帥月圓，韓 誠，2，曹建華，李少創(chuàng)，秦亞莉，2

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 晉中030619；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 晉中030619；3.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原030006）

阿爾茨海默?。ˋizheimer's disease，AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要特征為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力減退以及行為改變［1］。據(jù)WHO報(bào)道，目前全球共有癡呆癥患者約5000萬，以AD患者為主［2］。該病早期難以察覺，確診時(shí)多已發(fā)展到中晚期，給患者的日常生活、工作及社交帶來嚴(yán)重影響。AD的具體發(fā)病機(jī)制目前尚未完全研究透徹，存在多種假說。早期診斷的困難、發(fā)病機(jī)制的不明確、治療效果的不顯著以及病程的不可逆都表明AD的危害程度，隨著我國老齡化進(jìn)程的不斷發(fā)展，對于AD的早期防治越來越顯現(xiàn)出重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值和社會(huì)意義。

AD在中醫(yī)學(xué)中歸屬于癡呆范疇，其病機(jī)為髓減腦消，神機(jī)失用，病性為本虛標(biāo)實(shí)，本虛又以腎虛為關(guān)鍵。腎主骨生髓與腦相通，AD患者多年老體衰，腎精漸虧，腦髓失于充養(yǎng)而消減，髓?？仗搫t心無所慮，精明失聰，神無所依而出現(xiàn)癡呆的各種表現(xiàn)［3］。故中醫(yī)對于AD的治療多從腎虛精虧著手，地黃飲子作為經(jīng)典補(bǔ)腎方劑常被用于AD腎虛精虧證的治療。研究表明，地黃飲子可以通過減輕膽堿能系統(tǒng)損害、抗氧化和減少自由基、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)揮對AD的治療作用［4］。本研究運(yùn)用經(jīng)典補(bǔ)腎方劑地黃飲子對AD腎虛精虧證進(jìn)行干預(yù)，分析其內(nèi)源性代謝物的變化，探尋AD腎虛精虧證的生物學(xué)機(jī)制以及地黃飲子干預(yù)AD腎虛精虧證的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2016-0011］，動(dòng)物飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物與試劑 地黃飲子購于北京同仁堂山西連鎖店；Aβ1-42購于杭州中肽生化有限公司（批號(hào)：AP0039）；D-半乳糖購于北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)：D8310-100 g）；重水（D2O）購自美國蘭迪斯維爾Norell公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司，型號(hào)：68503）；SorvallTMLegendTMXT/XF離心機(jī)（美國/Thermo Scientific）；Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司，型號(hào)：JLBehvMwMM）；Bruker 600 MHz AvanceⅢNMR Spectrometer（德國布魯克公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 地黃飲子水煎劑的制備 按地黃飲子各藥材（熟地黃、巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉、炮附子、五味子、肉桂、茯苓、麥冬、石菖蒲、遠(yuǎn)志、薄荷、生姜、大棗質(zhì)量比12∶9∶9∶9∶9∶6∶6∶6∶6∶6∶6∶6∶3∶3∶3）配比稱取藥材。加入8倍量蒸餾水浸泡30 min，水煎提取25 min，收集水煎液，再用8倍體積水提取20 min，將2次煎煮藥液混合均勻并加熱濃縮，每劑中藥濃縮為含生藥量2 g/mL，4℃冰箱冷藏保存。

1.2.2 分組與給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按Rand函數(shù)隨機(jī)分為正常對照組、AD腎虛精虧證組、地黃飲子低劑量組（5.2 g/kg）、地黃飲子中劑量組（10.4g/kg）、地黃飲子高劑量組（20.8 g/kg），每組12只。證候造模第5周開始灌胃給藥，地黃飲子各劑量組給予相應(yīng)濃度藥液，正常對照組和AD腎虛精虧證模型組灌胃等體積蒸餾水。1次/d，至造模結(jié)束為止。

