牟 丹, 楊 帆, 卡著才讓, 祁學(xué)忠, 顧智輝, 謝久祥*, 李希來*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2. 河南蒙古族自治縣自然資源局林業(yè)站， 青海 黃南 811599)

高加索三葉草(TrifoliumambiguumBieb.)，又稱庫拉三葉草(Kura clover)，是一種生長(zhǎng)相對(duì)低矮、具有多分枝深根的根莖型多年生草本植物[1]，也是豆科三葉草屬中唯一具有地下根蘗和利用根蘗進(jìn)行強(qiáng)克隆性生長(zhǎng)的多年生長(zhǎng)壽命草種[2]。該草具有廣泛的生態(tài)位，從近海平面至高海拔地區(qū)均可生長(zhǎng)[3]；還具有很強(qiáng)的抗寒、耐水淹、抗旱和耐牧等特性[4]。據(jù)報(bào)道，高加索三葉草能在海拔3 500～3 700 m的青海省河南蒙古自治縣(河南縣)3處試驗(yàn)地形成克隆植株，并自然越冬[5-6]。河南縣地處青藏高原東部，高原大陸性氣候較明顯，表現(xiàn)為氣候嚴(yán)寒，晝夜溫差大，無霜期短，極端低溫、倒春寒等災(zāi)害天氣時(shí)有發(fā)生[7-8]。高加索三葉草在河南縣的成功越冬說明其能夠適應(yīng)該地區(qū)的低溫天氣。

植物面臨低溫脅迫時(shí)，可通過合成并積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來降低細(xì)胞冰點(diǎn)溫度，增強(qiáng)細(xì)胞保水力，緩和細(xì)胞低溫結(jié)晶，從而避免脫水傷害[9]。氨基酸及其衍生物是參與植物滲透調(diào)節(jié)的重要有機(jī)物質(zhì)之一，在植物遭受低溫和水分等逆境時(shí)會(huì)大量積累[10]。低溫脅迫下，植物體內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量迅速上升，積累的自由基與細(xì)胞膜相互作用，從而對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育造成危害[11]。為清除體內(nèi)ROS并維持其平衡，植物主要依靠酶類和非酶類兩種抗氧化防御系統(tǒng)，其中非酶類抗氧化防御系統(tǒng)主要包括抗壞血酸、類黃酮和酚類等物質(zhì)[12]。類黃酮化合物是植物體內(nèi)的一類次生代謝產(chǎn)物，可作為強(qiáng)抗氧化劑、自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑等，在植物響應(yīng)多種逆境方面起著重要作用[13]。

代謝組學(xué)被稱為新的“組學(xué)”之一，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)后又一門用于研究系統(tǒng)生物學(xué)的科學(xué)[14]，被認(rèn)為是植物基因組和表型之間的橋梁，已廣泛應(yīng)用于植物響應(yīng)低溫脅迫的研究[8]。目前，關(guān)于高加索三葉草響應(yīng)低溫脅迫的代謝組學(xué)研究卻鮮見報(bào)道。本課題組于2015 年將高加索三葉草從新西蘭引種到河南縣，發(fā)現(xiàn)該植物的綠期較長(zhǎng)，于當(dāng)年11月初枯黃，在10月處于正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并于次年5月返青。據(jù)前期氣象觀測(cè)，河南縣春秋季節(jié)晝夜溫差大，且時(shí)有零下低溫發(fā)生(2015年至2018年間的5月和10月極端低溫分別達(dá)-6℃和-13℃，極端高溫分別為19℃和18℃)，這無疑會(huì)對(duì)正處于返青或正常生長(zhǎng)的高加索三葉草造成一定的低溫傷害。植物面臨低溫脅迫時(shí)，會(huì)通過產(chǎn)生一些代謝物并調(diào)節(jié)其含量來抵御低溫[15]。為此，本研究對(duì)高加索三葉草進(jìn)行以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)聯(lián)用的廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)，比較分析不同降溫模式低溫脅迫處理與常溫處理間高加索三葉草葉片代謝物的變化，篩選響應(yīng)低溫脅迫的關(guān)鍵代謝物，以期探討高加索三葉草響應(yīng)低溫脅迫的代謝機(jī)制，為耐寒植物新品種培育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為高加索三葉草的育成品種‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’(TrifoliumambiguumBied‘Mengnong clover No.1’)，種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)王明玖教授提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年5—8月在青海大學(xué)校內(nèi)牧草試驗(yàn)地和草業(yè)科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將種子播種到含混合基質(zhì)的花盆中。60 d后將長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗轉(zhuǎn)移到低溫人工氣候箱(光照12 h、晝夜溫度20℃/18℃、光照強(qiáng)度12 000 lx、濕度60%)適應(yīng)性培養(yǎng)30 d。試驗(yàn)分3組：常溫對(duì)照組(CK)、緩慢降溫組(Gradual cooling,GC)和驟然降溫組(Sudden cooling,SC)，每組均為3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)具體處理及采樣過程同牟丹等[7]研究中的處理及采樣過程。采樣完成后，將剪取的葉片立即置于液氮速凍并放入-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 代謝物提取與檢測(cè)

