梁子豪，高雅楠，史麗云

南京中醫(yī)藥大學醫(yī)學院整合醫(yī)學學院，南京210000

肝內膽管癌是繼肝細胞癌之后第二常見的原發(fā)性肝惡性腫瘤，在中國的發(fā)病率較高，且在亞洲范圍內發(fā)病率呈上升趨勢［1］。因其早期發(fā)現(xiàn)困難，大部分患者發(fā)現(xiàn)后已處于中晚期［2］，患者接受手術治療后五年生存率不到20%，即使切除充分，仍有超過50%的患者在切除后的第1年或第2年出現(xiàn)腫瘤復發(fā)［3］。所以，化療仍然是重要的治療手段，可以有效改善術后生存時間，提高患者的生存質量。目前，肝內膽管癌一線的化療藥以吉西他濱為主，但臨床發(fā)現(xiàn)有部分患者接受治療后出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象［4］，目前肝內膽管癌吉西他濱耐藥的機制仍未明確。我們利用公共數據庫中的數據信息，采用生物信息學技術篩選出肝內膽管癌吉西他濱耐藥基因，分析了吉西他濱耐藥基因的生物學功能及相關信號通路；并探討了關鍵耐藥基因（MCC值排名前十）與肝內膽管癌預后的關系，為探討肝內膽管癌耐吉西他濱的機制提供新的線索，也為臨床聯(lián)合用藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數據來源從NCBI的GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）［5］獲得了肝內膽管癌耐藥基因表達數據，其中MT-CHC01_rep1、MTCHC01_rep2為肝內膽管癌吉西他濱敏感株、MTCHC01R1.5_rep1、MT-CHC01R1.5_rep2為 肝 內 膽管癌吉西他濱耐藥株。檢測平臺為GPL6480。

1.2 肝內膽管癌吉西他濱耐藥基因的篩選利用在線網絡工具GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GEO2R/）篩選吉西他濱耐藥和吉西他濱敏感的肝內膽管癌細胞系間差異表達基因（DEGs，肝內膽管癌吉西他濱耐藥基因，簡寫為吉西他濱耐藥基因）。以P值＜0.05，|log（Foldchange）|＞2獲取差異表達基因，log（Foldchange）＞2為顯著性上調基因，log（Fold change）＜2為顯著性下調基因。

1.3 吉西他濱耐藥基因生物學功能及信號通路分析通過DAIVD數據庫對吉西他濱耐藥基因進行GO和KEGG功能富集分析。GO分析中包括細胞成分（CC）、生物過程（BP）和分子功能（MF）項［6］，P值＜0.05為有統(tǒng)計學意義，繪制條形圖及氣泡圖。

1.4 吉西他濱耐藥基因中的關鍵基因篩選及與肝內膽管癌發(fā)生、預后的關系使用STRING數據庫對差異化基因進行分析同時構建蛋白質—蛋白質互作網絡圖，同時運用Cytoscape軟件中的cytohubba插件來篩選關鍵基因［7］。篩選條件為MCC值排名前十。

通過GEPIA箱形圖分析研究了36個膽管癌組織樣品和9個正常組織樣品中關鍵基因的表達水平。以P值＜0.05為有顯著性差異?；赥CGA-COAD（The Cancer Genome Atlas-colon adenocarcinoma）和TCGA-READ（The Cancer Genome Atlas-rectum ade?nocarcinoma）數據集、利用GEPIA工具分析關鍵基因與肝內膽管癌預后的關系。篩選標準：Group Cut?off：Median，Cutoff-High（%）：50，Cutoff-Low（%）：50。

