譚 海，顧 陽(yáng)，盧南巡，常景玲，2，李志剛，2*

（1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003）

異亮氨酸在1904年從甜菜漿中分離得到，由于化學(xué)結(jié)構(gòu)與亮氨酸相似，理化性質(zhì)不同，被命名為異亮氨酸。異亮氨酸具有四種光學(xué)異構(gòu)體，但是在自然界中僅存在L-異亮氨酸[1]。L-異亮氨酸是人體必需氨基酸，是三種分支氨基酸之一，作為生物活性分子參與營(yíng)養(yǎng)代謝和物質(zhì)合成，在食品、醫(yī)藥和飼料等方面的廣泛應(yīng)用[2]。早期L-異亮氨酸主要通過化學(xué)合成法生產(chǎn)[3]，但是，化學(xué)合成法產(chǎn)量低，合成過程使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿以及有機(jī)溶劑造成環(huán)境污染，漸漸淡出人們的視線，微生物發(fā)酵法受到廣泛關(guān)注。

目前，用于L-異亮氨酸生產(chǎn)的菌株主要包括黃色短桿菌（Brevibacterium flavum）、大腸桿菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在發(fā)酵過程中會(huì)合成內(nèi)毒素[4]，產(chǎn)物的分離純化技術(shù)要求高，生產(chǎn)成本居高不下，工業(yè)化生產(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)；黃色短桿菌在代謝工程改造方面的研究相對(duì)較少，隨著對(duì)谷氨酸棒桿菌認(rèn)識(shí)的不斷深入，發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌更適合用于生產(chǎn)L-異亮氨酸。谷氨酸棒桿菌是公認(rèn)的安全（generally recognized as safe，GRAS）菌株，廣泛應(yīng)用于氨基酸和核苷酸的工業(yè)化生產(chǎn)中[5]。L-異亮氨酸的生物合成途徑冗長(zhǎng)且具有復(fù)雜精密的自我調(diào)節(jié)機(jī)制，通過隨機(jī)誘變可以獲得產(chǎn)量相對(duì)較高的突變菌株[6]，但其遺傳背景不明且很難通過誘變進(jìn)一步提高產(chǎn)量。因此，通過代謝工程改造谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)L-異亮氨酸越來越引起重視。2007年，YUKAWA H等[7]對(duì)谷氨酸棒桿菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，為谷氨酸棒桿菌代謝途徑的理論研究奠定了基礎(chǔ)。隨著對(duì)L-異亮氨酸代謝途徑、關(guān)鍵酶調(diào)控以及菌種選育等方面研究的不斷深入和基因工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，代謝工程逐漸替代經(jīng)典的隨機(jī)突變成為菌種改造的主要方法[8]。

在谷氨酸棒桿菌中，L-異亮氨酸生物合成途徑冗長(zhǎng)，分支途徑較多，生物體自身調(diào)節(jié)機(jī)制精密復(fù)雜，導(dǎo)致主代謝流較弱，副產(chǎn)物大量產(chǎn)生，代謝調(diào)控較為困難。丙酮酸和α-酮基丁酸是L-異亮氨酸代謝途徑中兩個(gè)重要的節(jié)點(diǎn)，圍繞這兩個(gè)節(jié)點(diǎn)對(duì)相關(guān)酶編碼基因進(jìn)行編輯，能夠有效的調(diào)節(jié)代謝流分配，強(qiáng)化主路代謝流強(qiáng)度，減少副產(chǎn)物合成。另外，嚴(yán)重的反饋抑制、氨基酸分泌能力不足、輔因子再生能力較弱等也嚴(yán)重制約著產(chǎn)物合成能力的提高。本文綜述了近年來代謝工程改造谷氨酸棒桿菌促進(jìn)L-異亮氨酸生物合成的相關(guān)研究，主要涉及代謝通量調(diào)控、解除反饋抑制、調(diào)節(jié)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）水平以及提高產(chǎn)物分泌能力等方面，對(duì)進(jìn)一步改造菌株和促進(jìn)L-異亮氨酸發(fā)酵合成具有一定的參考意義。

