高峻鷹 李慶隆 耿乾書(shū)

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍(recurrent oral ulcer，ROU)，又稱(chēng)為復(fù)發(fā)性阿弗他性口炎，是口腔潰瘍性疾病的常見(jiàn)形式，最常見(jiàn)形式，影響著全球多達(dá)5%～20%的人口，其特點(diǎn)是該病可在口腔黏膜的任何位置出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)圓形或橢圓形的潰瘍，具有良性和自限性的特點(diǎn)，但經(jīng)常復(fù)發(fā)，伴有明顯的疼痛，常導(dǎo)致患者口腔功能障礙[1-2]。ROU的治療包括含漱劑、含片、散劑、局部封閉等局部治療方法，以及免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑和增強(qiáng)劑等全身治療方法，但在治療期間患者依從性較差，整體治療效果不佳[3]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在臨床廣泛使用，對(duì)ROU的治療表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，可預(yù)防患者口腔潰瘍遠(yuǎn)期發(fā)作[4]。中醫(yī)理論認(rèn)為，口腔潰瘍與正氣虧虛、脾胃虛寒有關(guān)[5]。理中湯具有補(bǔ)氣健脾、溫中祛寒之功效，已有多項(xiàng)研究報(bào)道，理中湯及其加味方對(duì)ROU疾病具有較好的治療效果，能夠使?jié)兠娣e縮小，疼痛減輕，胃脘疼痛、反酸燒心等其他伴有癥狀亦得到明顯改善，但其作用機(jī)制尚不清晰[6～7]。長(zhǎng)期以來(lái)，NF-κB信號(hào)通路被認(rèn)為是經(jīng)典的促炎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，IκB在IKK的激活作用下被磷酸化，磷酸化的IκB被進(jìn)一步泛素化而被蛋白酶降解，釋放出NF-κB二聚體并進(jìn)入細(xì)胞核，NF-κB信號(hào)通路被激活后，可增加TNF-α等基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而增加炎癥因子的釋放，激活機(jī)體的炎癥反應(yīng)并使其擴(kuò)大化和持續(xù)化[8～9]。免疫法ROU模型，即通過(guò)弗氏佐劑和口腔黏膜組織均漿建立的大鼠ROU模型，從癥狀表現(xiàn)和病理學(xué)檢查方面均與人類(lèi)ROU的發(fā)作相似，可從造模后第3周至第8周內(nèi)持續(xù)出現(xiàn)多個(gè)潰瘍病灶，目前已被廣泛用于口腔潰瘍實(shí)驗(yàn)研究中[10～11]。本研究通過(guò)免疫法建立大鼠ROU模型探討理中湯加味對(duì)大鼠ROU的修復(fù)作用及其對(duì)NF-κB炎癥通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

72 只6 周齡Wistar大鼠(180～220 g)，雌雄各半(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。許可證號(hào)：SCXK(京)2017-0011。飼養(yǎng)條件：室溫(22±2)℃，濕度(50±10)%，每天定時(shí)換氣，保持12 h：12 h光暗照明，食水不限。

