高 思，賈 穎，張皎皎

（山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中030619）

銀屑病（psoriasis）是最常見的慢性炎癥性皮膚病之一，是一種免疫介導的慢性炎癥性遺傳性皮膚病。其特征是明顯的紅斑，帶白色鱗片的斑塊，潛在的病理機制涉及先天免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)之間的復雜相互作用。該病的發(fā)生具有病程長、難以快速治愈、易復發(fā)等特點，這對于患者的身體、心理、精神等均造成嚴重的影響［1］。目前關于銀屑病的發(fā)病原因和機制尚無定論，但普遍認為與遺傳和環(huán)境相關［2］。銀屑病屬中醫(yī)學“白疕”“干癬”“松皮癬”范疇?，F(xiàn)代著名的中醫(yī)皮膚病專家，趙炳南教授結合自身的多年經(jīng)驗和臨床體會，認為血熱是人體最常見的一種內在致病因素，并認為其可能是導致銀屑病發(fā)病的主要原因之一。

土茯苓是百合科植物光葉菝葜的干燥根莖，性味甘、淡、平，歸肝、胃經(jīng)，具有解毒、除濕、通利關節(jié)的功效［3］?，F(xiàn)代藥理學研究表明，土茯苓具有抗脂質過氧化、抗炎免疫、鎮(zhèn)痛以及抑菌［4-9］等作用。

目前，有關土茯苓治療銀屑病的相關研究主要以臨床試驗為主，關于其作用機制方面的研究相對不足。本研究通過網(wǎng)絡藥理學的研究方法，對土茯苓治療銀屑病的有效成分和作用靶點進行預測和分析，探討土茯苓在治療銀屑病過程中可能發(fā)生的作用機制，為其在臨床上的應用提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 土茯苓活性成分獲取與篩選

利用TCMSP平臺（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）對土茯苓活性成分進行挖掘，依據(jù)藥代動力學參數(shù)（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME），將口服生物利用度（OB）>30，藥物相似度（DL）>0.18作為篩選條件［10］，對土茯苓活性成分進行篩選并將篩選結果作為潛在研究對象。利用Perl語言對潛在對象再次篩選，剔除在TCMSP平臺無法檢索出靶點信息的活性成分，將剩下的活性成分作為研究對象。

1.2 土茯苓化學成分靶點獲取與收集

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫的“靶點預測（related targets）”功能，對土茯苓入血活性成分的作用靶點進行檢索。以“人類”為檢索物種，利用蛋白質數(shù)據(jù)庫UniProt（http：www.uniprot.org/）進行檢索，導出檢索結果并使用Perl語言工具對預測的靶點名稱進行校正。

1.3 銀屑病靶點的獲取與收集

以“Psoriasis”為關鍵詞，分別對GeenCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）以及OMIM（https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫進行檢索，獲取與銀屑病相關的靶點，并對檢索結果進行合并、去重。利用R語言（https：www.r-project.org/）對土茯苓活性成分相關靶點和銀屑病相關疾病靶點取交集，獲得土茯苓的活性成分和治療銀屑病的靶點。

1.4 構建藥物－成分－靶點－疾病網(wǎng)絡

利用Cytoscape 3.7.1軟件來成功構建土茯苓治療銀屑病的“藥物－成分－靶點－疾病”網(wǎng)絡關系圖。整個網(wǎng)絡構建并展示了土茯苓在治療銀屑病過程中藥物－成分－靶點－疾病之間的關系，為深入分析土茯苓治療銀屑病的作用機制提供依據(jù)。

1.5 蛋白質互作（pvotein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡的構建

利用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）對土茯苓治療銀屑病過程中有關蛋白之間的相互作用進行預測。STRING數(shù)據(jù)庫以不同方式獲得的預測結果的評分作為依據(jù)，評價PPI結果的置信度，分值越高，其PPI結果的可信度越高。利用STRING數(shù)據(jù)庫中“Multiple Proteins”這一功能，輸入土茯苓治療銀屑病的關鍵靶點，設置物種為“人類（homo sapiens）”進行檢索，構建相應PPI網(wǎng)絡。