1 圍繞L-異亮氨酸合成途徑關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的代謝工程改造

在谷氨酸棒桿菌中，丙酮酸是新陳代謝中心的開關(guān)點(diǎn)。在糖酵解途徑（embden meyerhof pathway，EMP）通路和各種氨基酸代謝通路之間起著高度連接的樞紐作用，是合成代謝的基石。在L-異亮氨酸代謝途徑中（見圖1），丙酮酸主要存在4條去路：①在乙酰羥酸合酶（acetohydroxy acid synthase，AHAS）催化下，與α-酮基丁酸縮合形成α-乙酰-α-羥基丁酸，進(jìn)而在乙酰羥酸還原異構(gòu)酶（acetohydroxyacid isomerore ductase，AHAIR）、二羥酸脫水酶（dihydroxy acid dehydratase，DADH）、轉(zhuǎn)氨酶（transaminase，TA）等酶的作用下形成L-異亮氨酸；②在AHAS催化下，兩分子丙酮酸縮合形成α-乙酰乳酸，同樣在AHAIR、DADH、TA等酶的作用下合成L-纈氨酸和L-亮氨酸；③由基因pqo編碼的丙酮酸氧化還原酶催化產(chǎn)生乙酸鹽；④經(jīng)基因alaT編碼的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化形成丙氨酸。副產(chǎn)物的生成造成碳代謝流損失，降低L-異亮氨酸的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量。因此，在丙酮酸節(jié)點(diǎn)處，通過基因工程手段弱化副產(chǎn)物的合成途徑或提高碳代謝流在L-異亮氨酸合成途徑中的分配，能夠有效促進(jìn)L-異亮氨酸的合成[3]。

圖1 L-異亮氨酸生物合成示意圖Fig.1 Schematic diagram for L-isoleucine biosynthesis

L-纈氨酸和L-亮氨酸作為主要副產(chǎn)物，生物合成時(shí)與L-異亮氨酸共用一套酶系，弱化這些酶的編碼基因表達(dá)或抑制酶活性，同時(shí)會(huì)影響L-異亮氨酸的合成[9]。研究表明，AHAS酶對(duì)α-酮基丁酸的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于丙酮酸[10]，這一特點(diǎn)為進(jìn)一步提高產(chǎn)物合成提供依據(jù)。強(qiáng)化α-酮基丁酸合成途徑，能夠使更多丙酮酸用于L-異亮氨酸的合成，降低副產(chǎn)物氨基酸的積累。徐慶陽(yáng)等[11]通過過表達(dá)高絲氨酸脫氫酶基因thrA，增強(qiáng)α-酮基丁酸的合成，副產(chǎn)物賴氨酸積累量較出發(fā)菌株減少63.8%，L-異亮氨酸產(chǎn)量提高7.0%，達(dá)到36.5 g/L。PáTEK M等[12]從大腸桿菌（Escherichia coli）K12中成功擴(kuò)增出thrABC基因（蘇氨酸操縱子），并在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)。WANG J等[13]研究表明，在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)來自大腸桿菌的thrABC基因，促進(jìn)α-酮基丁酸合成，經(jīng)搖瓶發(fā)酵，L-異亮氨酸的產(chǎn)量提高5.3%，達(dá)到14.1 g/L。此外，提高蘇氨酸脫水酶代謝活性也是增強(qiáng)α-酮基丁酸合成的有效方法。DONG X等[14]在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)蘇氨酸脫水酶基因，利用該菌株進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，L-蘇氨酸完全耗盡，L-賴氨酸碳代謝通量降低83.0%，L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到3.5 g/L，與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量具有明顯提升。史建明等[15]在谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）YILW中過表達(dá)蘇氨酸脫水酶，使耗糖高峰期滯后，L-異亮氨酸合成途徑的代謝流提高8.5%，產(chǎn)量增加10.3%，達(dá)到32.0 g/L。

此外，減少乙酸和丙氨酸等副產(chǎn)物合成，也有利于產(chǎn)物的積累。研究發(fā)現(xiàn)，敲除alaT基因可以減少L-丙氨酸的合成，改變碳代謝流向，使更多的丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸進(jìn)入蘇氨酸合成途徑，進(jìn)一步合成為L(zhǎng)-異亮氨酸[13]。EIKMANNS B J等[16]通過敲除pqo基因使發(fā)酵過程中幾乎沒有乙酸的合成，導(dǎo)致丙酮酸的積累，促進(jìn)三種分支氨基酸的合成。朱福周等[17]在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)pyc基因，提高丙酮酸羧化酶的表達(dá)量，使丙酮酸直接合成草酰乙酸，L-異亮氨酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高11.7%，達(dá)到24.8 g/L。

