龔光遠(yuǎn)，張文軍△，陳 蘭

1.重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 401420；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400016

目前，隨著生物醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，膿毒癥的發(fā)病機(jī)制已得到初步明確。但膿毒癥的病死率仍居高不下，膿毒癥作為一類(lèi)急性炎癥性疾病，可通過(guò)激活炎性通路，導(dǎo)致重要臟器損傷。有研究顯示，腎臟是膿毒癥引起損傷的首要臟器，腎損傷發(fā)病急且進(jìn)展快，是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的重要原因之一[1]。以往相關(guān)研究運(yùn)用缺血-再灌注損傷來(lái)解釋膿毒癥急性腎損傷的發(fā)生機(jī)制，但隨著近年來(lái)相關(guān)研究的深入，發(fā)現(xiàn)感染后機(jī)體炎性反應(yīng)的激活與放大導(dǎo)致的腎小管細(xì)胞損傷及過(guò)度凋亡是膿毒癥急性腎損傷發(fā)生與進(jìn)展的重要機(jī)制[2]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體及下游信號(hào)通路的激活是機(jī)體炎性反應(yīng)持續(xù)及放大的重要原因之一，該信號(hào)通路與炎癥性疾病的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)[3]。本研究通過(guò)觀察膿毒癥急性腎損傷患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中NLRP3表達(dá)水平，分析其與疾病發(fā)生及進(jìn)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年2月至2020年1月重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院收治的膿毒癥急性腎損傷患者154例作為膿毒癥急性腎損傷組，普通膿毒癥患者55例作為普通膿毒癥組。膿毒癥急性腎損傷組中男79例，女75例；年齡41～82歲，中位年齡60.5歲。普通膿毒癥組中男29例，女26例；年齡42～81歲，中位年齡61.2歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷膿毒癥及膿毒癥急性腎損傷患者均需滿足膿毒癥國(guó)際共識(shí)指南[4]；膿毒癥急性腎損傷患者還需滿足膿毒癥急性腎損傷診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往已存在腎功能不全的患者；合并自身免疫系統(tǒng)疾病的患者；合并惡性腫瘤的患者；近期有服用免疫抑制劑的患者。此外，選取同期門(mén)診體檢健康者50例為對(duì)照組。依據(jù)急性腎損傷診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括血清肌酐(Cr)水平和尿量，將膿毒癥急性腎損傷組分為Ⅰ期組(51例)、Ⅱ期組(52例)和Ⅲ期組(51例)。根據(jù)患者臨床結(jié)局，分為存活組(124例)和死亡組(30例)。各組間及亞組間一般臨床資料(包括性別、年齡等)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得了重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1一般資料 患者入院24 h內(nèi)收集一般臨床資料，如性別、年齡、膿毒癥感染病因(包括重癥肺炎、腹腔感染、膽道感染、外科創(chuàng)傷及其他)等，檢測(cè)患者肝功能、腎功能、血常規(guī)等指標(biāo)，收集患者24 h尿量。

1.2.2分離外周血PBMCs 抽取靜脈血2 mL，置入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，隨后加入等體積淋巴細(xì)胞分離液，經(jīng)混勻后離心，分離得到PBMCs。