1.6 基因本體（GO）信息注釋及京都基因和基因組百科全書（kyoto encycloppedia genes and genomes，KEGG）通路富集分析

以R語言為平臺，運用Bioconductor基因組數(shù)據(jù)分析工具及ClusterProfiler程序包進行GO信息注釋和KEGG信號通路富集分析。

2 結果

2.1 土茯苓活性成分篩選結果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索，以OB>30，DL>0.18作為條件篩選后得到土茯苓潛在有效成分15個，結果見表1。

表1 土茯苓入血活性成分及其OB和DL值

2.2 土茯苓治療銀屑病的潛在作用靶點預測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫預測篩選得到土茯苓入血活性成分的作用靶點326個，去除重復數(shù)據(jù)后保留土茯苓入血活性成分作用靶點166個。利用GeenCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫收集銀屑病相關靶點3943個，合并去重后獲得疾病靶點3907個。運用R語言將土茯苓有效成分的靶點和銀屑病相關靶點取交集，獲得土茯苓入血活性成分治療銀屑病的共同靶點107個，表明土茯苓在治療銀屑病的過程中具有多靶點的作用特征。

2.3 土茯苓治療銀屑病的藥物－成分－靶點－疾病網(wǎng)絡構建

通過Cytoscape工具對土茯苓治療銀屑病作用關系進行網(wǎng)絡圖的繪制及分析，得到土茯苓在治療銀屑病過程中發(fā)揮重要作用的活性成分12個，12個活性成分與對應靶點之間存在的相互作用關系，結果見圖1。網(wǎng)絡中的節(jié)點度值（degree）和中介中心度值（betweenness centrality）用來衡量節(jié)點在網(wǎng)絡中的核心度。在網(wǎng)絡中，重要程度越高的節(jié)點，位置越核心，其度值也就越高。本研究結果表明，槲皮素、柚皮素、β谷甾醇、薯蕷皂素等土茯苓有效成分及前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、前列腺素G/H合成酶1（PTGS1）等靶點是整個網(wǎng)絡的核心節(jié)點，表明這些節(jié)點是土茯苓治療銀屑病的關鍵有效成分或靶點。結果見表2。

圖1 土茯苓治療銀屑病的藥物－成分－靶點－疾病網(wǎng)絡圖

表2 土茯苓治療銀屑病的藥物－成分－靶點－疾病網(wǎng)絡關鍵節(jié)點及拓撲學特征

2.4 土茯苓治療銀屑病的關鍵靶點PPI網(wǎng)絡分析

登錄STRING數(shù)據(jù)庫，上傳土茯苓活性成分治療銀屑病的靶點蛋白，設置置信度＞0.9，得到相對應的靶點蛋白PPI網(wǎng)絡。結果見圖2。利用R語言對網(wǎng)絡中關鍵靶點信息進行抽取并繪制關鍵靶點信息條形圖。結果見圖3。結果表明，JUN、腫瘤壞死因子（tumor necresis factor，TNF）、絲/蘇氨酸激酶1（serine threonine kinase 1，AKT1）、有絲分裂激活蛋白激酶1（mitotic activated protein kinase 1，MAPK1）等在網(wǎng)絡中度值較高，表明這些蛋白在網(wǎng)絡中的作用十分重要，相對于網(wǎng)絡中其他蛋白，這些蛋白可能起到一個橋梁作用，使其互相作用。

圖2 土茯苓治療銀屑病關鍵靶點PPI網(wǎng)絡圖

圖3 土茯苓治療銀屑病關鍵靶點信息條形圖

2.5 GO注釋結果及KEGG信號通路富集分析結果

以R語言為平臺，P<0.05為條件，利用Bioconductor工具及ClusterProfiler工具對土茯苓治療銀屑病的靶點進行GO信息注釋及KEGG信號通路富集分析。GO注釋結果顯示，茯苓治療銀屑病的關鍵靶點富集顯著的前3個生物功能分別為：受體配體活性（19個靶點）、細胞因子受體結合（17個靶點）、細胞因子活性（15個靶點）。這就表明土茯苓有效成分可以通過調控多個生物學過程進而實現(xiàn)治療銀屑病的目的。結果見圖4。

