高 宇，王 棟，劉麗坤，王晞星

（山西省中醫(yī)院，山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原030012）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是惡性度高且致命的泌尿系惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，全球每年新增病例約33.8萬例，死亡有14.24萬人［1］。局限性RCC的5年存活率為65%，而轉(zhuǎn)移性RCC 5年存活率降至10%～20%［2］，目前我國大部分RCC患者病理類型為腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC），占比70%～75%［3］。手術(shù)切除是其根治的唯一手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率達(dá)50%［4］，靶向及免疫治療等藥物目前在臨床廣泛使用，有效率較高，但因藥品昂貴患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，藥物不良反應(yīng)較大，易產(chǎn)生耐藥，這些問題都嚴(yán)重影響了患者的臨床療效及生活質(zhì)量［5］。而中醫(yī)藥治療腎癌具有多靶點(diǎn)抑瘤、增效減毒、提高患者生存質(zhì)量、延長生存期等優(yōu)勢。腎癌歸屬于中醫(yī)學(xué)“尿血”“腎積”“腰痛”等病范疇，前期研究認(rèn)為痰瘀毒互結(jié)是腎癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，活血解毒、軟堅散結(jié)法為腎癌治療的重要法則［6］，軟堅散結(jié)方為腎癌有效臨床治療藥物。

Notch信號在腎臟發(fā)育中起關(guān)鍵作用［7］，Notch1過表達(dá)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞異常增殖［8］，異常Notch表達(dá)可能直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在ccRCC組織樣本中，發(fā)現(xiàn)Notch通路被廣泛激活［8］，但Notch信號對ccRCC的具體作用尚不明確。課題組既往研究已證實(shí)軟堅散結(jié)方可在體外抑制7860細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡［9］。本研究擬通過建立裸鼠ccRCC移植瘤模型，觀察軟堅散結(jié)方對腎透明細(xì)胞癌荷瘤裸鼠的體內(nèi)抑瘤作用，檢測瘤體組織中Notch信號通路及相關(guān)凋亡蛋白、基因的表達(dá)，探究軟堅散結(jié)方抗ccRCC的作用靶點(diǎn)及機(jī)制，為開發(fā)低毒高效的抗腎癌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物及細(xì)胞株4~6周齡SPF級BALB/c雄性裸鼠15只，體質(zhì)量（20±2）g，購于北京維通利華，合格證號：SCXK（京）2019-0009。人腎透明細(xì)胞癌7860細(xì)胞株購于中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2 藥物與試劑 軟堅散結(jié)膠囊（山西省中醫(yī)院內(nèi)部制劑，藥物組成：貓爪草、山慈菇、莪術(shù)、枸橘、夏枯草、浙貝母、壁虎、雞內(nèi)金、醋山甲、牡蠣，批號：AZ20090347）；Notch通路抑制劑DAPT（5 mg/支，Med Chem Express，批號：GSI-IX）；RPMI1640培養(yǎng)液（Corning公司，批號：05118006）、胎牛血清（Gibco公司，批號：10270106）、0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司，批號：SH30042.01B）、鏈霉素青霉素雙抗（杭州四季青公司，批號：2018050052）、PBS緩沖溶液（Hyclone公司，批號：NZG1189）；一抗兔抗人Notch1（CST，20 μL，批號：VAL1744）、一抗兔抗人NICD（Millipore，100 μL，批號：07-1232）、一抗兔抗人Bax（Abcam公司，10 μL，批號：ab32503）、一抗鼠抗人Bcl-2（Abcam公司，10 μL，批號：ab196495）、二抗（Abcam公司，批號：AR1017）、蘇木素-伊紅（HE）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0105S）、DAB顯色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0203）、RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：AR0102）；Notch1、Bax、Bcl-2引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成；免疫組化試劑盒（批號：18001）、RNA抽提試劑盒（批號：B0004DP），購自南京Biomiga公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾科技公司，型號：Cytoperm 2），低溫臺式離心機(jī)（美國Thermo公司，型號：H1650-W/H1650W）；倒置熒光生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號：CX23）；實(shí)時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號：7900）；石蠟包埋機(jī)（德國Leica公司，型號：EG 1150H）；Excelsior全自動全封閉脫水機(jī)（德國Leica公司，型號：TP 1020）；F325旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（德國Leica公司，型號：EG 1150C）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模 參照文獻(xiàn)［1］，裸鼠腋下皮膚接種對數(shù)生長期7860細(xì)胞懸液，0.1 mL/只（1×108個/mL），隔日觀察腫瘤生長情況及小鼠一般情況。