1.2.3 AD腎虛精虧證模型的制備及驗(yàn)證 采用房事不節(jié)法［5-6］和腹腔注射D-半乳糖溶液構(gòu)建腎虛精虧證模型。除正常對照組外的4組大鼠每天下午與處于動(dòng)情期的雌性大鼠同籠，次日上午取出雄鼠，下午再投入動(dòng)情期雌性大鼠籠內(nèi)，如此輪轉(zhuǎn)，連續(xù)8周。除正常對照組外的4組大鼠每天腹腔注射D-半乳糖（50 mg/kg），連續(xù)8周。第8周在腎虛精虧證模型的基礎(chǔ)上采用側(cè)腦室注射Aβ1-42制備AD大鼠模型。除正常組外的大鼠固定在腦立體定位儀上，以微量注射器將5 μL預(yù)先孵育好的Aβ1-42混懸液緩慢注射到大鼠腦部側(cè)腦室區(qū)域。注射1周后用Morris水迷宮檢測各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)主要包括定位航行和空間探索兩部分。定位航行實(shí)驗(yàn)總共5 d，記錄大鼠每次自入水直至尋找到目標(biāo)象限平臺(tái)并爬上平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期，時(shí)長最大值為120 s。第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠60 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)以及在目標(biāo)象限停留的時(shí)間。

1.2.4 樣品收集與制備 造模結(jié)束后麻醉開腹，腹主動(dòng)脈取血，在4℃、3000 r/min離心10 min，取上清液后移至EP管中，于-80℃冰箱中保存。取血清樣品450 μL，加入350 μL D2O，斡旋振蕩混勻后低溫離心，取上清液600 μL置于5 mm核磁管中，在Bruker 600 MHz核磁儀上測定，設(shè)置主要參數(shù)：采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)（TD）為65 536，掃描次數(shù)（NS）為64次，掃描譜寬（SWH）為12 019.23 Hz，傅里葉變換為0.183 Hz，脈沖間隔D1為1s，延遲時(shí)間為5.0 s。血清樣品采用CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Grill）脈沖序列，以衰減蛋白質(zhì)和脂蛋白的寬峰。

1.2.51H-NMR譜圖處理 譜圖處理采用MestReNova 8軟件進(jìn)行分析。所有譜圖進(jìn)行手動(dòng)相位、基線調(diào)整。血清譜圖以肌酐的化學(xué)位移（δ3.04）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正，以0.01對化學(xué)位移區(qū)間δ0.60~9.00進(jìn)行分段積分，其中δ4.67~4.89（殘余水峰）不進(jìn)行積分，并將積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，導(dǎo)入Excel中進(jìn)行下一步多元統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將上述處理的積分?jǐn)?shù)據(jù)輸入到SIMCA-P+13軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，采用偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）進(jìn)行組間比較和模型驗(yàn)證；采用正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal PLS-DA，OPLS-DA）的S-plot圖，尋找對分類貢獻(xiàn)較大的變量，選擇（variable importance in the projection，VIP）＞1的變量作為潛在生物標(biāo)記物的鑒別依據(jù)。采用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)采用One-Way ANOVA進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著大鼠訓(xùn)練時(shí)間的推移，AD腎虛精虧證組逃避潛伏期較正常對照組明顯延長，提示模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力存在缺陷；與AD腎虛精虧證組比較，地黃飲子各劑量組的逃避潛伏期均縮短，說明地黃飲子可以改善AD腎虛精虧證大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力（圖1A）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，與正常對照組相比，AD腎虛精虧證組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P<0.001），經(jīng)地黃飲子中劑量和高劑量干預(yù)后，平臺(tái)穿越次數(shù)升高（P<0.01和P<0.05）（圖1B）；目標(biāo)象限停留時(shí)間AD腎虛精虧證組較正常對照組明顯縮短（P<0.01），經(jīng)地黃飲子中劑量和高劑量干預(yù)后，目標(biāo)象限停留時(shí)間延長（P<0.01和P<0.05）（圖1C）。

圖1 Morris水迷宮檢測結(jié)果

2.2 血清1H-NMR譜圖指認(rèn)

參考有關(guān)文獻(xiàn)［7］及代謝物數(shù)據(jù)庫HMDB（http：//www.hmdb.ca），結(jié)合本實(shí)驗(yàn)1H-NMR譜圖對大鼠血清中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行指認(rèn)，共指認(rèn)出23種內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，具體結(jié)果見圖2和表1。

表1 大鼠血清樣本1H-NMR譜圖主要代謝物歸屬

圖2 正常對照組大鼠血清樣本1H-NMR譜圖

2.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

為進(jìn)一步分析各組間內(nèi)源性代謝物的差異，對復(fù)雜數(shù)據(jù)降維處理后進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。采用有監(jiān)督的PLS-DA方法對各組血清樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行代謝輪廓分析，結(jié)果見圖3A。正常對照組與AD腎虛精虧證組的散點(diǎn)可以完全分開，說明AD腎虛精虧證組大鼠機(jī)體的代謝狀態(tài)存在明顯的改變。模型驗(yàn)證結(jié)果顯示Q2回歸線與縱軸相交于零點(diǎn)以下，且左側(cè)Q2實(shí)驗(yàn)值低于右邊的原始值，表明所建模型可靠性較高（圖3B）。