1.2 藥品與試劑

理中湯加味方(黨參、黃芪、茯苓各20 g，白術(shù)、干姜各15 g，炮附子、五味子、山藥各10 g，炙甘草5 g，康美藥業(yè)股份有限公司)；醋酸潑尼松龍注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司)；完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich,美國(guó))；ELISA試劑盒(武漢Elabscience公司)；實(shí)驗(yàn)所需兔單抗及羊抗兔二抗(CST公司，美國(guó))；蘇木精和伊紅染色液、ECL發(fā)光液(北京Solarbio公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模 隨機(jī)選取12 只大鼠，于無(wú)菌環(huán)境下在其口腔黏膜處注射生理鹽水，剝離口腔黏膜，放置于組織研磨器中，加入0.1 mol/L，pH=7.4的PBS緩沖液研磨成勻漿，再加入等量的完全弗氏佐劑，混合均勻直至呈無(wú)分層的乳狀液，即為組織乳化劑。將剩余的60 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及理中湯高劑量、中劑量和低劑量組，除正常組之外的其余組大鼠均采用免疫法建立ROU模型，具體方法：將各組大鼠脊柱兩側(cè)脫毛備皮，消毒，在脊柱兩側(cè)分別皮內(nèi)注射0.1 mL組織乳化劑，每周1次，連續(xù)8周，正常組大鼠采用同樣的方法在相同位置注射等體積的生理鹽水[11]。8 周后，觀(guān)察各組大鼠口腔潰瘍形成情況，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、理中湯高劑量、理中湯中劑量和理中湯低劑量組大鼠均成功建立ROU模型，存活大鼠的數(shù)量分別為：8 只、9 只、9 只、9 只、8 只。大鼠的唇黏膜、頰黏膜以及口底部呈現(xiàn)多個(gè)呈橢圓或圓形的潰瘍面，表面有灰黃色假膜，邊緣整齊，直徑1～2 mm。

1.3.2 藥液制備 取理中湯加味方諸藥，用蒸餾水浸泡12 h，其中炮附子先煎煮1 h，再加入其余藥材煎煮40 min，共重復(fù)3 次，將所有藥液濃縮至4 g/mL(即每毫升含生藥量為4 g)，分裝后儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用。

1.3.3 給藥方法 從第9周開(kāi)始，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃給予20 mL/kg的醋酸潑尼松龍注射液(1 mg/mL)，理中湯高劑量組、中劑量組和低劑量組大鼠分別給予40、20、10 g/kg的理中湯加味方藥液，給藥體積為1 mL/100 g，正常組和模型組大鼠灌胃給予相同劑量生理鹽水，1 次/d，連續(xù)20 d。

1.3.4 理中湯加味對(duì)大鼠口腔潰瘍數(shù)量、持續(xù)和間隔時(shí)間的影響 觀(guān)察并記錄大鼠口腔潰瘍數(shù)量、持續(xù)和間隔時(shí)間，測(cè)量給藥前一天及給藥后5、10、15、20 d時(shí)大鼠口腔潰瘍面積，取平均值。潰瘍面積(mm2)=π×d1×d2×1/4，π取值3.14，d1和d2分別為口腔潰瘍的最大橫徑和最大縱徑。

1.3.5 ELISA試劑盒檢測(cè)理中湯加味對(duì)大鼠血清中炎癥因子水平的影響 最后一次給藥后2 h后，麻醉大鼠，通過(guò)腹主動(dòng)脈穿刺取血，分離出血清用于ELISA試劑盒檢測(cè)，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，檢測(cè)并計(jì)算血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

1.3.6 HE染色觀(guān)察口腔黏膜病變 1.3.5的實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分離各組動(dòng)物口腔潰瘍區(qū)域的組織，分割成適宜大小的組織塊后固定48 h，制作石蠟組織標(biāo)本和病理切片(將石蠟組織塊置于切片機(jī)上制成厚度為4 μm的組織切片)，然后行常規(guī)HE染色，封片后于光鏡下觀(guān)察口腔黏膜病變。

1.3.7 Western blot檢測(cè)潰瘍組織NF-κB炎癥通路蛋白表達(dá) 取口腔黏膜組織，稱(chēng)重，剪碎，加入細(xì)胞裂解液研磨勻漿并離心，提取組織蛋白，并用BCA法確定濃度，按照20 μg/孔的蛋白量常規(guī)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，把轉(zhuǎn)印后的PVDF膜加入一抗溶液(1∶2 000)中4 ℃孵育過(guò)夜，次日洗膜，放入二抗溶液(1∶2 000)中在37 ℃恒溫箱中孵育2 h，再次清洗后滴加適量發(fā)光試劑，放入凝膠成像儀中顯影。Image J軟件用于獲取目標(biāo)蛋白的灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠口腔潰瘍的改善情況