1.2.2 分組與給藥 選擇15只BALB/c裸鼠，適應(yīng)環(huán)境7 d后，隨機(jī)編號，分為模型組、軟堅散結(jié)方組、DAPT組3組，每組5只。參照《中藥藥理研究方法學(xué)》［11］換算裸鼠等效劑量為成人臨床用量的15倍，以此設(shè)定軟堅散結(jié)方組給藥劑量為46.8 g/kg，予灌胃給藥，3 d停1 d，DAPT組按5 mg/kg配DMSO-PBS溶液腹腔注射，模型組予等量的DMSO-PBS腹腔注射，各組腹腔給藥，1次/4 d。

1.2.3 計算瘤體積及抑瘤率 給藥干預(yù)4周后，處死裸鼠，剝離腫瘤組織，濾紙吸干血水后稱重，并按公式計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/模型組平均瘤重）×100%。

1.2.4 HE染色觀察腫瘤組織形態(tài) 剝?nèi)〉牧鲶w經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，HE染色、封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察，并拍照保存。

1.2.5 免疫組化檢測Notch1、NICD、Bcl2、Bax蛋白的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，置0.05 M檸檬酸緩沖液中微波加熱（95℃10 min）激活抗原；0.3%過氧化氫甲醇溶液室溫孵育20 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入一抗4℃過夜孵育；加二抗，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明，中性樹脂封片，鏡檢；同時用PBS代替一抗染色作陰性對照。染色的切片在顯微鏡下有棕黃色顆粒沉著，從每張免疫組化染色切片中隨機(jī)選取5個視野，輸入病理圖像分析系統(tǒng)。按陽性細(xì)胞百分比及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個方面進(jìn)行評分。①陽性細(xì)胞百分比：無陽性細(xì)胞＝0；陽性細(xì)胞占1%～10%＝1；陽性細(xì)胞占11%～50%＝2；陽性細(xì)胞占51%～80%＝3；陽性細(xì)胞占81%～100%＝4。②陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱：陰性＝0；弱陽性＝1；中度陽性＝2；強(qiáng)陽性＝3。①②兩項(xiàng)乘積為該樣本的IHS。IHS分級：0分為（－）；1～4分為（＋）；5～8分為（＋＋）；9～12分為（＋＋＋）。

1.2.6 RT-PCR檢測Notch1、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá) 用TrIzol提取各組組織樣本總RNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)模板，按各基因引物設(shè)計PCR擴(kuò)增，檢測Notch1、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平。引物均采用Primer網(wǎng)站設(shè)計，Notch引物序列：F：5′-GTGCTGGAAGTATTTTAGCGAC-3′，R：5′-GTCCTTGCAGTACTGGTCATAC-3′，Bcl-2引物序列：F：5′-TGGGATGCCTTTGTGGAACTAT-3′，R：5′-GCTGATTTGACCATTTGCCTGA-3′，Bax引物序列：F：5′-GAGCGAGTGTCTCCGGCGAATT-3′，R：5′-GCCACAAAGATGGTCACTGTCTGC-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 21.0軟件和GraphPad Prism7軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差（ANVOA）分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠一般狀況及腫瘤生長情況比較

7860細(xì)胞接種后約5 d，皮下可見綠豆大小結(jié)節(jié)，質(zhì)韌，活動度差，與皮下組織粘連，后期逐漸突出體表，形狀不規(guī)則，部分瘤體出現(xiàn)破潰，成瘤率100%。實(shí)驗(yàn)期間，各組裸鼠體質(zhì)量逐漸增加，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。模型組和DAPT組后期隨著腫瘤增大飲食及活動明顯減少，軟堅散結(jié)方組食水及活動基本正常。軟堅散結(jié)方組和DAPT組均對裸鼠皮下移植瘤的生長有抑制作用，與模型組比較，平均瘤體積明顯減小，瘤質(zhì)量明顯降低（P＜0.05）。軟堅散結(jié)方組、DAPT組抑瘤率分別為46.26%和24.83%。結(jié)果見表1，圖1。

