楊放晴，何麗英，楊 丹，申夢園，王 福，陳鴻平，劉友平*

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137）

廣陳皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulataBlanco）的栽培變種茶枝柑（Citrus reticulateChachi）的干燥成熟果皮[1]，有理氣健脾、燥濕化痰之功。在我國有著悠久的歷史，具有很高的藥用價值，同時作為傳統(tǒng)的香料和調(diào)味佳品，享有盛譽[2]。傳統(tǒng)理論認(rèn)為陳皮“陳久者良”，即隨著陳化時間的增加，陳皮的質(zhì)量會提高。目前，關(guān)于陳皮“陳久者良”的研究主要集中在不同陳化年限陳皮化學(xué)成分、藥理作用的強弱比較方面[3-4]，而對其科學(xué)內(nèi)涵的現(xiàn)代研究相對薄弱。

本課題組前期報道陳皮表面的曲霉屬（Aspergillus）是引起黃酮類和揮發(fā)油含量與類型變化的重要因素[5]。陳聰聰[6]研究發(fā)現(xiàn)陳皮表面芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳酸鏈球菌屬（Lactococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等優(yōu)勢細(xì)菌可加速其揮發(fā)油的生物轉(zhuǎn)化。這些研究證實了陳皮表面微生物會引起陳皮質(zhì)量的變化。但未對陳皮陳化過程中微生物種群結(jié)構(gòu)變化與氣候條件的關(guān)聯(lián)進行研究。文獻(xiàn)報道，不同地區(qū)特定的氣候環(huán)境影響微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[7-8]。課題組前期也通過對四川地區(qū)自然陳化1年川陳皮表面微生物與環(huán)境因子相關(guān)性研究，初步證實陳皮表面微生物群落變化與環(huán)境因子密切相關(guān)[9]。

高通量測序技術(shù)具有測序深度高、利于鑒定低豐度群落物種以及費用低的特點[10-11]。不僅能獲得樣品中微生物群落組成，還能將其相對含量進行數(shù)字化，已在白酒[12-13]、

醋[14]、腐乳[15]、發(fā)酵飲料[16]等的微生物多樣性分析得到廣泛應(yīng)用，為環(huán)境樣品微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析提供了一種可靠有效的方法[17]。因此，本實驗采用高通量測序技術(shù)首次對溫帶季風(fēng)性氣候（北京）、亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候（四川）、亞熱帶季風(fēng)氣候（廣東）、亞熱帶高原季風(fēng)氣候（云南）自然陳化1年廣陳皮表面細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)、真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）1區(qū)基因進行測序，并通過α和β多樣性分析對細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)組成進行分析，比較不同地區(qū)廣陳皮中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，為探究適合陳皮陳化的氣候條件，同時為深入研究陳皮陳化機制，闡釋陳皮“陳久者良”科學(xué)內(nèi)涵提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

為保證樣品的代表性和均一性，2020年1月初在廣東省江門市新會區(qū)三江鎮(zhèn)新馬單村采集當(dāng)年產(chǎn)的橘皮，樣品均為蕓香科植物橘的栽培變種茶枝柑（Citrus Reticulate Chachi）的干燥成熟果皮。以麻布袋將樣品包裝后分別將其放置于北京市豐臺區(qū)西四環(huán)中路100號解放軍302醫(yī)院、四川省成都市溫江區(qū)柳臺大道1166號成都中醫(yī)藥大學(xué)、廣東省江門市蓬江區(qū)堤東路208號首層、云南省昆明市呈貢區(qū)雨花路1076號云南中醫(yī)藥大學(xué)的陰涼干燥通風(fēng)的倉庫內(nèi)，自然陳化1年后取樣，樣本編號分別為BJ、SC、GD、YN，每個樣本取5個生物學(xué)重復(fù)。

1.1.2 試劑

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD型潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DZX-50KBS型立式高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；Bio-rad T100梯度PCR儀：美國Bio-Rad公司；NovaSeq 6000測序系統(tǒng)：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA提取和PCR擴增

