和美霞，陳 波，胡 麗，張曉慶，季秀玲，魏云林，張 琦

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

類(lèi)胡蘿卜素（carotenoid）是一類(lèi)重要脂溶性色素的總稱(chēng)，是由異戊二烯骨架構(gòu)成的C40 或C30萜類(lèi)化合物，其廣泛存在于植物、細(xì)菌、真菌和藻類(lèi)中. 類(lèi)胡蘿卜素是人體內(nèi)維生素A 的前體，但人和動(dòng)物不能自身合成，攝入類(lèi)胡蘿卜素可提高人體免疫力[1]. 此外，類(lèi)胡蘿卜素還具有著色、抗氧化、抗凋亡和抗癌作用[2-5]. 類(lèi)胡蘿卜素是以乙酰CoA作為底物，經(jīng)甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑合成焦磷酸異戊烯基（isopentenylpyrophosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），二者經(jīng)濃縮并經(jīng)不同反應(yīng)過(guò)程進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為番茄紅素、β-胡蘿卜素等不同類(lèi)胡蘿卜素[6]. 3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR）催化3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）生成MVA，是MVA 合成途徑中的限速酶，也是異戊二烯生物合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，對(duì)于類(lèi)胡蘿卜素和麥角固醇等異戊二烯衍生物的生物合成有著重要作用[7-8].

HMGCR 廣泛存在真核生物、原核生物和古細(xì)菌中，是一種高度保守的膜結(jié)合酶[9]. 根據(jù)氨基酸序列的差異，HMGCR 可以分為Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)，真核生物和古菌的HMGCR 屬于Ⅰ類(lèi)，其利用NADPH作為電子供體，而細(xì)菌的HMGCR 屬于Ⅱ類(lèi)并利用NADH 作為電子供體[10-12]. 真核生物HMGCRs在氨基酸序列上存在很大差異，但一些關(guān)鍵位點(diǎn)如底物結(jié)合位點(diǎn)TTEGALVA 和ENVIGX3I/LP，NADPH 結(jié) 合 位 點(diǎn)DAMGMNMIS 和GTVGGGT，以及與催化活性相關(guān)的4 個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基Glu、Lys、Asp 和His 卻高度保守[13-14]. 研究還表明，Ⅰ類(lèi)HMGCR 的N 末端具有參與甾醇感應(yīng)、蛋白泛素化降解調(diào)節(jié)和催化反應(yīng)的多種跨膜結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域在每種物種中種類(lèi)和個(gè)數(shù)不同，而且序列變化很大[9,13-14].

目前，商業(yè)化的類(lèi)胡蘿卜素來(lái)源主要是通過(guò)化學(xué)合成獲得，少量是從植物提取和微生物發(fā)酵生產(chǎn)的天然類(lèi)胡蘿卜素. 化學(xué)合成的類(lèi)胡蘿卜素雖然具有天然類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)似的分子結(jié)構(gòu)，但天然類(lèi)胡蘿卜素更有利于健康，因此人們對(duì)其需求也日益增加[1].近年來(lái)通過(guò)代謝工程研究使微生物高效益、低成本生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素逐漸成為有希望的替代途徑[15]，而且產(chǎn)油紅酵母由于保持產(chǎn)油酵母發(fā)酵上的優(yōu)勢(shì)并能持續(xù)提供乙酰CoA 合成類(lèi)胡蘿卜素和油脂等各種衍生物的優(yōu)點(diǎn)逐漸成為研究熱點(diǎn)[16]. 紅冬孢酵 母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235 是一株分離自云南程海的產(chǎn)油紅酵母菌株[17]，和很多紅酵母一樣，YM25235 菌株也主要合成圓酵母素（torulene）、紅酵母紅素（torularhodin）、γ-胡蘿卜素（γ-carotene）、β-胡蘿卜素（β-carotene）等4 種類(lèi)胡蘿卜素[18-19]. 因此，本研究擬從YM25235 菌株中克隆HMGCR基因RkHMGCR，并將其轉(zhuǎn)回YM25235菌株中進(jìn)行過(guò)表達(dá)，以提高YM25235 菌株產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的水平，為進(jìn)一步篩選類(lèi)胡蘿卜素高產(chǎn)菌株和工藝化生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的研究與應(yīng)用打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 質(zhì) 粒 和 菌 株紅 冬 孢 酵 母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235 菌株由云南大學(xué)微生物研究所李紹蘭研究員惠贈(zèng)，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 由本研究室保存，質(zhì)粒pMD-18T 購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，表達(dá)載體pRH2034 購(gòu)自新加坡民族大學(xué).