截止到取材當(dāng)天，除正常組大鼠未出現(xiàn)口腔潰瘍之外，其余組均出現(xiàn)口腔潰瘍，潰瘍面不規(guī)則，表面覆有白色假膜，周?chē)つび屑t腫、充血。陽(yáng)性對(duì)照組、理中湯高劑量組、中劑量組和低劑量組大鼠口腔潰瘍得到一定程度改善，潰瘍面縮小，陽(yáng)性對(duì)照藥物和理中湯高劑量的治療效果優(yōu)于理中湯中劑量和低劑量組(圖 1)。HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠口腔黏膜角化層、顆粒層、棘層和基底層結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞外滲。模型組大鼠口腔黏膜上皮層細(xì)胞脫落，棘層松散，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，亦可見(jiàn)紅細(xì)胞外滲現(xiàn)象。與模型組比較，其余各組大鼠口腔黏膜組織的炎癥浸潤(rùn)程度均減輕，黏膜組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，這種作用在陽(yáng)性對(duì)照組和理中湯高劑量組中更加顯著(圖 2)。在潰瘍數(shù)量、潰瘍持續(xù)和間隔時(shí)間方面，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、理中湯高劑量、理中湯中劑量和理中湯低劑量組大鼠的口腔潰瘍數(shù)量、持續(xù)時(shí)間減少，間隔時(shí)間增加；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，理中湯高劑量、理中湯中劑量組大鼠口腔潰瘍數(shù)量和持續(xù)時(shí)間減少，間隔時(shí)間延長(zhǎng)，理中湯低劑量組大鼠口腔潰瘍數(shù)量、持續(xù)時(shí)間則高于陽(yáng)性對(duì)照組，間隔時(shí)間短于陽(yáng)性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖 3)。復(fù)發(fā)性大鼠口腔潰瘍模型具有一定自愈性，模型組大鼠的口腔潰瘍面積隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸縮小，第20天時(shí)，除陽(yáng)性對(duì)照組、理中湯高劑量組分別有1只和2只大鼠潰瘍?nèi)坑贤?，模型組、理中湯中劑量組和低劑量組大鼠潰瘍均未完全愈合。給藥前一天，各組大鼠口腔潰瘍面積無(wú)顯著差異(P>0.05)。在給藥第5、10、15、20天時(shí)，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、理中湯高劑量、理中湯中劑量和理中湯低劑量組大鼠口腔潰瘍面積均顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，在給藥第5、10、15、20 d時(shí)，理中湯高劑量組大鼠口腔潰瘍面積顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，理中湯中劑量和理中湯低劑量組大鼠口腔潰瘍面積變化則與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖 4)。

圖 1 治療20 d時(shí)各組大鼠口腔潰瘍情況

圖 2 治療后各組大鼠口腔黏膜組織 (HE,×200)

圖 3 各組大鼠口腔潰瘍數(shù)量、持續(xù)和間隔時(shí)間比較

圖 4 各組大鼠口腔潰瘍面積變化

2.2 理中湯加味對(duì)大鼠血清中炎癥因子水平的影響

與正常組比較，其余各組IL-1β、IL-6、TNF-α均增加；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、理中湯高劑量、理中湯中劑量和理中湯低劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α均降低；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，理中湯高劑量和中劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均減少，理中湯低劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量則高于陽(yáng)性對(duì)照組，理中湯加味對(duì)大鼠血清炎癥因子的作用呈劑量依賴(lài)性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖 5)。