參照文獻(xiàn)[18]提取廣陳皮樣品的總DNA，以其為模板，采用帶有Barcode序列的引物對515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）/806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和ITS1-1F-F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）/ITS1-1F-R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）分別對細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)、真菌ITS1-1F區(qū)基因進行PCR擴增[19]。PCR擴增體系：Phusion Master Mix（2×）15 μL，正反向引物（2 μmol/L）各1.5 μL，gDNA（1 mg/L）10 μL，雙蒸水（ddH2O）2 μL。細(xì)菌PCR擴增條件：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。真菌PCR擴增條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，然后根據(jù)Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒說明書切膠回收PCR擴增產(chǎn)物。

1.3.2 文庫構(gòu)建和上機測序

使用Illumina公司的TruSeqDNAPCR-FreeLibraryPreparation Kit進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit定量和文庫檢測合格后，采用NovaSeq 6000上機測序。

1.3.3 高通量測序數(shù)據(jù)處理與分析

去除Barcode序列和引物序列，使用FLASH（V1.2.7）軟件進行拼接，得到原始序列數(shù)據(jù)。原始序列數(shù)據(jù)進行嚴(yán)格的過濾處理[20]后參照QIIME（V1.9.1）[21]的序列質(zhì)量控制流程，與物種注釋數(shù)據(jù)庫比對剔除嵌合體，得到有效序列。以97%的一致性進行操作分類單元（operationaltaxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTUs的代表序列。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，細(xì)菌用Mothur方法與SSU rRNA數(shù)據(jù)庫[22]對OTUs代表序列進行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1.0）；真菌通過QIIME軟件中的BLAST方法與Unit數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析，得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時，使用QIIME軟件計算Alpha多樣性（Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Coverage指數(shù)），采用R軟件（V2.15.3）分別進行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析、Venn圖與非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）圖繪制，以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等。

大約10%的肺膿腫患者需要行手術(shù)切除。手術(shù)指征分為急性和慢性。急性期手術(shù)指征為：咯血，持續(xù)的敗血癥發(fā)熱，膿腫破潰到胸膜腔形成膿氣胸或膿胸。慢性期手術(shù)指征為：抗生素治療超過6周無效，懷疑肺癌或膿腔超過6cm。膿腫較大或者位置較深的需要做肺葉切除術(shù)。如果切除范圍能夠包含膿腔以及周圍的壞死組織，非解剖型肺切除或肺段切除也是合適的手術(shù)選擇[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

不同地區(qū)自然陳化1年的廣陳皮中細(xì)菌、真菌的有效序列及OTUs數(shù)分別見表1和表2。由表1可知，不同地區(qū)廣陳皮樣品中，細(xì)菌共獲得1 279 520條有效序列，平均堿基長度為252～253 bp，共得到可分類的OTUs數(shù)目約40 267個。由表2可知，真菌共獲得1 284 394條有效序列，平均堿基長度為226～233 bp。共得到可分類的OTUs數(shù)目約6 163個。

表1 不同地區(qū)廣陳皮中細(xì)菌的有效序列及OTUs數(shù)目Table 1 Effective sequences and OUTs numbers of bacteria in Chachi samples from different regions

表2 不同地區(qū)廣陳皮中真菌的有效序列及OTU數(shù)目Table 2 Effective sequences and OUT numbers of fungi in Chachi samples from different regions

2.2 α-多樣性分析

Coverage指數(shù)代表測序?qū)ξ锓N的覆蓋度；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用于衡量微生物群落的多樣性，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)用于估算樣品中微生物的豐富度[23]。不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮表面細(xì)菌及真菌的α-多樣性分析結(jié)果分別見表3和表4。

表3 不同地區(qū)廣陳皮中細(xì)菌群落α-多樣性分析結(jié)果Table 3 Analysis results of α-diversity of bacteria community of Chachi samples from different regions

表4 不同地區(qū)廣陳皮中真菌群落α-多樣性分析結(jié)果Table 4 Analysis results of α-diversity of fungi community of Chachi samples from different regions