1.2 試劑和試劑盒DNA 純化回收試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司，酵母基因組DNA 和RNA 提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Thermo 公司，高保真DNA 聚合酶購(gòu)自南京諾維贊生物有限公司，高效液相所用試劑為色譜純，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.3 RkHMGCR 基因的克隆與序列分析根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的RkHMGCR基因的蛋白質(zhì)編碼序列設(shè)計(jì)并合成引物對(duì)：上游引物RkHMGCR-F：5′-TTCGGATCCTTATGGTCCTCTCGCCGTC-3′和下游引物RkHMGCR-R：5′-GCAGATATCTTACT CTTTGGCGAACCCG-3′（下劃線(xiàn)分別為BamH Ⅰ和EcoR Ⅴ位點(diǎn)），以提取自YM25235 菌株的總RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增. 擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、63 ℃退火30 s、72 ℃延伸4 min，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min. 擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與pMD-18T 載體連接，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR驗(yàn)證后，挑取陽(yáng)性克隆送出測(cè)序. 進(jìn)一步根據(jù)測(cè)序所得的目的序列，利用NCBI 網(wǎng)站的BLASTp 程序進(jìn)行同源序列比對(duì)，同時(shí)參考已報(bào)道的HMGCR 序列分析結(jié)果，利用NCBI 上Conserved Domain 程序進(jìn)行蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè).

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pRHRkHMGCR 的構(gòu) 建用BamH Ⅰ和EcoR Ⅴ對(duì)連接有基因RkHMGCR的pMD-18T 載體和表達(dá)載體pRH2034 進(jìn)行雙酶切，電泳回收目的片段后用T4 連接酶連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 中. 通過(guò)菌落PCR 和提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定來(lái)篩選陽(yáng)性克隆，然后進(jìn)一步將重組質(zhì)粒送出進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pRHRkHMGCR.

1.5 重 組 質(zhì) 粒pRHRkHMGCR 的 轉(zhuǎn) 化 與 篩 選將重組質(zhì)粒pRHRkHMGCR 通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法[20]轉(zhuǎn)入YM25235 中，通過(guò)含150 μg/mL 潮霉素B 的YPD固體培養(yǎng)基篩選得到抗性轉(zhuǎn)化子. 利用酵母基因組提取試劑盒提取抗性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，以此為模板通過(guò)PCR 進(jìn)行陽(yáng)性克隆驗(yàn)證獲得HMGCR基因轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子. 將PCR 驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆于50 mL YPD 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至192 h，離心收集菌體，冷凍干燥后磨成粉. 取0.4 g 干菌體使用丙酮進(jìn)行多次提取后，合并提取液. 然后參考文獻(xiàn)[21]的方法，利用紫外分光光度計(jì)在450 nm 處測(cè)定吸光度并計(jì)算總類(lèi)胡蘿卜素含量. 經(jīng)多次篩選后得到高產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化子，命名為YM25235/pRHRkHMGCR.

1.6 總類(lèi)胡蘿卜素及其組分質(zhì)量比變化分析以YM25235 菌株為對(duì)照，按上述方法分別提取YM25235 菌株和轉(zhuǎn)基因菌株YM25235/pRHRkHMGCR 的總類(lèi)胡蘿卜素，分析YM25235/pRHRkHMGCR 菌株中總類(lèi)胡蘿卜素的質(zhì)量比變化情況.進(jìn)一步通過(guò)高效液相色譜法（HPLC）對(duì)總類(lèi)胡蘿卜素的4 種主要成分的質(zhì)量比變化進(jìn)行檢測(cè)分析，HPLC 分析條件參照魏娜等[22]的方法，液相色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（?4.6 mm×250 mm，5 μm）.