2 結果

2.1 肝內膽管癌吉西他濱耐藥基因共鑒定出肝內膽管癌吉西他濱耐藥基因589個，上調314個，下調275個?；鹕綀D見圖1。

圖1 耐藥基因火山圖

2.2 吉西他濱耐藥基因的生物學功能上調吉西他濱耐藥基因富集于BP 40條，CC 34條，MF 36條。下調吉西他濱耐藥基因富集于BP 24條，CC 17條，MF 16條。在生物學過程中，上調吉西他濱耐藥基因主要參與DNA復制、修復，以及細胞有絲分裂等過程；富集于細胞核中；影響組蛋白結合、蛋白結合、DNA結合、蛋白質二聚體結合和染色質結合等生物學功能。下調吉西他濱耐藥基因則主要參與血管生成、低氧應答、線粒體自噬、自噬體組裝和骨骼肌細胞分化過程；主要分布在外泌體，細胞質和細胞外空隙；影響血紅素結合、電壓門控離子通道、肝素結合、氧化還原酶和類固醇激素受體活性等生物學功能。在KEGG富集分析中，上調吉西他濱耐藥基因主要富集在DNA復制、細胞周期、嘌呤嘧啶代謝、錯配修復、核苷酸切除修復、堿基切除修復和酪氨酸代謝相關通路；下調吉西他濱耐藥基因則主要富集于谷氨酸能、γ-氨基丁酸能通路和Rap1信號通路。

2.3 關鍵基因及其與肝內膽管癌發(fā)生、預后的關系上調吉西他濱耐藥基因中的關鍵基因為MCM3、細胞分裂蛋白45（（CDC45）、微小染色體維持蛋白2（MCM2）、CDC6、MCM4、FEN1、微小染色體維持蛋白6（MCM6）、PCNA、EXO1和WDHD1。相比正常組織，腫瘤組織中的MCM2，MCM6，CDC45均高表達（P均＜0.05），而ATF3無統(tǒng)計學意義。

下調吉西他濱耐藥基因中的關鍵基因為VEG?FA、FOS、EGR1、DUSP1、ITGB1、ATF3、GABARA?PL1、FOSB、MAP1LC3A、ULK1。其中上調的關鍵基因中的CDC45、MCM2、MCM6高表達的肝內膽管癌患者生存率低，下調基因中ATF3高表達的肝內膽管癌患者生存率較高，見圖2。

圖2 不同關鍵基因表達的肝內膽管癌預后生存曲線

3 討論

目前，美國國家綜合癌癥網絡推薦吉西他濱、順鉑、氟尿嘧啶作為膽管癌的臨床化療方案，然而吉西他濱的耐藥問題，是導致治療失敗的關鍵因素。吉西他濱進入人體代謝為吉西他濱二磷酸鹽和吉西他濱三磷酸鹽［8］。其中吉西他濱二磷酸鹽通過抑制核糖核酸還原酶，減少DNA合成原料三磷酸脫氧核苷產生，從而抑制DNA的合成；吉西他濱三磷酸鹽則與脫氧三磷酸胞苷競爭結合到DNA鏈上，同時吉西他濱二磷酸鹽可以發(fā)揮協(xié)同作用，促進吉西他濱三磷酸鹽與DNA的結合，抑制DNA進一步合成，最終導致細胞凋亡［9］。

我們通過生物信息學方法發(fā)現(xiàn)吉西他濱耐藥株相較于敏感株，有589個差異基因，其中上調基因314個、下調基因275個。富集分析發(fā)現(xiàn)上調基因主要參與DNA復制、修復，細胞有絲分裂等過程。下調基因主要參與血管生成、低氧應答、線粒體自噬、自噬體組裝等過程，目前的研究表明抑制自噬可以導致腫瘤對多種化學藥物的敏感性，降低化療對于腫瘤的作用［10］。提示吉西他濱耐藥株可能通過上調DNA修復與復制相關基因，下調自噬相關基因，從而降低腫瘤細胞對吉西他濱的敏感性。

在差異基因中進一步篩選出關鍵基因MCM2、MCM6、CDC45和ATF3，發(fā)現(xiàn)其在肝內膽管癌的吉西他濱耐藥和患者生存情況中發(fā)揮重要作用。MCM2和MCM6是MCM家族成員，MCM2-7可以相互作用形成功能性DNA解旋酶，觸發(fā)DNA合成的初始步驟［11］，促進細胞的復制。無限復制是腫瘤細胞的特征之一，MCM蛋白被認為與癌癥發(fā)展密切相關，可以作為多種腫瘤的標志物，同時也被認為與腫瘤的預后相關［12］。目前在多種腫瘤組織和癌癥細胞中檢測到MCM家族蛋白高表達［13-14］。MCM2-7復合物被激活時，CDC45會被招募到MCM2-7復合物的尾部，激活其解旋酶活性，從而促進DNA的復制。過量的MCM家族蛋白表達被認為可以對DNA復制的穩(wěn)定性起到保護作用［15］。而CDC45的突變會顯著降低MCM復合物的解旋酶活性［16］。

