羅 清，戴衛(wèi)波，嚴(yán)梓林

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東 中山528400；2.廣東藥科大學(xué)，廣東 中山528400）

水翁花，別名水雍花、大蛇藥、水翁仔、水榕花等，為桃金娘科植物水翁花Cleistocalyx operculatus（Roxb.）Merr.et Perry的干燥幼嫩花蕾，具有清熱解暑、生津止渴、去濕消滯之功效［1］。我院以水翁花為主要藥物制成的中藥制劑青蓮?fù)飧写莶瑁ㄅ鷾?zhǔn)文號(hào)：粵藥制字Z20071002）具有疏風(fēng)解表、清熱解毒之功效，用于外感風(fēng)熱感冒、發(fā)熱頭痛、咽喉腫痛、上呼吸道炎、扁桃體炎見上述證候者，深受廣大患者喜愛。近現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)水翁花具有抗炎、解熱鎮(zhèn)痛［2］、抗內(nèi)毒素［3-4］、降血糖［5］、抑制胰脂肪酶和α-淀粉酶活性［6］、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷和膜脂氧化［7］、逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥［8］、抗炎保肝［9］、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡［10］、影響過氧化氫誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用［11］等多種活性。關(guān)于水翁花體外抗氧化性的實(shí)驗(yàn)研究未見報(bào)道，為了進(jìn)一步研究水翁花的藥效機(jī)制，為開發(fā)以水翁花為基礎(chǔ)的復(fù)方中藥制劑提供重要依據(jù)，本研究對(duì)水翁花不同極性提取物的體外抗氧化性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 電子分析天平（型號(hào)：BS-224S；廠家：北京SARTORIUS）、超聲波清洗器（型號(hào)：KQ5200E；廠家：昆山超聲儀器有限公司）、分光光度計(jì)（型號(hào)：UV-2550；廠家：島津SHIMADZU）、直熱式電熱恒溫干燥箱（型號(hào)：東方-A；廠家：廣州東方電熱干燥設(shè)備廠）、高速多功能粉碎機(jī)（型號(hào)：JP-300A；廠家：永康市久品工貿(mào)有限公司）

1.1.2 藥材與試劑 水翁花（廣州康圣藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：20180808）、95%乙醇（廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20190802）、無水乙醇（廣東西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：1708011）、DPPH（上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：BFQNI-SL）、維生素C（美國Amresco公司，批號(hào)：2626C211）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水翁花提取物粉末的制備

1.2.1 .1 水翁花乙醇提取液的制備 準(zhǔn)確稱取水翁花藥材200 g，粉碎，于蒸餾燒瓶中，用95%乙醇1000 mL水浴回流提取2次，每次1.5 h。合并濾液，過濾，回收乙醇并濃縮，殘?jiān)铀贸曁崛》ㄌ崛? h，提取液濃縮后得到水翁花總醇提取液共50 mL（1 mL相當(dāng)于原藥材4 g）。

1.2.1 .2 水翁花總醇提液不同極性溶劑的萃取 取水翁花總醇提液50 mL于水浴鍋中蒸干，殘?jiān)蒙倭空麴s水超聲溶解，定容至30 mL，平均分成3份，每份10 mL于分液漏斗中，分別用1∶1石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行多次萃取，直至萃取液為無色。分別合并各萃取液保存?zhèn)溆?，各溶劑萃取后剩余的水層溶液合并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 .3 提取物粉末的制備 將上述各萃取液分別減壓揮干，殘?jiān)?5%乙醇溶解，50 mL試管中離心分離后于水浴鍋中揮去乙醇至無醇味，水層液于水浴鍋中直接濃縮揮干，各殘?jiān)?0℃烘箱中干燥至恒重并稱重，得到水翁花石油醚層粉末（A）、乙酸乙酯層粉末（B）、正丁醇層粉末（C）和水層液粉末（D）質(zhì)量分別為0.472 g、3.414 g、1.074 g、0.112 g。

1.2.1 .4 DPPH乙醇溶液的制備 準(zhǔn)確稱取DPPH粉末4 mg于燒杯中，加少量無水乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用無水乙醇洗滌燒杯3次，將洗滌液轉(zhuǎn)入容量瓶中，加無水乙醇至刻度線，搖勻，配成濃度為0.04 mg/mL的DPPH乙醇溶液（注：此溶液為現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.2.2 抗氧化活性的測定