取出-80℃超低溫冰箱中冷凍保存的高加索三葉草葉片，對(duì)其進(jìn)行真空冷凍干燥，然后利用研磨儀研磨(30 Hz)1.5 min，稱取100 mg的粉末，利用含0.1 mg·L-1利多卡因作為內(nèi)標(biāo)的70%甲醇1.0 mL于4℃提取過夜。提取后，10 000 g離心10 min，吸取上清，用微孔濾膜(孔徑0.22 μm)過濾樣品，將過濾液保存在進(jìn)樣瓶中用后續(xù)分析。同時(shí)，由樣本提取物混合制備質(zhì)控樣本(Quality control,QC)，用于樣本重復(fù)性分析。

數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(Ultra performance liquid chromatography,UPLC)和串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem mass spectrometry,MS/MS)。UPLC分析條件主要包括：色譜柱：C18柱(1.8 μm×2.1 mm×100 mm)；流動(dòng)相：水相為超純水(加入0.04%的乙酸)，有機(jī)相為乙腈(加入0.04%的乙酸)；洗脫梯度：0 min(水/乙腈95∶5 V/V)，11.0 min(水/乙腈5∶95 V/V)，12.0 min(水/乙腈5:95 V/V)，12.1 min(水/乙腈95∶5 V/V)，15.0 min(水/乙腈95∶5 V/V)；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40℃；進(jìn)樣：2 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

代謝產(chǎn)物分析采用多元統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析法(Principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析法(Orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)；差異代謝物(Differential metabolites,DMs)的篩選利用OPLS-DA和單變量統(tǒng)計(jì)分析T檢驗(yàn)相結(jié)合的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-MS/MS鑒定結(jié)果

通過UPLC-MS/MS技術(shù)平臺(tái)對(duì)常溫對(duì)照組和低溫脅迫組樣品進(jìn)行分析，共檢測(cè)到894個(gè)代謝物。這些代謝物主要屬于有機(jī)酸及其衍生物(檸檬酸、草酸和蘋果酸等)、黃酮(木犀草素、芹菜素和蕓香柚皮苷等)和氨基酸衍生物(亮氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等)等23個(gè)類型。

2.2 UPLC-MS/MS數(shù)據(jù)多元統(tǒng)計(jì)分析

由圖1的PCA得分圖可以看出，GC組與CK組間的模型累計(jì)解釋率為 77.3，SC組與CK組間的模型累計(jì)解釋率79.7，說明各組樣本間的總體代謝差異較明顯。圖2所示，GC組與CK組間的模型主要質(zhì)量參數(shù)為R2X=0.783，R2Y=0.999，Q2=0.99，SC組與CK組間的模型主要質(zhì)量參數(shù)為R2X=0.842，R2Y=1，Q2=0.994，表明該模型可靠，能很好地?cái)M合不同處理之間代謝物的差異情況。