2 代謝工程改造解除反饋抑制促進(jìn)L-異亮氨酸合成

谷氨酸棒桿菌合成L-異亮氨酸代謝途徑中存在嚴(yán)重的反饋抑制現(xiàn)象[3]。當(dāng)L-異亮氨酸過量積累時(shí)，會(huì)抑制蘇氨酸脫水酶、乙酰羥酸合酶的活性[18-20]；而L-蘇氨酸積累時(shí)，會(huì)抑制高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶以及天冬氨酸激酶的活性，使α-酮基丁酸合成受阻，進(jìn)而影響L-異亮氨酸的合成。通過代謝工程手段，解除反饋抑制，是促進(jìn)L-異亮氨酸的代謝合成的有效方法[21]。

2.1 針對(duì)解除L-異亮氨酸反饋抑制的代謝工程改造

蘇氨酸脫水酶是L-異亮氨酸合成過程中的限速酶[3]，受到L-異亮氨酸反饋抑制，通過定點(diǎn)突變對(duì)該酶進(jìn)行改造，緩解或解除反饋抑制有利于產(chǎn)物積累。GUO Y等[18]通過定點(diǎn)誘變技術(shù)在蘇氨酸脫水酶中分別引入V140M、F383A和V140M-F383A三個(gè)不同突變位點(diǎn)，酶的活性均得到明顯提高，在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)上述三種突變型酶蛋白，L-異亮氨酸產(chǎn)量分別達(dá)到0.5 g/L、0.6 g/L、0.7 g/L，比出發(fā)菌株分別提高17.1%、34.0%和55.3%。YIN L等[19]對(duì)具有抗反饋抑制特性蘇氨酸脫水酶的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)突變后的蘇氨酸脫水酶中只有一個(gè)氨基酸被取代（Phe383Val），而酶的活性大大提高，表達(dá)菌株發(fā)酵產(chǎn)物比出發(fā)菌株提高33.9%。

乙酰羥酸合酶（AHAS）以二磷酸硫胺素為輔酶，催化兩分子丙酮酸縮合成乙酰羥酸，進(jìn)而合成L-亮氨酸和L-纈氨酸；也可以催化丙酮酸與α-酮基丁酸反應(yīng)生成α-乙酰-α-羥丁酸，進(jìn)而合成L-異亮氨酸[21-22]。AHAS是由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成的四聚體[10]，大亞基負(fù)責(zé)酶的催化功能，小亞基負(fù)責(zé)酶的調(diào)節(jié)功能。L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸均能與AHAS的調(diào)節(jié)位點(diǎn)結(jié)合，引起酶構(gòu)象發(fā)生變化，從而抑制AHAS活性[3]。最近，LU J等[23]通過定點(diǎn)誘變技術(shù)，對(duì)AHAS調(diào)節(jié)亞基上的一些位點(diǎn)（N11S、T34I、A36V、T104S、N11F、G14E和N29H）進(jìn)行定點(diǎn)誘變處理，獲得AHAS突變體對(duì)L-異亮氨酸敏感性顯著下降。YIN L等[19]在C.glutamicumJHI3-156中共表達(dá)具有抗反饋抑制特性的蘇氨酸脫水酶和乙酰羥酸合酶的基因，L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到30.7 g/L。GUO Y等[24]對(duì)不同氨基酸生產(chǎn)菌株的AHAS進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AHAS抗反饋抑制能力越強(qiáng)，菌株發(fā)酵氨基酸的產(chǎn)量也越高。