1.2.2 .1 石油醚提取物抗氧化活性的測定 （1）石油醚提取物抗氧化活性預(yù)測定：準(zhǔn)確稱取粉末A100 mg于燒杯中，先用少量95%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，燒杯用95%乙醇洗滌3次，將洗滌液一并轉(zhuǎn)入容量瓶中，加95%乙醇至100 mL，搖勻，配成1 mg/mL的母液。再把母液分別稀釋成0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.08、0.06、0.04、0.02 mg/mL的子溶液。分別取上述各濃度的子溶液5 mL與0.04 mg/mL的DPPH溶液5 mL混合，37℃避光孵化30 min，觀察顏色變化，判斷其清除率的范圍。通過預(yù)測定選取濃度為0.03、0.025、0.02、0.015、0.01 mg/mL的子溶液測定其吸光度。（2）石油醚提取物抗氧化活性的測定：DPPH抗氧化活性測定采用Wang Dacheng等［12-13］方法，并稍作調(diào)整。取離心管3支，分別加入0.03 mg/mL子溶液和0.04 mg/mL的DPPH溶液各5 mL，混合搖勻，37℃避光靜置孵化30 min。同時(shí)用該濃度溶液5 mL與5 mL的無水乙醇混合液進(jìn)行空白調(diào)零，測定波長為517 nm的吸光度，取3支管吸光度的平均值，記為A樣品。按此方法，測定其余各濃度子溶液和濃度為0.004 mg/mL的DPPH溶液混合后的吸光度。另取0.004 mg/mLDPPH溶液與95%乙醇各5 mL混勻，用無水乙醇進(jìn)行空白調(diào)零，測定波長517 nm下的吸光度，重復(fù)3次，取平均值，記為ADPPH。清除率（%）=［1-A樣品/ADPPH］×100%，以萃取液濃度為橫坐標(biāo)，DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，水翁花石油醚萃取液在濃度0～0.030 mg/mL范圍，線性關(guān)系為y=26.669x+0.0219，線性關(guān)系良好（r2=0.9964），IC50=0.0179 mg/mL。

1.2.2 .2 其余萃取物抗氧化活性測定 取100 mg粉末B、C和D按母液和子液配制方法分別配成相同濃度的母液和子液，并按上述抗氧化活性預(yù)測定方法選取濃度，其中乙酸乙酯、正丁醇萃取液選取0.05、0.04、0.03、0.02、0.01 mg/mL的子溶液測定其吸光度，水層液選0.035、0.030、0.025、0.020、0.015 mg/mL的溶液測定其吸光度。DPPH抗氧化活性測定具體方法參照“1.2.2.1”測定各子溶液濃度與0.004 mg/mL的DPPH溶液混合后的吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果水翁花乙酸乙酯萃取液在濃度0～0.05 mg/mL范圍，線性關(guān)系為y=18.082x+0.0264，線性關(guān)系良好（r2=0.9943），IC50=0.0262mg/mL。正丁醇萃取液在濃度0～0.030 mg/mL范圍，線性關(guān)系為y=26.53x+0.0069，線性關(guān)系良好（r2=0.9942），IC50=0.0186 mg/mL。水層液在濃度0～0.035 mg/mL范圍，線性關(guān)系為y=22.089x+0.0314，線性關(guān)系良好，（r2=0.9925），IC50=0.0212 mg/mL。

1.2.2 .3 維生素C抗氧化活性的測定 取10 mg維生素C，按“1.2.2.1”配制方法配成0.1 mg/mL維生素C乙醇溶液母液。再把母液稀釋成0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.008、0.006、0.004、0.002 mg/mL的維生素C乙醇子溶液。并按“1.2.2.1”預(yù)測定，選取0.007、0.006、0.005、0.004、0.003 mg/mL的溶液測定其吸光度。參照“1.2.2.1”項(xiàng)，石油醚抗氧化性測定各濃度與0.004 mg/mL的DPPH溶液混合后的吸光度。結(jié)果維生素C乙醇溶液在濃度0～0.007 mg/mL范圍，線性關(guān)系為y=108.14x+0.0185，線性關(guān)系良好（r2=0.9948），IC50=0.004453 mg/mL。