圖3 大鼠血清樣本PLS-DA散點(diǎn)圖（A）和相應(yīng)的模型驗(yàn)證圖（B）

2.4 血清差異代謝物的篩選

為進(jìn)一步確定AD腎虛精虧證造模前后大鼠血清內(nèi)源性代謝物的差異，采用OPLS-DA方法對樣品進(jìn)行分析，得到OPLS-DA得分圖（圖4A）和相應(yīng)的S-plot載荷圖（圖4B）。通過S-plot圖結(jié)合VIP值＞1以及P＜0.05尋找差異代謝物，共得到14個(gè)峰面積具有顯著性差異的內(nèi)源性代謝物。由圖5可知，與正常對照組相比，AD腎虛精虧證組血清中纈氨酸、異亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酰乙酸、亮氨酸、蛋氨酸含量升高，脂蛋白、N-乙酰糖蛋白、膽堿、甘氨酸、磷酸膽堿、β-葡萄糖、α-葡糖糖含量降低。地黃飲子可以有效調(diào)節(jié)以上差異代謝物接近正常對照組水平，其中地黃飲子低劑量可以升高脂蛋白的含量，降低異亮氨酸、乙酰乙酸的含量；地黃飲子中劑量可以升高脂蛋白、N-乙酰糖蛋白、磷酸膽堿的含量，降低乳酸、乙酰乙酸、丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸的含量；地黃飲子高劑量可以升高脂蛋白、N-乙酰糖蛋白、膽堿、磷酸膽堿、甘氨酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖的含量，降低乳酸、丙氨酸、乙酰乙酸、亮氨酸的含量。以上3組中地黃飲子中劑量組、地黃飲子高劑量組的差異代謝物水平與正常對照組最為接近。

圖4 正常對照組與AD腎虛精虧證組血清樣本OPLS-DA得分圖（A）和相應(yīng)的S-plot載荷圖（B）

圖5 大鼠血清中差異代謝產(chǎn)物相對峰面積

3 討論

糖酵解是放能反應(yīng)，它能供給生物體部分能量，尤其是在生理或病理?xiàng)l件下提供生命活動(dòng)所需的能量。其關(guān)鍵代謝物質(zhì)丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下最終還原為乳酸［8］。當(dāng)酵解過度會(huì)引起乳酸積累過多而引起酸中毒。本研究中AD腎虛精虧組與正常對照組相比乳酸含量升高，提示AD腎虛精虧證狀態(tài)下機(jī)體存在嚴(yán)重的乳酸堆積；經(jīng)地黃飲子干預(yù)后乳酸含量降低，表明地黃飲子可以改善機(jī)體的乳酸代謝水平。

乙酰乙酸是脂肪酸在肝臟中不完全氧化的產(chǎn)物，其作為酮體代謝中的一環(huán)，是某些器官的主要能源分子［9］。正常情況下，大腦的主要能源是葡萄糖，但在饑餓和患糖尿病時(shí)，大腦可有效利用酮體為其供能。長期饑餓時(shí)，腦所需能量75%來自乙酰乙酸。本研究中與酮體代謝相關(guān)的是乙酰乙酸，其含量的升高提示機(jī)體內(nèi)通過脂肪酸氧化的產(chǎn)能降低［10］。

N-乙酰糖蛋白、α-葡萄糖、β-葡萄糖是機(jī)體糖代謝主要物質(zhì)，在本研究中，AD腎虛精虧證組血清的N-乙酰糖蛋白、β-葡萄糖和α-葡萄糖的含量降低，提示機(jī)體內(nèi)葡萄糖消耗增加，能量代謝障礙嚴(yán)重；經(jīng)地黃飲子干預(yù)后三者的含量升高，表明地黃飲子可以通過糾正糖代謝紊亂來改善機(jī)體的能量代謝障礙。

纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸三者都為支鏈氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA），并且都屬于必需氨基酸，支鏈氨基酸是唯一一類在肝外代謝的氨基酸，主要在骨骼肌，約占骨骸肌蛋白質(zhì)必需氨基酸的35%，是體內(nèi)主要供能的氨基酸［11］。研究表明機(jī)體BCAA含量的升高可能會(huì)通過影響血清素能系統(tǒng)從而增加AD風(fēng)險(xiǎn)［12］。在本研究中，AD腎虛精虧組血清中支鏈氨基酸以及肌肉組織蛋白的主要底物之一的蛋氨酸含量高于正常對照組，表明在腎虛精虧證狀態(tài)下機(jī)體能量消耗嚴(yán)重，能量供應(yīng)無法滿足體內(nèi)更旺盛的能量需求從而引起骨骼肌蛋白分解代謝水平的加強(qiáng)［13］。在地黃飲子干預(yù)后，亮氨酸和蛋氨酸的含量降低。

丙氨酸在肌肉組織中濃度最高，其作為氨的載體，經(jīng)血液將氨運(yùn)送到肝臟后生成丙酮酸，丙酮酸經(jīng)糖異生途徑合成葡萄糖，為機(jī)體提供能源。本研究中AD腎虛精虧組丙氨酸與正常對照組相比呈升高狀態(tài)，經(jīng)地黃飲子干預(yù)后含量降低，表明在腎虛狀態(tài)下機(jī)體的能量消耗巨大。

腎作為先天之本，其主要生理功能為主藏精、主水和主納氣。腎主水是指腎有主持和調(diào)節(jié)人體水液代謝的功能，其實(shí)現(xiàn)又依賴腎的蒸騰氣化作用。病理情況下，腎中精氣虧虛，氣化功能失常，脂質(zhì)代謝作為機(jī)體水液代謝重要的一環(huán)同樣也會(huì)受到干擾［14］。脂蛋白運(yùn)輸甘油三酯可用于能量代謝［15］。膽堿和膽堿磷酸是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要物質(zhì)，血清中膽堿和膽堿磷酸的降低，提示細(xì)胞膜以及膜性結(jié)構(gòu)如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脂質(zhì)代謝受損［16］。本研究中AD腎虛精虧組中脂蛋白、膽堿和膽堿磷酸的含量呈降低狀態(tài)，經(jīng)地黃飲子干預(yù)后又呈升高狀態(tài)，表明AD腎虛精虧證與脂質(zhì)代謝紊亂關(guān)系密切。

當(dāng)人步入老年時(shí)，腎精開始逐漸虧虛，腎精不足則髓海不充，于是腦的正常機(jī)能也隨之受到影響，輕則表現(xiàn)出記憶力衰退等癥狀，重則發(fā)病為AD，故腎虛精虧證是AD的發(fā)病基礎(chǔ)。在本研究中，纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸歸屬于氨基酸代謝，N-乙酰糖蛋白、β-葡萄糖、α-葡糖糖、乳酸歸屬于糖代謝，乙酰乙酸、脂蛋白、膽堿、磷酸膽堿歸屬于脂類代謝，而機(jī)體的主要能量來源正是來自糖、脂、蛋白質(zhì)三類物質(zhì)的氧化，故以糖、脂類、氨基酸代謝為主的能量代謝紊亂（不足）可能是導(dǎo)致AD腎虛精虧證發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制。

腎虛往往提示人體各項(xiàng)臟腑功能減退或衰弱，從而導(dǎo)致體內(nèi)的各項(xiàng)循環(huán)和代謝減慢。形體消瘦、腰酸膝軟和懈惰思臥是AD腎虛精虧證證候表現(xiàn)出的主要癥狀中的一類，本研究表明AD腎虛精虧證存在氨基酸代謝紊亂，本來主要存在于骨骼肌的支鏈氨基酸被大量釋放到血清中為機(jī)體供能，在內(nèi)導(dǎo)致骨骼肌蛋白分解，在外則表現(xiàn)為形體消瘦。腰膝酸軟或與機(jī)體內(nèi)乳酸代謝紊亂堆積于肌肉有關(guān)，而懈惰思臥則可能是機(jī)體能量供應(yīng)不足的征兆。

綜上，AD腎虛精虧證組存在糖代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝三個(gè)方面的紊亂，三者均以能量代謝紊亂為主要特征，共同構(gòu)成AD腎虛精虧證的證候生物學(xué)基礎(chǔ)；地黃飲子通過部分改善糖代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝的紊亂起到對AD腎虛精虧證的治療作用。