由表3和表4可知，所有樣本的Coverage指數(shù)均達(dá)到0.99，表明測序結(jié)果能完整反映陳皮表面微生物群落組成信息。就細(xì)菌而言，不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮樣品Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）；云南地區(qū)樣品的Chao1指數(shù)及ACE指數(shù)高于其他地區(qū)樣品，分別為2 088.45、2 157，但不存在顯著差異性（P＞0.05）；就真菌而言，不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮樣品Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）；廣東地區(qū)樣品的Chao1指數(shù)及ACE指數(shù)高于其他地區(qū)樣品，分別為326.59、338.77，但不存在顯著差異性（P＞0.05）。說明在不同地區(qū)自然陳化1年的廣陳皮表面微生物的多樣性及豐富度無顯著性差異，這可能與陳化時間較短有關(guān)。

2.3 微生物群落組成分析

基于門水平，不同地區(qū)廣陳皮樣品中細(xì)菌及真菌群落結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 基于門水平不同地區(qū)廣陳皮樣品中細(xì)菌（a）及真菌（b）群落結(jié)構(gòu)Fig.1 Community structure of bacteria (a) and fungi (b) in Chachi samples from different regions based on phylum level

由圖1a可知，在門水平上，不同地區(qū)自然陳化1年的所有樣本中細(xì)菌主要包括變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、Acidobacteriota等。不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，但相對豐度差異較大。其中Proteobacteria、Cyanobacteria在4個地區(qū)廣陳皮樣品中相對豐度較高，Proteobacteria在北京、四川、廣東和云南地區(qū)的廣陳皮樣品中的相對豐度分別為47.62%、49.48%、48.69%、41.94%，Cyanobacteria的相對豐度分別為37.99%、31.44%、36.44%和43.45%。

由圖1b可知，子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）在不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮表面真菌中占主導(dǎo)地位。不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，但相對豐度差異較大。Ascomycota在云南地區(qū)廣陳皮樣品中相對豐度最高，為83.23%，在四川地區(qū)相對豐度最低，為54%。Basidiomycota在北京、四川、廣東和云南地區(qū)廣陳皮樣品中的相對豐度分別為18.83%、37.34%、22.86%和14.12%。此外，羅茲菌門（Rozellomycota）僅在四川地區(qū)存在，相對豐度為0.96%。

基于屬水平，不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮樣品中細(xì)菌及真菌群落結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 基于屬水平不同地區(qū)廣陳皮樣品中細(xì)菌（a）及真菌（b）群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Community structure of bacteria (a) and fungi (b) in Chachi samples from different regions based on genus level

由圖2a可知，在屬水平上，不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮樣本中細(xì)菌主要包括unidentifiedChloroplast、unidentifiedMitochondria、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等。其中unidentifiedChloroplast和unidentifiedMitochondria在4個地區(qū)廣陳皮樣品中相對豐度較高，在云南地區(qū)兩者豐度之和最大，為62.27%，廣東地區(qū)兩者豐度之和最小，為42.18%。說明不同地區(qū)廣陳皮中細(xì)菌多樣性有待進一步挖掘和發(fā)現(xiàn)。Methylobacterium在四川地區(qū)廣陳皮樣品中相對豐度最大，為15.59%，在廣東地區(qū)廣陳皮樣品中相對豐度最小，為4.99%，在北京和云南地區(qū)廣陳皮樣品中相對豐度分別8.97%和6.81%。Sphingomonas、Mesorhizobium、Bacillus在四川地區(qū)廣陳皮樣品中相對豐度最高，分別為2.86%、2.04%和1.22%。值得注意的是，研究報道Bacillus、Lactococcus可加速陳皮中揮發(fā)油的生物轉(zhuǎn)化[6]。