2 結(jié)果

2.1 水翁花不同極性提取物的DPPH自由基清除率

水翁花不同極性提取物都具有一定的自由基清除率，且隨濃度升高，自由基清除率越強(qiáng)。在濃度相同時(shí)（以0.03 mg/mL為例），石油醚提取物的自由基清除率最強(qiáng)，為79.6853%，其次為正丁醇提取物（77.4854%），水層次之（70.5046%），乙酸乙酯提取物最弱（58.3502%），這與各提取物的IC50（圖1）結(jié)果相一致，表明水翁花不同極性提取物的自由基清除率在濃度相同時(shí)以石油醚提取物最高，其次為正丁醇提取物，水層再次之，乙酸乙酯提取物最弱。結(jié)果見表1。

表1 水翁花不同極性萃取物的DPPH自由基清除率

2.2 不同極性溶液DPPH自由基清除率比較

水翁花石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水層液自由基清除率的IC50分別為0.0179 mg/mL，0.0262 mg/mL，0.0186 mg/mL，0.0212 mg/mL，表明水翁花不同極性提取物都具有不同程度的抗氧化活性，其中石油醚萃取物的IC50最小，抗氧化性最強(qiáng)，正丁醇次之，乙酸乙酯萃取液最弱，但均稍弱于維生素C（IC50為0.004 453 mg/mL）。結(jié)果見圖1。

圖1 不同極性提取溶液DPPH自由基清除率對(duì)比圖

3 討論

自由基是人體內(nèi)各種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，其異常累積使得機(jī)體發(fā)生氧化損傷，進(jìn)而引發(fā)疾病，如肝癌、肝纖維化、阿爾茨海默病、糖尿病及心血管等疾?。?4］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，很多含黃酮類、多糖、維生素族、皂苷、生物堿等成分的清熱解毒類的中藥如黃芪［15］、柴胡［16］、丹參［17］等中藥及其提取物均可通過清除自由基發(fā)揮抗氧化作用，是天然抗氧化劑的主要來源。天然抗氧化劑能有效延緩衰老和治療衰老所引起的疾病，在我國逐步邁入老齡化社會(huì)的今天，尋找天然抗氧化劑來源也將成為今后的重點(diǎn)研究方向。

水翁花作為廣東地產(chǎn)藥材，具有清熱解暑、生津止渴、去濕消滯之功效，夏天常作為涼茶飲用。關(guān)于水翁花的研究近年來比較多，且逐漸深入，特別是水翁花中一種活性成分2′，4′-二羥基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮（DMC）已被證實(shí)具有抑制胰脂肪酶和α-淀粉酶活性［6］、降血糖［5］、抗炎保肝［10］、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞活性等多種作用［7］。本課題前期研究也表明，水翁花具有抗內(nèi)毒素作用［3］，可通過降低小鼠血清中一氧化氮（NO）和腫瘤壞死因子（TNF-α）的含量，減少細(xì)菌內(nèi)毒素所致動(dòng)物死亡率，因NO是引發(fā)氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵因子之一，TNF-α是引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要因子之一，表明水翁花抗內(nèi)毒素作用與抑制機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥水平有密切關(guān)系［4］，說明其可能與抗氧化活性有關(guān)。

本研究采用DPPH自由基清除法對(duì)水翁花不同極性提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行研究，并與維生素C作陽性對(duì)照。結(jié)果表明水翁花不同極性提取物都具有一定程度的自由基清除率，且隨濃度升高，自由基清除率越強(qiáng)，在同一濃度下石油醚提取物的自由基清除率最高，其次為正丁醇提取物，水層次之，乙酸乙酯提取物最弱，其自由基清除率的IC50值由低到高分別是石油醚提取物、正丁醇提取物、水層液、乙酸乙酯提取物，與自由基清除率的強(qiáng)弱結(jié)果相一致，表明石油醚萃取物的抗氧化性最強(qiáng)，正丁醇次之，乙酸乙酯萃取液最弱，但均稍弱于維生素C。這一結(jié)果從側(cè)面證明水翁花具有的多種活性都可能與其具有的抗氧化活性有關(guān)，但體內(nèi)抗氧化及具體哪種成分對(duì)抗氧化起到主要作用還有待進(jìn)一步研究。