圖1 不同降溫模式低溫脅迫下代謝物的PCA得分圖

2.3 差異代謝物的篩選

本研究依據(jù)OPLS-DA模型參數(shù)VIP得分值(VIP ≥ 1)及T檢驗(yàn)的P值(P< 0.05)篩選不同降溫模式低溫脅迫處理與常溫處理間(即GC-vs-CK和SC-vs-CK)的差異代謝物(Differential metabolites,DMs)，且當(dāng)某一代謝物含量的差異倍數(shù)(即處理組含量與對(duì)照組含量的比值)大于1時(shí)認(rèn)為該代謝物上調(diào)，小于1時(shí)認(rèn)為該代謝物下調(diào)。與CK相比，在GC組中篩選出124個(gè)DMs(49個(gè)上調(diào)，75個(gè)下調(diào))，在SC組中篩選出139個(gè)DMs(64個(gè)上調(diào)，75個(gè)下調(diào))。GC和SC處理組的DMs均屬于氨基酸及衍生物和有機(jī)酸及衍生物等19個(gè)類型(表1)。此外，通過韋恩分析直觀展示了GC和SC這 2個(gè)處理組中共有或特有的DMs。由圖3所示，2個(gè)處理組共同擁有103個(gè)DMs；GC組特有21個(gè)DMs，SC組特有36個(gè)DMs。

圖3 不同降溫模式低溫脅迫下DMs的韋恩圖

2.4 DMs的富集分析

為了解不同降溫模式低溫脅迫下高加索三葉草葉片中代謝物質(zhì)的總體代謝途徑，分別對(duì)GC和SC這2個(gè)處理組的DMs進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路注釋，即將各個(gè)DMs對(duì)應(yīng)的KEGG編號(hào)映射到KEGG網(wǎng)站中。由KEGG通路注釋總覽表可看出(表2)，2個(gè)處理組的DMs均主要富集在氨基酸代謝和次生代謝產(chǎn)物生物合成2個(gè)類別中。此外，為篩選不同降溫模式低溫脅迫下顯著性差異變化的代謝通路，對(duì)2個(gè)處理組的DMs進(jìn)行了通路富集分析。如圖4的富集分析結(jié)果所示，GC和SC處理組的DMs均在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、丁酸代謝、組氨酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝和氨酰tRNA生物合成5通路顯著富集(P<0.05)；而SC組的DMs還在β-丙氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝和甘油酯代謝通路中顯著富集(P<0.05)。

表2 不同降溫模式低溫脅迫下DMs的KEGG通路注釋

圖4 不同降溫模式低溫脅迫處理下DMs的代謝通路富集圖

2.5 響應(yīng)低溫脅迫的關(guān)鍵代謝物分析

為了比較分析響應(yīng)低溫脅迫的關(guān)鍵代謝物變化情況，本研究對(duì)GC和SC這2個(gè)處理組的DMs結(jié)合通路富集情況進(jìn)行整理，繪制了簡(jiǎn)化代謝圖(圖5)。該圖涉及多條重要的代謝途徑，例如淀粉和蔗糖代謝、三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle,TCA)、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、苯丙烷生物合成和類黃酮生物合成等代謝通路。圖5直觀地反映了不同降溫模式低溫脅迫處理與常溫處理間的代謝物變化情況，從整體上可看出低溫脅迫對(duì)氨基酸代謝和類黃酮生物合成過程中的代謝物種類和含量影響較大，對(duì)TCA循環(huán)和糖代謝過程中的代謝物種類和含量影響較小(因各代謝物含量的值較大，圖中不方便展示，故本文用差異倍數(shù)進(jìn)行展示)。氨基酸代謝過程中，與CK相比，在GC和SC這2個(gè)處理組中，亮氨酸、賴氨酸和4-氨基丁酸(別名：γ-氨基丁酸，Gamma-aminobutyric acid,GABA)的含量均極顯著增加(P<0.01)，天冬氨酸的含量均顯著增加(P<0.05)，谷氨酸和脯氨酸的含量均極顯著下降(P<0.01)；而酪氨酸的含量?jī)H在SC組顯著增加(P<0.05)。類黃酮生物合成過程中，與CK相比，在GC和SC這2個(gè)處理組中，矢車菊素的含量均顯著上調(diào)(P<0.05)；木犀草素的含量也均上調(diào)，且上調(diào)的差異倍數(shù)均最大，分別達(dá)到598 518.52和291 851.85；而紫鉚因的含量?jī)H在GC組顯著上調(diào)(P<0.05)，新橙皮苷的含量?jī)H在SC組顯著上調(diào)(P<0.05)。TCA循環(huán)過程中，與CK相比，在GC和SC這2個(gè)處理組中，僅有檸檬酸的含量均極顯著上調(diào)(P<0.01)。糖代謝過程中，與CK相比，在GC和SC這2個(gè)處理組中，尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)的含量均增加，而蔗糖的含量均極顯著降低(P<0.01)。