2.2 針對(duì)解除L-蘇氨酸反饋抑制的代謝工程改造

L-蘇氨酸是L-異亮氨酸合成途徑中重要的中間代謝物，對(duì)高絲氨酸脫氫酶（HD）、高絲氨酸激酶（HK）和天冬氨酸激酶（AK）等具有較強(qiáng)的抑制作用，通過代謝工程手段解除或緩解反饋抑制，有利于產(chǎn)物的合成[25-26]。REINSCHEID D J等[27]通過分析一株對(duì)L-蘇氨酸具有抗性突變株的hom基因，發(fā)現(xiàn)高絲氨酸脫氫酶中存在G378E突變，并指出此差異可能是解除反饋抑制的關(guān)鍵。進(jìn)一步研究表明，氨基酸替換使該位點(diǎn)與L-蘇氨酸間的范德華力喪失，導(dǎo)致HD對(duì)L-蘇氨酸的親和力變?nèi)?，緩解?duì)HD的反饋抑制。徐德雨等[28]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型谷氨酸棒桿菌相比，髙產(chǎn)菌株的AK存在G359D突變，使L-蘇氨酸與L-賴氨酸的協(xié)同反饋抑制得到有效緩解，10 mol/LL-蘇氨酸和L-賴氨酸同時(shí)存在的條件下，AK活性仍保留76.9%，而野生型菌株的AK酶活僅保留4.4%。YOSHIDA A等[29]利用定點(diǎn)突變技術(shù)，獲得AK的G277A突變體，導(dǎo)致L-蘇氨酸與AK調(diào)節(jié)亞基結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生變化，二者無法結(jié)合形成二聚體，解除對(duì)AK的反饋抑制。CHEN Z等[30]利用定點(diǎn)誘變技術(shù)獲得14株AK突變菌株，經(jīng)驗(yàn)證這些突變菌株對(duì)L-蘇氨酸均具有一定抗性。PETIT C等[31]通過定點(diǎn)誘變技術(shù)對(duì)HK進(jìn)行處理，獲得一株突變體CglThrB-A20G，該突變株保留野生型菌株酶的活性，L-蘇氨酸與ThrB-A20G位點(diǎn)之間的范德華力喪失，從而解除L-蘇氨酸對(duì)HK的反饋抑制。

3 代謝工程改造提高胞內(nèi)NADPH水平促進(jìn)產(chǎn)物合成

輔因子在細(xì)胞新陳代謝過程中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用，對(duì)某些代謝產(chǎn)物的生物合成具有重要意義[32]。通過調(diào)節(jié)輔因子再生速率及比例，能夠改變代謝流分配和物質(zhì)合成。在谷氨酸棒桿菌中，NADPH是L-異亮氨酸合成途徑中ASD、HD、AHAIR、TA等諸多酶的輔酶，還是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平的重要物質(zhì)[33-34]。NADPH水平調(diào)節(jié)是影響L-異亮氨酸合成的重要因素[35]。

NADPH主要通過兩種途徑產(chǎn)生，一種是與特定反應(yīng)相偶聯(lián)將NADP+還原成NADPH，如磷酸戊糖途徑中zwf編碼的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，基因gnd編碼的葡萄糖酸磷酸脫氫酶；另一種是通過基因ppnK表達(dá)NAD激酶的催化反應(yīng)，將NAD+或NADH磷酸化生成NADP+和NADPH[36]。SHI F等[34]分別在C.glutamicumJHI3-156和C.glutamicumATCC 13869中過表達(dá)ppnK基因，胞內(nèi)NADPH含量分別增加95.0%和42.0%，L-異亮氨酸產(chǎn)量分別增加37.0%和24.0%。SHI F等[37]在C.glutamicumJHI3-156中過表達(dá)zwf和ppnK基因，胞內(nèi)NADPH水平得到顯著提升，L-異亮氨酸產(chǎn)量分別增加26.0%和31.0%，將兩個(gè)基因共表達(dá)，菌株發(fā)酵72 h后，異亮氨酸產(chǎn)量提高至16.7 g/L。該研究還在C.glutamicumJHI3-156中表達(dá)源于釀酒酵母的NADH激酶基因（POS5），菌株發(fā)酵72 h，L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到16.2 g/L，而對(duì)照菌株產(chǎn)量?jī)H為12.8 g/L。MA W等[38]通過過表達(dá)果糖-1,6-二磷酸酶基因gnd、fbp、6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶基因pgl，強(qiáng)化谷氨酸棒桿菌的磷酸戊糖途徑，使L-異亮氨酸產(chǎn)量分別提高15.2%、13.6%、7.5%；以上三個(gè)基因共表達(dá)的菌株，在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵72 h可產(chǎn)生28.9 g/L的L-異亮氨酸。BARTEK T等[39]研究發(fā)現(xiàn)，由基因pgi編碼的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的缺失可以為L(zhǎng)-異亮氨酸合成提供充足的NADPH，提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量。

4 代謝工程改造提高L-異亮氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力

L-異亮氨酸快速合成時(shí)，需要及時(shí)運(yùn)送到胞外，否則在胞內(nèi)大量積累會(huì)降低相關(guān)酶活性，出現(xiàn)反饋抑制現(xiàn)象，影響產(chǎn)物的合成與積累[40]。谷氨酸棒桿菌可以通過brnQ編碼的BrnQ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從環(huán)境中攝取L-異亮氨酸[41]，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)L-異亮氨酸積累時(shí)，L-異亮氨酸可以結(jié)合全局調(diào)控因子Lrp，激活brnFE基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體BrnFE將L-異亮氨酸分泌到胞外[36]。通過代謝工程手段降低L-異亮氨酸的攝取速率，提高分泌能力可以有效緩解反饋抑制，是促進(jìn)產(chǎn)物合成的重要手段。