表1 各組體質(zhì)量、瘤體積、瘤體質(zhì)量比較

圖1 各組裸鼠及移植瘤生長情況

2.2 各組瘤體組織病理學(xué)表現(xiàn)

模型組見癌細(xì)胞生長旺盛，體積較大且排列紊亂，形態(tài)不一，呈立方形、楔形、片狀等；胞漿呈透明狀；細(xì)胞核大且深染，呈圓形、卵圓形或怪異型；間質(zhì)有豐富的毛細(xì)血管。軟堅散結(jié)方組、DAPT組凋亡細(xì)胞增多，可見凋亡細(xì)胞與鄰近細(xì)胞分離，細(xì)胞核濃縮甚至消失，胞質(zhì)呈明顯嗜酸性，凋亡小體可見。結(jié)果見圖2。

圖2 各組裸鼠瘤體組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（HE，×200）

2.3 免疫組化檢測各組Notch1、NICD、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

在7860細(xì)胞移植瘤中，Notch1、NICD、Bcl-2、Bax蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色或黃色著色，其中Notch-1、Bcl-2、Bax陽性表達(dá)為胞質(zhì)染色，而NICD表達(dá)主要位于細(xì)胞胞核，各組陽性細(xì)胞百分率和顯色強(qiáng)度均有差異性（圖3）。與模型組比較，軟堅散結(jié)方組、DAPT組Notch1、NICD、Bcl-2蛋白陽性表達(dá)明顯減少（P<0.05），Bax蛋白陽性率明顯增高（P<0.05）。與DAPT組相比，軟堅散結(jié)方組NICD、Bcl-2陽性率明顯下降，Bax陽性率明顯增高（P<0.05）。結(jié)果見表2。

圖3 各組裸鼠瘤體組織Notch1，NICD，Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響（×40）

表2 各組瘤體組織中Notch1、NICD、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) ±s（）

表2 各組瘤體組織中Notch1、NICD、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) ±s（）

注：與模型組比較，1）P＜0.05；與DAPT組比較，2）P＜0.05

組別 Notch1 NICD Bcl-2 Bax模型組 3.45±0.38 3.26±0.34 4.67±0.67 1.33±0.33 DAPT組 1.4±0.171）1.79±0.321）2.33±0.331）1.67±0.341）軟堅散結(jié)方組1.04±0.231）1.13±0.231）2）0.33±0.341）2）8.00±1.001）2）

2.4 各組Notch1、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)情況

7860裸鼠移植瘤組織各基因表達(dá)情況，與模型組相比，DAPT組、軟堅散結(jié)方組Notch1、Bcl-2表達(dá)顯著降低（P＜0.05），Bax表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與DAPT組比較，軟堅散結(jié)方組Notch1 mRNA表達(dá)無明顯差異；Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)差異顯著。結(jié)果見圖4。

圖4 各組裸鼠Notch1、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)

