏色從藍(lán)色逐漸變?yōu)闇\藍(lán)，最終為無色（圖5（a）內(nèi)插圖），表明oxTMB 能被GSH 還原. 而且，652 nm 處的吸光度值隨著GSH 濃度的對數(shù)值增加而增加，在0.5～1.0 μmol/L 范圍內(nèi)線性減小，其線性方程為y=-0.122-5.231x，相關(guān)系數(shù)R2為0.986（圖5（b）），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3.1%（n=3），表明此方法可用于定量檢測GSH. 當(dāng)GST 被加入到Ag-Au 納米籠-TMB- H2O2-GSH 溶液時，由于GST 和GSH 能特異性結(jié)合，導(dǎo)致652 nm 處吸光度增加，溶液顏色由無色變成藍(lán)色（圖6（a））. GST 在1～50 mg/L 范圍內(nèi)時，GST 溶液的質(zhì)量濃度（x）對數(shù)值與其吸光度值（y）呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=0.855+0.01x，相關(guān)系數(shù)R2為0.999（圖6（b）），RSD 小于2.8%（n=3），方法的檢出限（3 倍信噪比）為1 nmol/L.以上說明該方法對GSH 和GST 檢測具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性.

圖5 最佳反應(yīng)條件下不同濃度GSH 溶液紫外檢測光譜曲線Fig. 5 The UV detection spectra of GSH solutions with different concentrations under the optimal reaction conditions

圖6 GST 紫外檢測光譜曲線Fig. 6 The UV detection spectra of GSH solutions

2.5 選擇性選擇5 種常見物質(zhì)（谷氨酸、半胱氨酸、組氨酸、葡萄糖和甘氨酸）作為干擾物質(zhì)，并以2 μmol/L 的濃度于上述最優(yōu)反應(yīng)條件下檢測. 結(jié)果表明，除了GSH 引起652 nm 處吸光度值的明顯改變，其它3 種干擾物均不會出現(xiàn)響應(yīng). 然后分別在這5 種干擾物-Ag-Au 納米籠-TMB-H2O2體系中加入1 mg/L GST，幾乎未引起任何吸光度的變化. 這些結(jié)果表明該方法對GSH 和GST 有足夠的特異性，這歸因于GSH 與oxTMB 以及GSH 和GST 之間的特異性相互作用.

2.6 實際樣品分析通過檢測新鮮人血清中的GSH 和GST，研究了本文方法在生物環(huán)境中的傳感性能. 將新鮮人血清稀釋100 倍，使GSH 濃度在本實驗的線性范圍內(nèi). 為了測量回收率，分別添加不同含量的GSH 和GST 進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，結(jié)果見表1. 樣品的平均回收率為95%～103.37%，RSD不大于5.6%，說明本方法可用于真實臨床樣本中的GSH 和GST 的檢測.

表1 血清樣品中GSH 和GST 回收結(jié)果（n=3）Tab. 1 Recovery results of GSH and GST in serum samples (n=3)

3 結(jié)論

建立了一種高靈敏和選擇性的比色法用于GSH 和GST 的檢測. Ag-Au 納米籠表現(xiàn)出類似過氧化物酶的活性，催化TMB 和H2O2反應(yīng)，伴隨著藍(lán)色oxTMB 及652 nm 處紫外吸收峰的形成. 為了提高檢測體系的靈敏度，優(yōu)化了TMB 濃度、H2O2濃度、溶液pH 值檢測條件. 研究表明，當(dāng) TMB 濃度為 5 mmol/L，H2O2濃度為 10 mmol/L，在pH 3.6的HAc-NaAc 溶液里取得最優(yōu)檢測結(jié)果，且具有優(yōu)異的選擇性. 隨著GSH 濃度的增加，Ag-Au 納米籠的吸光度在0.5～1.0 μmol/L 范圍內(nèi)呈線性減??；隨著GST 質(zhì)量濃度的增加，Ag-Au 納米籠的吸光度在1～50 mg/L 范圍內(nèi)呈線性增加.