由圖2b可知，不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮樣本中真菌屬主要包括平臍疣孢屬（Zasmidium）、枝孢霉屬（Cladospo rium）、短梗霉屬（Aureobasidium）、酵母菌屬（Symmetrospora）、unidentifiedCystobasidiomycetessp.、鑲刀菌屬（Fusarium）、紅酵母屬（Rhodotorula）、擔(dān)孢酵母屬（Erythrobasidium）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、赤霉菌屬（Gibberella）、擬棘殼孢屬（Pyrenochaetopsis）和曲霉屬（Aspergillus）等。其中Zasmidium在云南地區(qū)相對豐度最大，為45.77%；Cladosporium、Aureobasidium和Colletotrichum在北京地區(qū)相對豐度最大，分別為16.80%、27.27%、4.18%；Symmetrospora、Aspergillus在四川地區(qū)相對豐度最大，分別為13.00%、1.16%。unidentifiedCystobasidiomycetessp.在廣東地區(qū)相對豐度最大，為7.99%。Rhodotorula僅在北京、四川地區(qū)中存在，且在四川地區(qū)相對豐度最大，為8.77%。外瓶霉屬（Exophiala）僅在四川地區(qū)存在，其相對豐度為1.32%。值得注意的是，課題組前期報道陳皮表面黑曲霉（Aspergillus niger）是引起黃酮類和揮發(fā)油含量與類型變化的重要因素[5]。但不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮樣品表面Aspergillus檢出較少，這可能與陳皮陳化時間較短相關(guān)。

2.4 不同地區(qū)廣陳皮樣品微生物群落比較

為了說明不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮樣本物種組成的相似性情況[24]，對不同地區(qū)廣陳皮中細(xì)菌及真菌的OTU進行Venn圖繪制，結(jié)果見圖3。

圖3 基于OTU水平不同地區(qū)廣陳皮中細(xì)菌（a）及真菌（b）Venn圖Fig.3 Venn diagrams of bacteria (a) and fungi (b) of Chachi samples from different regions based on OTU level

由圖3可知，在OTUs組成上，四川、北京、云南、廣東地區(qū)自然陳化1年的廣陳皮表面細(xì)菌群落分別得到585、748、794和697個特有OTU，共有OTU數(shù)為1 826個；真菌群落分別得到282、154、71和159個特有OTU，共有的OUT數(shù)為272個，且不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮表面，真菌種類明顯少于細(xì)菌種類。

非度量多維標(biāo)度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）法是一種將多維空間的研究對象（樣本）簡化到低維空間進行定位、分析和歸類，同時又保留對象間原始關(guān)系的數(shù)據(jù)分析方法[25]。對不同樣本間的差異程度，通過點與點間的距離進行體現(xiàn)，距離越近，則樣本組成越相似?；趯偎剑煌貐^(qū)廣陳皮中細(xì)菌及真菌的NMDS分析結(jié)果見圖4。

圖4 基于屬水平不同地區(qū)廣陳皮中細(xì)菌（a）及真菌（b）的NMDS結(jié)果Fig.4 NMDS results of bacteria (a) and fungi (b) of Chachi samples from different regions based on genus level

由圖4可知，不同地區(qū)所有廣陳皮樣品距離較近，說明不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮樣品中細(xì)菌及真菌群落組成相似。

為進一步比較不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮樣品在屬水平上群落組成的相似性和差異性，根據(jù)所有樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取相對豐度排名前35的屬進行相似性聚類，得到聚類分析熱圖，結(jié)果見圖5。一個樣品在某個分類上的Z值為樣品在該分類上的相對豐度和所有樣品在該分類的平均相對豐度的差與所有樣品在該分類上的標(biāo)準(zhǔn)差的比值，將聚類分析熱圖中Z＞1的物種定義為優(yōu)勢菌屬。

圖5 基于屬水平細(xì)菌（a）及真菌（b）群落物種相對豐度聚類熱圖Fig.5 Cluster heatmap of relative abundance of bacteria (a) and fungi (b) community species based on genus level

由圖5a可知，北京地區(qū)自然陳化1年廣陳皮表面優(yōu)勢細(xì)菌屬為Methylocella、苔蘚桿菌屬（Bryobacter）和短小桿菌屬（Curtobacterium）；四川地區(qū)自然陳化1年廣陳皮表面優(yōu)勢細(xì)菌屬為Methylobacterium、Sphingomonas、Bacillus、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、副球菌屬（Paracoccus）、膨脹芽胞桿菌屬（Tumebacillus）、溶菌桿菌（Lysinibacillus）、Tundrisphaera、乳球菌屬（Lactococcus）、嗜酸菌屬（Acidiphilium）；廣東地區(qū)自然陳化1年廣陳皮表面優(yōu)勢細(xì)菌屬為Rubellimicrobium、乳桿菌屬（Lactobacillus）、放線孢菌屬（Actinomycetospora）；云南地區(qū)自然陳化1年廣陳皮表面優(yōu)勢細(xì)菌屬為unidentifiedChloroplast、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）、Glutamicibacter、馬賽菌屬（Massilia）、羅河桿菌屬（Rhodanobacter）。