1.2.3PBMCs中NLRP3和半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1) mRNA相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè) 采用qRT-PCR檢測(cè)各組單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，具體步驟如下。在各組PBMCs試管中加入1 mL Trizol，經(jīng)反復(fù)高速離心后提取總RNA，測(cè)定RNA含量。RNA反轉(zhuǎn)錄按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)賽默飛公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。NLRP3上游引物為5′-CAT GAG TGC TGC TTC GAC AT-3′；下游引物為5′-GCT TCA GTC CCA CAC AGA-3′；Caspase-1上游引物為5′-ATC GCT TTC TGC TCT TCC AC-3′；下游引物為5′-TCC TCC ACA TCA CAG GAA CA-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物為5′-AGA CAG CCG CAT CTT CTT GT-3′；下游引物為5′-CTT GCC GTG GGT AGA GTC AT-3′。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，依據(jù)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)(美國(guó)賽默飛公司)建立25.0 μL反應(yīng)體系，包括經(jīng)焦碳酸二乙酯處理的水17.5 μL、10×Taq緩沖液2.5 μL、氯化鎂2.0 μL、脫氧核糖核苷三磷酸混合物0.5 μL、上下游引物各0.5 μL、Tap酶0.5 μL。擴(kuò)增條件[6]：95 ℃預(yù)變性120 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以ΔΔCt來(lái)計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4外周血炎性因子水平的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組外周血白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)(上海信帆生物公司)。簡(jiǎn)要步驟如下：取各組空腹靜脈血4 mL，經(jīng)1 500 r/min離心5 min后收集上清液；設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)樣品孔，空白孔僅加入顯色液和終止液，標(biāo)準(zhǔn)孔加入不同水平標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，而待測(cè)樣品孔加入上清稀釋液；經(jīng)室溫孵育、洗滌后，加入抗體工作液(100微升/孔)、顯色液(100微升/孔)、終止液(50微升/孔)，最后測(cè)定各組吸光度(A)450值。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)照組、普通膿毒癥組及膿毒癥急性腎損傷組各指標(biāo)比較 普通膿毒癥組和膿毒癥急性腎損傷組外周血NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β及TNF-α水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；與對(duì)照組和普通膿毒癥組比較，膿毒癥急性腎損傷組上述指標(biāo)明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組、普通膿毒癥組及膿毒癥急性腎損傷組各指標(biāo)比較

2.2膿毒癥不同感染病因患者之間各指標(biāo)比較 膿毒癥不同感染病因患者之間外周血NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β及TNF-α水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同病因膿毒癥患者組間各指標(biāo)比較

2.3膿毒癥急性腎損傷不同分期組間各指標(biāo)比較 根據(jù)膿毒癥急性腎損傷病情嚴(yán)重程度，不同分期組間外周血NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α及Cr水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，Ⅲ期組上述指標(biāo)水平最高，Ⅱ期組次之，Ⅰ期組最低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 膿毒癥急性腎損傷不同分期組間各指標(biāo)比較

2.4膿毒癥急性腎損傷不同預(yù)后組間各指標(biāo)水平比較 與膿毒癥急性腎損傷存活組患者NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α及Cr水平比較，死亡組患者上述指標(biāo)明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 膿毒癥急性腎損傷不同預(yù)后組間各指標(biāo)水平比較

2.5相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示，膿毒癥急性腎損傷患者NLRP3 mRNA水平與Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α及Cr水平呈正相關(guān)(r=0.802、0.720、0.621、0.633，P<0.05)。

2.6NLRP3 mRNA水平區(qū)分膿毒癥是否并發(fā)腎損傷及評(píng)估膿毒癥急性腎損傷組預(yù)后的ROC曲線分析 以NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平區(qū)分膿毒癥并發(fā)腎損傷與未并發(fā)腎損傷的AUC為0.787(95%CI：0.703～0.872)，最佳截?cái)嘀禐?.31，其靈敏度和特異度分別為74.51%和74.55%，其AUC稍大于Cr、Caspase-1 mRNA、IL-1β和TNF-α，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；以NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平區(qū)分膿毒癥急性腎損傷組存活和死亡的AUC為0.872(95%CI：0.790～0.954)，最佳截?cái)嘀禐?.65，其靈敏度和特異度分別為85.00%和75.55%，其AUC明顯大于Cr、Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