BrnQ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由426個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為44.9 kDa。TAUCH A等[42]研究發(fā)現(xiàn)，將染色體上的基因brnQ敲除后，L-異亮氨酸攝取速率僅為0.04 nmol/（min·mg干質(zhì)量），而野生型為1.20 nmol/（min·mg干質(zhì)量），攝取速率顯著降低。XIE X等[43]研究表明，利用C.glutamicumYILW△brnQ發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，35 h前L-異亮氨酸合成速率與對(duì)照菌株的相當(dāng)，發(fā)酵結(jié)束，L-異亮氨酸產(chǎn)量比對(duì)照的提高16.6%，達(dá)到22.3 g/L。

BrnFE是一種針對(duì)脂肪族疏水氨基酸的滲透酶，對(duì)三種分支氨基酸的分泌速率大致相同。MUSTAFI N等[44]研究發(fā)現(xiàn)，敲除brnF或brnE后，L-異亮氨酸無法分泌到胞外，而過表達(dá)brnFE則使菌株獲得更強(qiáng)的分泌能力。XIE X等[43]利用C.glutamicumYILW/pXMJ19和YILW/pXMJ19-brnFE進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)二者菌體濃度相差不大，但YILW/pXMJ19-brnFE的發(fā)酵產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高28.2%（25.9 g/L），YILW△brnQpXMJ19-brnFE的發(fā)酵結(jié)果表明，L-異亮氨酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高43.6%（29.0 g/L）。

亮氨酸響應(yīng)蛋白Lrp是L-異亮氨酸分泌到胞外的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[45-46]。細(xì)胞內(nèi)存在高濃度L-異亮氨酸時(shí)，lrp基因被激活表達(dá)，L-異亮氨酸與蛋白Lrp結(jié)合激活brnFE基因，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BrnFE大量合成，將L-異亮氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外[47]。CHEN C等[48]通過在C.glutamicumATCC 13869中過表達(dá)基因lrp，使L-異亮氨酸產(chǎn)量提高9倍。YIN L等[49]在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)基因lrp后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，與出發(fā)菌株相比，L-異亮氨酸產(chǎn)量增加31.9%，達(dá)到21.5 g/L；將基因brnFE和lrp共表達(dá)，使產(chǎn)量提高63.0%，達(dá)到26.6 g/L。因此，蛋白Lrp對(duì)L-異亮氨酸的分泌具有重要的調(diào)節(jié)作用[50]。

表1 谷氨酸棒桿菌代謝工程改造及L-異亮氨酸發(fā)酵性能比較Table 1 Metabolic engineering modification and L-isoleucine fermentation performance comparison of Corynebacterium glutamicum

5 展望

L-異亮氨酸生物合成途徑冗長(zhǎng)，分支途徑較多，生物體自身調(diào)節(jié)機(jī)制十分復(fù)雜，導(dǎo)致主代謝流較弱，副產(chǎn)物大量產(chǎn)生，代謝調(diào)控和改造較為困難。另外，嚴(yán)重的反饋抑制、氨基酸分泌能力不足、輔因子再生能力較弱等也嚴(yán)重制約著產(chǎn)物合成能力的提高。谷氨酸棒桿菌是L-異亮氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的主要菌株之一，具有遺傳背景清楚，基因改造手段和工具成熟的特點(diǎn)，為通過代謝工程手段解決上述問題，提高L-異亮氨酸代謝合成提供了良好基礎(chǔ)。隨著各種組學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，菌種的改造更加便捷。新興的系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)使細(xì)胞全基因組重編程得以實(shí)現(xiàn)[51]，可以快速、高效的重構(gòu)代謝通路，更方便的對(duì)目的基因進(jìn)行改造[52]，為谷氨酸棒桿菌的改造提供有力手段。通過上述技術(shù)對(duì)谷氨酸棒桿菌進(jìn)行改造，可以進(jìn)一步促進(jìn)L-異亮氨酸的合成與積累，將其提升為氨基酸工業(yè)中最成功的微生物。