1.8 脂肪酸含量的測(cè)定分析參考文獻(xiàn)[23]檢測(cè)YM25235 和YM25235/pRHRkHMGCR 菌株中脂肪酸的含量變化. 稱(chēng)取上述干菌粉0.1 g，加入2.5 mL 10% KOH 甲醇溶液和2.5 mL 0.6 mg/mL C17 內(nèi)標(biāo)物提取脂肪酸，并與70 ℃下皂化4.5 h. 然后用濃鹽酸將樣品的pH 調(diào)至2.0，加入4 mL 14%三氟化硼乙醚，繼續(xù)在70 ℃水浴1.5 h，使脂肪酸甲酯化.最后用正己烷萃取脂肪酸甲酯，并用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）進(jìn)行分析.

1.9 類(lèi)胡蘿卜素合成和油脂代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平分析取發(fā)酵培養(yǎng)96 h 的酵母細(xì)胞，提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以YM25235 菌株樣品作為對(duì)照，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)RkHMGCR基因過(guò)表達(dá)對(duì)類(lèi)胡蘿卜素合成和油脂代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化. 以小亞基rRNA（SSU rRNA）基因作為內(nèi)參，通過(guò) 2-△△CT法[24]分析不同基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析所用引物如表1 所示.

表1 YM25235 菌株中不同基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平分析所用的引物Tab. 1 Primers used for the analysis of mRNA levels in YM25235 strain

2 結(jié)果與分析

2.1 RkHMGCR 基 因 的 克 隆以 紅 冬 孢 酵 母YM25235 的 cDNA 為模板，通過(guò)PCR 擴(kuò)增，獲得一個(gè)大小約為4 000 bp 的片段（圖1），將其命名為RkHMGCR. 回收獲得該片段，進(jìn)一步將其連接到PMD-18T 載體上并送出測(cè)序. 測(cè)序結(jié)果顯示RkHMGCR基因片段長(zhǎng)為3 981 bp，編碼1 326 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為145.68 ku.

圖1 RkHMGCR 基因的PCR 擴(kuò)增Fig. 1 PCR Amplification of the gene RkHMGCR

2.2 序列的分析相似性搜索表明，RkHMGCR編碼的氨基酸序列（GenBank 登錄號(hào)：MW448479）與酵母來(lái)源的HMGCR 的氨基酸序列相似性最大，其中與圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）NP11 來(lái)源 RtHMGCR（GenBank 登錄號(hào)：XP_01627-0872）、紅法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）XdHMGCR 酶（GenBank 登錄號(hào)：CED85502）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288C 的ScHMGCR 酶（GeneBank 登錄號(hào)：NP_013636）的相似性分別為81.94%、35.63%和23.61%. 序列比對(duì)分析結(jié)果還表明，所編碼的氨基酸序列和已知的HMGCR 酶類(lèi)似，具有特異性的4 個(gè)氨基酸保守區(qū)[14,25]：2 個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)TTEGALVA（氨基酸位點(diǎn)為970～977）和ENVVGYMPLP（氨基酸位點(diǎn)為941～950），2 個(gè)NADP（H）結(jié)合位點(diǎn)DAMGMNMIS（氨基酸位點(diǎn)為1 065～1 073）和GTVGGGT（氨基酸位點(diǎn)1 214～1 220），以及4 個(gè)催化活性中心關(guān)鍵的氨基酸殘基 Glu、Lys、Asp、His（其氨基酸位點(diǎn)分別為 972、1 105、1 181、1 279）（圖2）. 此外，氨基酸序列比對(duì)分析也顯示，除了具有4 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和關(guān)鍵氨基酸殘基的氨基酸序列保守性高外，其余氨基酸序列在不同來(lái)源HMGCS 中變化較大（N 端序列長(zhǎng)，結(jié)果未提供），與已報(bào)道分析結(jié)果[13-14]一致. 這些結(jié)果表明所獲得的cDNA 序列是一個(gè)新的潛在HMGCR基因編碼序列.