3 討論

中藥是腫瘤治療重要手段之一，臨床療效確切，特別是在減毒增效，預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，防治并發(fā)癥，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，中藥復(fù)方抗腫瘤的機(jī)制也成為學(xué)術(shù)界研究熱點(diǎn)。惡性腫瘤屬中醫(yī)癥瘕、積聚范疇，痰瘀毒互結(jié)是其發(fā)生發(fā)展的主要病機(jī)。軟堅散結(jié)法屬于八法之一的消法，廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤的治療，療效確切［12］。黃洋等［13］研究表明，軟堅扶正湯聯(lián)合DP化療方案（多西他賽聯(lián)合順鉑），可有效改善患者臨床癥狀，并提高臨床療效?；A(chǔ)研究表明，龍葵提取物龍葵多糖可通過調(diào)控Caspase-3和Bcl-2抑制荷瘤小鼠腫瘤生長［14］；夏枯草通過調(diào)控激活子蛋白-1（activator protein 1，AP-1）、核因子（nuclear factor κB，NF-κB）、P38、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelical grouth factor，VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallo proteinase 9，MMP-9）等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移［15］。白花蛇舌草乙醇提取物能夠通過阻斷絲/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase，Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated mprotein kinase，MAPK）、轉(zhuǎn) 錄 激 活 因 子3（transcription activator 3，STAT3）等信號通路誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖［16］。山西省中醫(yī)院制劑軟堅散結(jié)膠囊，由貓爪草、山慈菇、莪術(shù)、夏枯草、浙貝母等藥物組成，本研究證明，軟堅散結(jié)方對腎透明細(xì)胞癌荷瘤鼠移植瘤具有明顯的生長抑制作用，且荷瘤鼠對軟堅散結(jié)方具有良好的耐受性，未見明顯不適及不良反應(yīng)，能下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2，上調(diào)促凋亡因子Bax蛋白及基因的表達(dá)，進(jìn)一步明確軟堅散結(jié)方通過凋亡途徑抑制腎透明細(xì)胞癌生長。

Notch信號通路具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等作用，Notch缺乏或減少會導(dǎo)致腎臟發(fā)育異常并直接影響腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。Notch通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，已有研究表明，它是T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）和頭頸癌的致癌途徑［17-19］。Notch信號獨(dú)立于VHL/HIF通路，在腎細(xì)胞癌中發(fā)揮著重要作用［20］，組織芯片檢測和TCGA數(shù)據(jù)顯示，腎透明細(xì)胞癌組織中Notch表達(dá)明顯增加［8］，Notch1基因過表達(dá)導(dǎo)致腎臟細(xì)胞過度增殖，同時Notch1配體Jagged1的高表達(dá)降低了腎癌患者總生存期和無病生存期［21］。敲除Notch信號可下調(diào)Myc和Cyclin A1的表達(dá)阻斷ccRCC細(xì)胞生長周期，抑制增殖［8］；Notch抑制劑處理后的裸鼠可以有效抑制腎癌細(xì)胞移植瘤生長［25］。團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，軟堅散結(jié)方促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系7860凋亡，其機(jī)制是通過阻斷Notch1及凋亡信號通路［22］。為此，本研究在前期基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明軟堅散結(jié)方通過阻斷Notch信號（DAPT組）可抑制7860細(xì)胞裸鼠移植瘤生長，并下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax等凋亡因子；軟堅散結(jié)方組與DAPT組比較，具有更明顯的抑瘤作用，下調(diào)Notch1表達(dá)與DAPT作用相當(dāng)，與DAPT組相比，NICD、Bcl-2顯著下降，Bax表達(dá)顯著上升，說明軟堅散結(jié)方通過抑制Notch通路調(diào)控相關(guān)凋亡因子抑制腎透明細(xì)胞癌癌組織生長，這與既往在體、離體實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致［8，20］。其中NICD為Notch剪切后的胞內(nèi)段，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合形成NICD/CSL復(fù)合體，激活下游通路，而本研究中軟堅散結(jié)方對NICD有更強(qiáng)的調(diào)控作用，推測軟堅散結(jié)方可能阻滯了Notch1的切割，或在核內(nèi)阻斷NICD/CSL復(fù)合體的形成，或軟堅散結(jié)方協(xié)同阻滯Notch相關(guān)交叉通路共同誘導(dǎo)凋亡。

綜上所述，軟堅散結(jié)方可有效抑制移植瘤腫瘤生長，其作用機(jī)制可能與靶向阻斷Notch信號表達(dá)，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。值得注意的是，軟堅散結(jié)方相比DAPT阻斷劑具有更明顯抑瘤效果及促凋亡作用，這可能是中藥多組分多通路多靶點(diǎn)協(xié)同調(diào)控的結(jié)果。本研究涉及的蛋白表達(dá)較少，且未涉及交叉通路，軟堅散結(jié)方對裸鼠腎透明細(xì)胞癌的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。