圖5 不同降溫模式低溫脅迫處理下的DMs變化情況

3 討論

低溫脅迫可導(dǎo)致植物形態(tài)和生理生化等方面改變，如滲透保護(hù)劑積累、抗氧化劑合成、代謝途徑改變等[16]。本研究通過對(duì)不同降溫模式低溫脅迫處理與常溫處理的高加索三葉草葉片代謝物進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)GC和SC這2個(gè)處理組的代謝物含量相較CK均有顯著變化。進(jìn)一步篩選，在2個(gè)處理組中均得到大量的DMs，這些DMs均主要屬于氨基酸及衍生物和有機(jī)酸及衍生物等類型。GC組的DMs數(shù)量較SC組少，說明高加索三葉草響應(yīng)驟然降溫的代謝組變化可能更強(qiáng)烈，可通過產(chǎn)生更多種類的代謝物來抵御突然的零下低溫。從總體代謝途徑看，GC和SC處理組的DMs均主要富集在氨基酸代謝和次生代謝產(chǎn)物的生物合成中，說明這2個(gè)代謝類別在高加索三葉草面臨不同降溫模式低溫脅迫時(shí)均具有重要作用。

氨基酸是植物體內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能直接或是間接對(duì)環(huán)境中的壓力(溫度、水分、鹽堿等)做出響應(yīng)[17-18]，其含量常在低溫脅迫下增加[19]。本研究中，GC和SC處理組的GABA、亮氨酸、組氨酸和賴氨酸等氨基酸及衍生物的含量在低溫脅迫后均顯著增加，推測(cè)積累這些氨基酸是高加索三葉草在低溫脅迫下維持滲透平衡的一種策略。GABA作為一種非蛋白氨基酸，在應(yīng)激反應(yīng)中扮演的角色與脯氨酸類似，可通過增強(qiáng)抗氧化酶活性和減少活性氧積累來減輕逆境對(duì)植物的傷害[20]。本研究中，GABA含量在常溫處理下幾乎為零，而在不同降溫模式低溫脅迫下卻大量增加，這和Mazzucotelli等[21]的研究結(jié)果類似，說明高加索三葉草可能通過合成大量的GABA來減輕低溫脅迫造成的傷害。亮氨酸屬于支鏈氨基酸(Branched chain amino acids,BCAAs)，而BCAAs在包括冷脅迫在內(nèi)的非生物脅迫條件下普遍積累，且可作為保護(hù)性滲透劑[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)GC和SC這2個(gè)處理組中的亮氨酸含量均顯著上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)分別是26.05和43.17，可看出該物質(zhì)對(duì)維持低溫脅迫下高加索三葉草葉片的滲透平衡起著重要作用。組氨酸、賴氨酸和半胱氨酸等氨基酸被認(rèn)為是抗氧化氨基酸[24]，因易于與-OH或-SH發(fā)生反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)抗氧化能力[25]。因此，推測(cè)低溫脅迫后顯著增加的組氨酸和賴氨酸在高加索三葉草抗氧化過程發(fā)揮了一定的作用。

另一方面，本研究還發(fā)現(xiàn)部分氨基酸及衍生物的含量在不同降溫模式的低溫脅迫下均有所降低，其中谷氨酸含量在GC和SC處理組中均顯著降低，這與趙春旭等人[8]的研究結(jié)果類似。谷氨酸參與多種與植物抗逆相關(guān)的非蛋白氨基酸(如GABA)或蛋白氨基酸(如脯氨酸和精氨酸)的合成，可被谷氨酸脫羧酶直接轉(zhuǎn)化為GABA，還可被谷氨酸脫氫酶脫氨生成α-酮戊二酸進(jìn)入TCA循環(huán)[26]。因此，結(jié)合本研究中GABA含量在2個(gè)處理組均大量增加的結(jié)果，說明高加索三葉草葉片中谷氨酸可能被轉(zhuǎn)化為了GABA，也可能被轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸參與到和抗逆相關(guān)的TCA循環(huán)之中[27]。脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、保護(hù)蛋白質(zhì)分子和活性氧清除劑等在植物抗寒方面扮演著多種角色，并在植物面臨低溫脅迫時(shí)表現(xiàn)為普遍積累[28]。然而，本研究中不同降溫模式的低溫脅迫均使高加索三葉草葉片脯氨酸含量降低，推測(cè)隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，高加索三葉草某些組織或器官因受傷害無法產(chǎn)生更多的脯氨酸，也可能因?yàn)樯嫌魏铣筛彼岬那绑w物質(zhì)谷氨酸含量減少使其積累速率小于分解速率，最終導(dǎo)致含量降低。賈向榮[29]發(fā)現(xiàn)黃精(Polygonatum.sibiricumRed.)葉片脯氨酸含量在低溫脅迫4 h內(nèi)呈下降趨勢(shì)，并在脅迫4 h時(shí)含量降到最低值，這與本研究結(jié)果相似。酪氨酸是合成多酚類化合物的芳香族氨基酸之一[30]，而多酚類化合物具有良好抗氧化能力，可通過消除自由基活性來保護(hù)組織免受氧化損害[31]。本研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸的含量?jī)H在SC組顯著增加，說明高加索三葉草面臨驟然降溫時(shí)，可能通過合成更多的酪氨酸來促進(jìn)多酚類化合物的合成，從而清除體內(nèi)多余的自由基，進(jìn)一步減少驟然降溫對(duì)其的傷害。