圖2 RkHMGCR 與同源RkHMGCRs 氨基酸序列比對(duì)Fig. 2 Alignment of amino acid sequence of RkHMGCR and homologous HMGCRs

2.3 重組質(zhì)粒pRHRkHMGCR 的構(gòu)建首 先通過(guò)雙酶切連接將RkHMGCR從PMD18-T 切下并插入到表達(dá)載體pRH2034 的BamH Ⅰ和EcoR Ⅴ 位點(diǎn)之間構(gòu)建重組質(zhì)粒pRHRkHMGCR（圖3(a)）. 然后對(duì)其重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證分析，結(jié)果如圖3(b)所示，結(jié)果表明重組質(zhì)粒pRHRkHMGCR酶切產(chǎn)生4 kb 和10.7 kb 兩條帶（圖 3(b) 第 4 泳道），這兩個(gè)條帶分別與目的基因RkHMGCR擴(kuò)增片段（圖 3(b) 第 5 泳道）和空載體 pRH2034 雙酶切后（圖3(b) 第 3 泳道）的大小一致. 同時(shí)，測(cè)序結(jié)果也表明所獲得片段與目的序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pRHRkHMGCR 的構(gòu)建Fig. 3 Construction of recombination plasmid pRHRkHMGCR

2.4 過(guò)表達(dá)RkHMGCR 基因?qū)M25235 菌株總類(lèi)胡蘿卜素和各組分含量的影響總類(lèi)胡蘿卜素含量分析結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)菌株YM25235/pRHRkHMGCR 中的總類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量比為8.12 mg/g，相較于對(duì)照菌株YM25235（5.71 mg/g）提高了42.21%（表2）. 進(jìn)一步通過(guò)HPLC 分析總類(lèi)胡蘿卜素中4種不同組分含量變化，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)菌株YM25235/pRHRkHMGCR 中圓酵母素、紅酵母紅素、β-胡蘿卜素的均顯著提高，但γ-胡蘿卜素含量反而下降. 其中β-胡蘿卜素含量提高最為顯著，達(dá)4.58 mg/g DCW，占總類(lèi)胡蘿卜素含量的56.40%，相較于對(duì)照（48.86%）β-胡蘿卜素含量在總類(lèi)胡蘿卜素含量中明顯提高. 這些結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)RkHMGCR基因能顯著提高YM25235 菌株中總類(lèi)胡蘿卜素及β-胡蘿卜素含量.

表2 過(guò)表達(dá)RkHMGCR 基因?qū)M25235 菌株中類(lèi)總胡蘿卜素質(zhì)量比及其組分質(zhì)量比的影響Tab. 2 Effect of RkHMGCR overexpression on the content of total carotenoid and its compositions in YM25235

2.5 過(guò)表達(dá)RkHMGCR 基因?qū)M25235 菌株油脂積累的影響類(lèi)胡蘿卜素合成與油脂合成都是以乙酰CoA 作為共同前體. 在本研究中，過(guò)表達(dá)RkHMGCR基因提高了YM25235 中類(lèi)胡蘿卜素的質(zhì)量比，在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步測(cè)定對(duì)照菌株YM25235 和過(guò)表達(dá)菌株YM25235/pRHRkHMGCR的油脂質(zhì)量比. 結(jié)果如表3 所示，過(guò)表達(dá)菌株YM25235/pRHRkHMGCR 中油脂質(zhì)量比約為3.44%，較對(duì)照菌株YM25235（4.84% DCW）降低了28.93%.表明過(guò)表達(dá)RkHMGCR基因會(huì)減少YM25235 中油脂的積累.

表3 RkHMGCR 基因過(guò)表達(dá)對(duì)YM25235 菌株油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Tab. 3 Effect of RkHMGCR overexpression on the lipid content in YM25235

2.6 過(guò)表達(dá)RkHMGCR 基因?qū)M25235 菌株脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響為探究過(guò)表達(dá)RkHMGCR基因?qū)M25235 中脂肪酸含量的影響，我們提取對(duì)照菌株YM25235 和過(guò)表達(dá)菌株YM25235/pRHRkHMGCR 的總脂肪酸并進(jìn)行GC-MS 分析. 結(jié)果如表4 所示，過(guò)表達(dá)菌株YM25235/pRHRkHMGCR中總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降約20.31%，其中棕櫚酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）和亞油酸（oleic acid，OA，C18∶1）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有下降，而多不飽和脂肪酸亞油酸（linoleic acid，LA，C18∶2）和α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA，C18∶3）的含量卻有所增加.該結(jié)果表明，RkHMGCR基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)YM25235中脂肪酸的降解，可能提供了更多的乙酰CoA 進(jìn)入類(lèi)胡蘿卜素合成途徑，促進(jìn)類(lèi)胡蘿卜素合成，同時(shí)上述油脂累積的降低也證明了這一觀(guān)點(diǎn).