由圖5b可知，北京地區(qū)自然陳化1年廣陳皮表面優(yōu)勢真菌屬為Aureobasidium、Colletotrichum、Pyrenochaetopsis、Roussoella、Sarcopodium、Wallemia、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）；四川地區(qū)自然陳化1年廣陳皮表面優(yōu)勢真菌屬為Symmetrospora、Rhodotorula、Gibberella、unidentifiedPucciniomycetessp.、紅冬孢酵母屬（Rhodosporidiobolus）、Aspergillus、Exophiala、Pseudoramichloridium、Naganishia；廣東地區(qū)自然陳化1年廣陳皮表面優(yōu)勢真菌屬為unidentifiedCystobasidiomycetessp.、Pseudocercospora、毛殼菌屬（Chaetomium）、耐干霉菌屬（Xeromyces）、Cystobasidium、漢納酵母屬（Hannaella）、Ectophoma、隱球酵母屬（Cryptococcus）、鏈格孢屬（Alternaria）、彎孢屬（Curvularia）；云南地區(qū)自然陳化1年廣陳皮表面優(yōu)勢真菌屬為Zasmidium、擬暗球腔菌屬（Phaeosphaeriopsis）、小粉孢屬（Microidium）和多臂菌屬（Trichomerium）。文獻(xiàn)報道，陳皮表面Methylobacterium、Sphingomonas、Lactococcus、Bacillus等細(xì)菌可加速揮發(fā)油的生物轉(zhuǎn)化[6，26]，Aspergillus是引起黃酮類和揮發(fā)油含量與類型變化的重要因素。Methylobacterium、Sphingomonas、Lactococcus、Bacillus、Aspergillus為四川地區(qū)的優(yōu)勢菌屬，說明四川地區(qū)的氣候條件比較適合廣陳皮的自然陳化。

3 結(jié)論

本研究通過高通量測序技術(shù)分析了不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮樣品表面微生物群落多樣性變化及優(yōu)勢菌群分布。分析結(jié)果表明，不同地區(qū)自然陳化1年廣陳皮樣品豐富度和多樣性不存在顯著差異（P＞0.05），微生物群落結(jié)構(gòu)相似，但相對豐度存在差異，優(yōu)勢菌屬不同。Methylocella、Bryobacter和Curtobacterium為北京地區(qū)優(yōu)勢細(xì)菌，Methylobacterium、Sphingomonas、Bacillus等為四川地區(qū)優(yōu)勢細(xì)菌，Rubellimicrobium、Lactobacillus、Actinomycetospora為廣東地區(qū)優(yōu)勢細(xì)菌，unidentifiedChloroplast、Ralstonia、Glutamicibacter、Massilia、Rhodanobacter為云南地區(qū)優(yōu)勢細(xì)菌。Aureobasidium、Colletotrichum、Pyrenochaetopsis等為北京地區(qū)優(yōu)勢真菌，Symmetrospora、Rhodotorula、Gibberella等為四川地區(qū)優(yōu)勢真菌，Pseudocercospora、Chaetomium、Xeromyces等為廣東地區(qū)優(yōu)勢真菌，Zasmidium、Phaeosphaeriopsis、Microidium和Trichomerium為云南地區(qū)優(yōu)勢真菌。四川地區(qū)優(yōu)勢細(xì)菌屬Methylobacterium、Sphingomonas、Lactococcus、Bacillus可加速揮發(fā)油的生物轉(zhuǎn)化，優(yōu)勢真菌屬Aspergillus是引起黃酮類和揮發(fā)油含量與類型變化重要因素。說明四川地區(qū)的氣候條件比較適合廣陳皮的自然陳化。