注：A為區(qū)分膿毒癥并發(fā)腎損傷與未并發(fā)腎損傷的ROC曲線；B為區(qū)分膿毒癥急性腎損傷組存活和死亡的ROC曲線。

3 討 論

急性腎損傷是膿毒癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為腎功能進(jìn)行性衰退，是預(yù)測(cè)膿毒癥患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7]。目前，隨著相關(guān)臨床研究的持續(xù)深入，已有研究者對(duì)常規(guī)指標(biāo)如血清Cr及急性生理與慢性健康狀況評(píng)分(APACHEⅡ)等在膿毒癥急性腎損傷病情評(píng)估中的作用進(jìn)行了相關(guān)研究，但上述指標(biāo)靈敏度或特異度不高[8-9]。針對(duì)膿毒癥急性腎損傷，如何通過(guò)有效的指標(biāo)來(lái)評(píng)估其病情及預(yù)后，是臨床面臨的重大難題。

目前，膿毒癥急性腎損傷的發(fā)病機(jī)制仍不明確，腎缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙及微小RNA等均可能參與了其發(fā)病過(guò)程[10-13]。隨著近年來(lái)相關(guān)研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)，炎性反應(yīng)的激活與放大是膿毒癥發(fā)生及進(jìn)展的重要因素，抑制炎性反應(yīng)是膿毒癥臨床治療的重要手段[14]。免疫炎性小體的激活是促進(jìn)下游炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)因子之一，在免疫炎性小體分類(lèi)中，NLRP3是重要成員之一，參與了天然免疫系統(tǒng)的構(gòu)建[15]。有研究者發(fā)現(xiàn)，NLRP3在細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可激活下游Caspase-1/IL-1β及TNF-α通路，是促進(jìn)炎性反應(yīng)的重要信號(hào)通路之一，抑制NLRP3的激活，可抑制炎性反應(yīng)的靶點(diǎn)[16]。NLRP3可表達(dá)于人體外周血PBMCs，通過(guò)檢測(cè)PBMCs中NLRP3相對(duì)表達(dá)水平，可反映機(jī)體炎性反應(yīng)強(qiáng)度。相關(guān)研究顯示，在急性胰腺炎患者中，PBMCs中NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯升高，其與患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后呈一定的相關(guān)性[17]。同樣作為炎癥性疾病之一，膿毒癥急性腎損傷患者外周血PBMCs中NLRP3及下游信號(hào)通路水平如何，目前尚不明確。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥急性腎損傷患者NLRP3及下游炎性信號(hào)通路呈明顯激活狀態(tài)，主要表現(xiàn)為外周血PBMCs中NLRP3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯升高。進(jìn)一步檢測(cè)相關(guān)炎性細(xì)胞因子水平，外周血IL-1β和TNF-α水平也明顯升高，與NLRP3和Caspase-1變化趨勢(shì)一致。NLRP3炎性信號(hào)通路的激活，是膿毒癥急性腎損傷病情進(jìn)展的重要因素，通過(guò)檢測(cè)不同嚴(yán)重程度患者NLRP3及下游相關(guān)指標(biāo)水平，結(jié)果提示隨著患者病情進(jìn)展，上述指標(biāo)水平均進(jìn)行性升高。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已表明，NLRP3的激活與急性腎損傷的作用機(jī)制與激活下游炎性通路，促進(jìn)腎小管細(xì)胞發(fā)生凋亡或焦亡，破壞蛋白酶-抗蛋白酶平衡，降解細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)[18-20]。既往發(fā)現(xiàn)的膿毒癥急性腎損傷預(yù)后評(píng)估的相關(guān)指標(biāo)如血清Cr、尿蛋白等，特異度相對(duì)偏低，本研究ROC曲線分析顯示，NLRP3 mRNA對(duì)膿毒癥急性腎損傷預(yù)后的評(píng)估價(jià)值較高，其AUC大于血清Cr、Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α指標(biāo)。

綜上所述，NLRP3下游信號(hào)通路的激活與膿毒癥急性腎損傷的發(fā)生及病情進(jìn)展密切相關(guān)，外周血PBMCs中NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平不僅可作為患者預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)，還可能成為未來(lái)該類(lèi)疾病治療的靶點(diǎn)。但由于該研究入選患者樣本量偏少，下一步需要擴(kuò)大樣本量，采取多中心聯(lián)合的方式加以驗(yàn)證。