表4 RkHMGCR 基因過(guò)表達(dá)對(duì)YM25235 菌株脂肪酸組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Tab. 4 Effect of RkHMGCR overexpression on the content of fatty acid compositions in YM25235

2.7 過(guò)表達(dá)RkHMGCR 基因?qū)M25235 菌株類(lèi)胡蘿卜素合成和油脂代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響為進(jìn)一步探究過(guò)表達(dá)RkHMGCR基因促進(jìn)YM25235 類(lèi)胡蘿卜素合成的調(diào)節(jié)機(jī)制，我們分析了類(lèi)胡蘿卜素合成和油脂代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化. 結(jié)果如圖4 所示，過(guò)表達(dá)RkHMGCR基因能促進(jìn)MVA 途徑中基因RkAcat2、RkHMGCS、自身RkHMGCR轉(zhuǎn)錄水平的明顯提高，分別為對(duì)照的1.76、1.58 和4.14 倍，而類(lèi)胡蘿卜素合成途徑中基因RkCrtYB、RkCrtI的轉(zhuǎn)錄水平略有提高，但不顯著. 此外，與油脂合成相關(guān)基因RkFAS1和RkACCS轉(zhuǎn)錄水平分別下降了59.31%和40.23%，而與脂肪酸β-氧化相關(guān)基因RkACOX2轉(zhuǎn)錄水平則也有顯著提高，達(dá)2.18 倍. 這些結(jié)果與類(lèi)胡蘿卜素的合成水平和油脂含量的積累趨勢(shì)一致，只是不同基因轉(zhuǎn)錄水平的變化有所差異.

圖4 RkHMGCR 基因過(guò)表達(dá)對(duì)YM25235 菌株中類(lèi)胡蘿卜素合成和油脂代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 4 Effect of RkHMGCR overexpression on the transcription levels of genes involved with carotenoid biosynthesis and lipid metabolism

3 討論

HMGCR 廣泛存在真核生物、原核生物和古細(xì)菌中，是一種高度保守的膜結(jié)合酶[9]. 氨基酸序列相似性搜索結(jié)果顯示，紅冬孢酵母RkHMGCR 與酵母來(lái)源的HMGCR 具有最大的同源性. 氨基酸序列分析結(jié)果也顯示，紅冬孢酵母RkHMGCR 同樣具有HMGCR 保守的2 個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)ENVVGYMPLP 和TTEGALVA、2 個(gè)NADP（H）結(jié)合位點(diǎn)DAMGMNMIS 和GTVGGGT，以及4 個(gè)催化活性中心關(guān)鍵的氨基酸殘基 Glu、Lys、Asp、His，而且序列比對(duì)分析結(jié)果還顯示，所分析的4 種HMGCR的C 端氨基酸序列同源性雖然高于N 端，但是總體同源性均很低，這些均與之前的研究結(jié)果一致[13-14]. 這些結(jié)果表明，我們獲得的RkHMGCR基因是一個(gè)新的潛在的HMGCR基因.