圖4 土茯苓治療銀屑病關鍵靶點基因生物功能注釋信息

以P<0.05為條件，KEGG富集。以P值和富集基因數(shù)量作為篩選條件進行分析，結果見圖5。根據(jù)KEGG富集結果，土茯苓治療銀屑病的關鍵基因顯著富集細胞色素P450對外源物質的代謝（metabolism of xenobiotics by cytochror P450）和色氨酸代謝（Tryptophan metabolism）這2個生物代謝上。

圖5 土茯苓治療銀屑病作用靶點KEGG富集氣泡圖

3 討論

土茯苓治療銀屑病的主要有效成分為槲皮素、柚皮素、β谷甾醇、薯蕷皂素。槲皮素是自然界中的一種黃酮類化合物，其分子式中2、3位間有雙鍵，且有2個羥基，具有很強的生物活性，有抗氧化及清除自由基的作用，除此之外，還具有抗癌、抗炎和抗菌等生理活性［11］。柚皮素是一種廣泛存在于蕓香科植物中的二氫黃酮類化合物，國外研究證明柚皮素有抗菌、抗炎、抗氧化、抗纖維化等多種功能［12］。Vafeiadou K等［13］研究發(fā)現(xiàn)柚皮素也能抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）/干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）誘導的一氧化氮合酶表達和一氧化氮產(chǎn)生的神經(jīng)膠質細胞，從而顯示出較強的抗炎活性。β－谷甾醇是存在于多種植物中的一種主要膳食甾醇［14］，主要具有一定的抗炎作用，還具有抗增殖作用。

網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，PTGS2、PTGS1等可能是土茯苓治療銀屑病的關鍵作用靶點。前列腺素內過氧化物合酶（PTGS），又名環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX），具有COX-1和COX-2 2個亞型。Garshick MS等［15］發(fā)現(xiàn)COX-1與銀屑病的嚴重程度和血管健康受損直接相關，除此之外，在通過對血小板轉錄譜分析后還發(fā)現(xiàn)，COX-1信號是銀屑病嚴重程度、血小板活性和內皮細胞炎癥之間的重要聯(lián)系。

PPI研究結果顯示，JUN、TNF、AKT1、MAPK1、IL-6等蛋白可能在土茯苓治療銀屑病過程中具有重要作用。研究表明，JUN蛋白在多種炎癥細胞中均有表達，具有活化、增殖炎癥細胞的作用，可能與某些細胞因子和炎癥遞質增多有關［16］。TNFα是一種能夠介導多種炎癥反應的促炎細胞因子，研究表明，TNF-α可通過加重炎癥反應、加重角質細胞異常從而加重銀屑病的癥狀［17］。在銀屑病患者中，經(jīng)常能觀察到表皮角質層中核物質的滯留，核降解是角質形成細胞終末分化和角質層薄膜形成的關鍵階段，角質細胞是表皮屏障功能的主要組成部分。

KEGG富集結果表明，細胞色素P450對外源物質的代謝和色氨酸代謝可能是參與土茯苓治療銀屑病機制的主要生物代謝過程。細胞色素P450是哺乳動物皮膚中因異生物暴露而產(chǎn)生的最廣泛、最重要的一類藥物代謝酶。同時，細胞色素P450在皮膚內源性和外源性底物代謝中起著重要的作用。此外，在一些皮膚病中，如銀屑病，許多細胞色素P450都是升高的［18］。因此不難發(fā)現(xiàn)，細胞色素P450與銀屑病密切相關。色氨酸代謝途徑通過吲哚胺2，3－雙加氧酶（IDO）和隨后產(chǎn)生的kynurenine促進免疫抑制，色氨酸代謝的上調對上皮細胞具有抗寄生和抗菌作用。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡藥理學的研究方法對土茯苓治療銀屑病的作用機制進行探討挖掘，結果表明，土茯苓在治療銀屑病的過程中通過多個活性成分、作用靶點以及生物代謝發(fā)揮作用，而非通過某一單一機制發(fā)揮作用，其作用機制具有多靶點的特征。本研究結果是基于網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)挖掘理論進行的探討，希望能為土茯苓進一步開發(fā)利用提供新的思路，但其結果仍需通過實驗來進行進一步的驗證。