有機(jī)酸(特別是TCA循環(huán)中的有機(jī)酸)含量可反映植株的生長(zhǎng)和代謝活性[32]。TCA循環(huán)是連接糖代謝和氨基酸代謝的重要樞紐，能為植物提供能量，在植物遭遇逆境時(shí)起著重要作用[33]。本研究中，作為TCA循環(huán)中間產(chǎn)物之一的檸檬酸，其含量在GC和SC這2個(gè)處理組中均顯著增加，分別是CK的6.11倍和10.79倍。由此說明，低溫脅迫下，高加索三葉草體內(nèi)TCA循環(huán)可能被增強(qiáng)，進(jìn)而產(chǎn)生更多的能量以補(bǔ)充抵御低溫期間的能量消耗，同時(shí)驗(yàn)證了前文谷氨酸含量降低的情況。此結(jié)果與低溫脅迫下梭梭(Haloxylonammodendron)幼苗的代謝響應(yīng)情況較為相似[34]。

類黃酮化合物是植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，具備抗氧化、清除自由基的活性，低溫環(huán)境更有利于其合成與積累[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)高加索三葉草經(jīng)不同降溫模式低溫脅迫處理后，葉片中多種類黃酮化合物的含量顯著增加。其中，GC和SC處理組中的矢車菊素和木犀草素2種類黃酮化合物的含量均顯著高于CK，推測(cè)高加索三葉草可通過積累矢車菊素來提高抗氧化能力從而增強(qiáng)其抗寒力，還可通過積累木犀草素來清除體內(nèi)過多的自由基，進(jìn)而提高低溫脅迫下的抗氧化能力，這分別與齊睿[37]對(duì)四季秋海棠(Begoniasimperflorens)和Kim等[38]對(duì)寬葉胡枝子(Lespedezamaximowiczii)的研究結(jié)果類似。據(jù)報(bào)道，同屬類黃酮的紫鉚因和新橙皮苷也具抗氧化作用[39-41]。本研究中，紫鉚因含量?jī)H在GC組顯著增加，而新橙皮苷含量?jī)H在SC組顯著增加，說明高加索三葉草在面臨不同降溫模式的低溫脅迫時(shí)，可能采用不同的抗低溫策略，即紫鉚因可能在緩慢降溫中起重要作用，而新橙皮苷可能在驟然降溫中起重要作用。

4 結(jié)論

本研究通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)在高加索三葉草葉片中共檢測(cè)出894種代謝物，并發(fā)現(xiàn)緩慢降溫和驟然降溫2處理組中的部分代謝物含量均與常溫對(duì)照組存在顯著差異(P<0.05)。差異代謝物均主要富集在氨基酸代謝和次生代謝物生物合成類別；紫鉚因的含量?jī)H在緩慢降溫組中顯著增加(P<0.05)，酪氨酸和新橙皮苷的含量?jī)H在驟然降溫組中顯著增加(P<0.05)；GABA、亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、檸檬酸、矢車菊素和木犀草素的含量在緩慢降溫和驟然降溫2處理組中均顯著增加(P<0.05)，這些代謝物可作為高加索三葉草響應(yīng)低溫脅迫的關(guān)鍵代謝物。