由于HMGCR 在MVA 途徑以及包括類(lèi)胡蘿卜素等異戊二烯衍生物合成中的重要調(diào)節(jié)作用，可以推測(cè)出提高HMGCR 的表達(dá)水平可顯著提高類(lèi)胡蘿卜素等異戊二烯衍生物的合成水平. 這在許多通過(guò)代謝工程手段將HMGCR基因過(guò)表達(dá)提高宿主細(xì)胞中類(lèi)胡蘿卜素的合成的研究中獲得證實(shí)，比如，Yan 等[8]通過(guò)產(chǎn)β-胡蘿卜素的重組釀酒酵母工程菌株中過(guò)表達(dá)HMGCR基因，β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了35.1%，如果同時(shí)抑制麥角固醇合成則提高了106.8%. 還有一些研究將截短的外源HMGCR基因在不同重組酵母宿主中過(guò)表達(dá)，都能顯著提高目的類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)量[26-28]. 本研究將RkHMGCR基因轉(zhuǎn)化回YM25235 菌株中進(jìn)行過(guò)表達(dá)分析，與上述報(bào)道類(lèi)似，RkHMGCR基因過(guò)表達(dá)顯著提高了YM25235 菌株中類(lèi)胡蘿卜素的合成水平，相較于對(duì)照提高了42.21%，其合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平分析也證明了這一點(diǎn). 相較于類(lèi)似的研究[27-28]，RkHMGCR基因過(guò)表達(dá)的YM25235 菌株類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量的增加不是最高，這可能是培養(yǎng)條件和表達(dá)系統(tǒng)存在差異的原因，并且細(xì)胞內(nèi)甲羥戊酸供應(yīng)的瓶頸不僅僅是HMGCR 催化的反應(yīng)，還涉及AcaT和HMGCS 的催化作用[29]. 然而，本研究結(jié)果證明了提高M(jìn)VA 途徑限速酶HMGCR 的表達(dá)水平可顯著提高類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)量.

紅法夫酵母類(lèi)胡蘿卜素合成調(diào)節(jié)機(jī)制的研究表明，葡萄糖不足或饑餓條件下菌株中類(lèi)胡蘿卜素合成與氧化脅迫有關(guān)，還涉及脂代謝和糖代謝等生物學(xué)過(guò)程[30-31]. 乙酰CoA 是油脂（脂肪酸）和類(lèi)胡蘿卜素合成的共同前體，有研究表明，粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）在葡萄糖不足或饑餓條件下通過(guò)選擇性降解棕櫚酸和油酸，產(chǎn)生乙酰CoA 促進(jìn)類(lèi)胡蘿卜素的合成，導(dǎo)致油脂累積減少[32-33]. 我們前期的研究也顯示，葡萄糖饑餓條件下YM-25235 菌株中油脂累積水平明顯下降（結(jié)果未發(fā)表），而過(guò)表達(dá)RkHMGCR基因脂肪酸含量也明顯下降（表3 和表4），導(dǎo)致油脂累積下降更加明顯與脂肪酸降解相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加也證明這一點(diǎn). 而且，RkHMGCR基因過(guò)表達(dá)的YM25235菌株中類(lèi)胡蘿卜素合成增加的底物乙酰CoA 可能主要來(lái)自棕櫚酸和硬脂酸的降解，而油酸含量下降可能是由于其進(jìn)一步脫飽和形成亞油酸和α-亞麻酸所致，多不飽和脂肪增加的具體原因還有待于進(jìn)一步研究.

由于類(lèi)胡蘿卜素良好的生物活性和生理功能，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、營(yíng)養(yǎng)保健等行業(yè)，促進(jìn)了人類(lèi)對(duì)其需求. 目前，商業(yè)化的類(lèi)胡蘿卜素來(lái)源主要通過(guò)化學(xué)合成獲得，少量從植物提取和微生物發(fā)酵生產(chǎn)的天然類(lèi)胡蘿卜素，雖然具有類(lèi)似的分子結(jié)構(gòu)，但天然類(lèi)胡蘿卜素更有利于健康[1]. 通過(guò)傳統(tǒng)微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素顯示出巨大潛力，成本低、生產(chǎn)過(guò)程易于處理、產(chǎn)品安全而且環(huán)保[34]. 但是，目前由于成本效益、產(chǎn)量和分離提取等方面的限制，工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)方面仍缺乏相應(yīng)的策略[35]. 近年來(lái)，結(jié)合經(jīng)典遺傳學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法以及發(fā)酵工藝技術(shù)，優(yōu)化菌株原有的代謝途徑和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)或者組裝異源代謝途徑使微生物高效益、低成本生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的代謝工程提供了一種有希望的替代途徑[15]. 因此，本研究為進(jìn)一步篩選類(lèi)胡蘿卜素高產(chǎn)菌株和工藝化生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的研究與應(yīng)用打下基礎(chǔ)，也為利用產(chǎn)油紅酵母進(jìn)行相關(guān)的代謝工程研究提供參考. 目前，這方面的研究鮮有報(bào)道.