化療作為臨床治療腫瘤的主要手段，主要通過誘導DNA損傷及復制來抑制腫瘤細胞的增殖。MCM2、MCM6和CDC45可 能 是 通 過 形 成CDC45-MCM-GINS（CMG）復合物從而促進DNA的復制與修復，導致腫瘤細胞對吉西他濱耐藥。在臨床研究中也發(fā)現(xiàn)MCM家族蛋白高表達會導致腫瘤對多種化療藥物產生耐藥性，抑制MCM2可以降低腫瘤細胞對于順鉑的耐藥性［17］。而通過抑制MCM4和MCM7引起MCM復合物抑制也可以增強胰腺導管癌對5-氟尿嘧啶和吉西他濱的敏感性［18］。

核糖核苷酸還原酶（RR）在維持脫氧核糖核苷酸庫中發(fā)揮重要作用。下調RR減少吉西他濱與脫氧胞苷之間的競爭，從而增強了吉西他濱的作用。因此可通過抑制RR亞基M1（RRM1）來增強吉西他濱的作用，該基因的上調會導致吉西他濱耐藥［19］。這與我們發(fā)現(xiàn)吉西他濱耐藥株中RRM1明顯上升的結果相一致。研究發(fā)現(xiàn)MCM2-7復合物可以調控RRM1的表達，這可能也是MCM2和MCM6引起吉西他濱耐藥的原因。

臨床研究表明，二甲雙胍可以選擇性抑制MCM2從而增強腫瘤細胞化療的敏感性［20］；此外上皮間質轉化（EMT）被認為是吉西他濱耐藥的關鍵原因之一，有研究表明MCM2-7復合物的形成可以顯著促進EMT的發(fā)生［21］。二甲雙胍和吉西他濱聯(lián)合使用則可以抑制EMT的發(fā)生，增強腫瘤細胞對吉西他濱的敏感性［22］。中藥組分大黃素可以通過抑制腫瘤細胞EMT同時增強腫瘤對于吉西他濱的敏感性，增強吉西他濱的效果［23-24］，這可能是通過抑制MCM復合物誘導的RRM1表達引起的。

下調基因ATF3是ATF/環(huán)AMP反應元件結合（ATF/CREB）轉錄因子家族的成員，可以被缺氧、DNA損傷等多種應激因素激活，參與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移等過程。近年發(fā)現(xiàn)ATF3在多種腫瘤中可以起到影響化療藥物敏感性的作用。HASIM等［25］發(fā)現(xiàn)使用ATF3誘導劑可以顯著增強阿霉素對于乳腺癌細胞的毒性作用、提高乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性。此外吉西他濱可以通過促進活性氧產生，引起腫瘤細胞死亡。為了減輕ROS誘導的氧化應激，腫瘤細胞上調轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2），催化谷胱甘肽（GSH）生成，引發(fā)對吉西他濱的耐藥［26］。ATF3可以通過調節(jié)Hippo-TAZ pathway通路，抑制Nrf2-Keap1的保護作用，從而促進腫瘤對化療藥物的敏感性［27-28］。

綜上所述，本研究通過生物信息學技術分析肝內膽管癌耐藥株差異基因，發(fā)現(xiàn)其主要通過上調DNA復制及修復相關基因，抑制自噬相關基因，引起肝內膽管癌對吉西他濱耐藥。進一步篩選出其中關鍵基因，發(fā)現(xiàn)上調基因中的關鍵基因為MCM3、CDC45、MCM2、CDC6、MCM4、FEN1、MCM6、PCNA、EXO1和WDHD1。下調基因中的關鍵基因為VEG?FA、FOS、EGR1、DUSP1、ITGB1、ATF3、GABARA?PL1、FOSB、MAP1LC3A、ULK1。我們發(fā)現(xiàn)MCM2、MCM6、CDC45在腫瘤組織中高表達，其中MCM2、MCM6、CDC45高表達肝內膽管癌患者生存率低，而ATF3高表達的患者生存率高。提示MCM2、MCM6、CDC45可能在肝內膽管癌的發(fā)生及發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。但基于生物信息學自身局限性，結論仍有待于進一步的實驗驗證。