圖 5 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較

2.3 理中湯加味對(duì)大鼠潰瘍組織NF-κB炎癥通路的影響

與正常組比較，其余各組IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表達(dá)均增加；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、理中湯高劑量、理中湯中劑量和理中湯低劑量組大鼠口腔黏膜組織中IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表達(dá)顯著升高；陽(yáng)性對(duì)照組及理中湯高、中和低劑量組口腔黏膜IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平低于模型組；理中湯高、中劑量組口腔黏膜IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表達(dá)低于陽(yáng)性對(duì)照組，理中湯低劑量組大鼠口腔黏膜組織IKKα、p-IκBα、NF-κBp65蛋白表達(dá)則高于陽(yáng)性對(duì)照組，理中湯加味呈劑量依賴(lài)性改變大鼠口腔黏膜組織NF-κB炎癥通路蛋白表達(dá)的作用呈劑量依賴(lài)性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖 6～7)。

圖 6 Western blot法檢測(cè)NF-κB炎癥通路蛋白表達(dá)水平

圖 7 各組大鼠口腔黏膜組織NF-κB炎癥通路蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討 論

ROU是臨床常見(jiàn)口腔黏膜疾病，在中醫(yī)學(xué)屬于“口瘡”、“口糜”等范圍，臨床表現(xiàn)為口腔黏膜出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的淺表性潰瘍，伴有灼痛，給患者的生活質(zhì)量來(lái)帶不同程度的影響[12-13]。ROU的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與細(xì)菌和病毒感染、微量元素和維生素缺乏、食物和精神因素有關(guān)，西醫(yī)治療以消炎、止痛、促潰瘍愈合等對(duì)癥治療為主，尚無(wú)特效藥物，患者在治療期間的依從性較差[14]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在臨床廣泛使用，在治療ROU疾病中具有改善患者癥狀、縮短病程、治愈甚至減少?gòu)?fù)發(fā)的優(yōu)勢(shì)[15-16]。理中湯為我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)經(jīng)典名方，用于治療脾胃虛寒證，具有補(bǔ)氣健脾、溫中祛寒的功效[17]。本研究采用的理中湯加味方包括附子、干姜、黨參、黃芪、白術(shù)、茯苓、五味子、山藥、甘草等中藥，方中附子、干姜為君藥，黨參、黃芪為臣藥，白術(shù)、茯苓、五味子、山藥共為佐藥，甘草為使藥，全方藥材配伍具有溫中補(bǔ)虛、溫而不燥的特點(diǎn)，可健脾利濕、溫陽(yáng)散寒，適用于脾胃虛寒癥誘發(fā)的口腔潰瘍疾病。NF-κB信號(hào)通路是經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，有研究表明，NF-κB信號(hào)通路與ROU疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。因此，本研究以NF-κB炎癥通路為切入點(diǎn)，通過(guò)免疫法建立大鼠ROU模型，觀(guān)察理中湯加味對(duì)大鼠ROU的修復(fù)作用，分析其對(duì)NF-κB炎癥通路的影響。

結(jié)果顯示，除正常組大鼠未出現(xiàn)口腔潰瘍之外，其余大鼠均出現(xiàn)口腔潰瘍。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照藥物和不同劑量理中湯加味方可減輕大鼠口腔黏膜損傷和炎癥浸潤(rùn)，減少大鼠口腔潰瘍數(shù)量、持續(xù)時(shí)間和潰瘍面積，延長(zhǎng)間隔時(shí)間。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，除理中湯低劑量組外，高劑量和中劑量理中湯的效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物，表明不同劑量的理中湯加味方對(duì)大鼠ROU具有修復(fù)作用。ROU疾病的發(fā)生往往伴有炎癥因子水平的升高，這是創(chuàng)面愈合的必經(jīng)階段，機(jī)體出現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間炎癥反應(yīng)會(huì)影響創(chuàng)面血管新生和細(xì)胞的正常生長(zhǎng)繁殖，并可能造成機(jī)體免疫功能發(fā)生障礙，對(duì)潰瘍創(chuàng)面修復(fù)造成嚴(yán)重影響，出現(xiàn)“難愈性創(chuàng)面”，因此，降低機(jī)體炎癥因子水平對(duì)ROU疾病是具有治療作用的[19]。ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，口腔潰瘍模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子含量增加。而使用理中湯加味治療后可降低大鼠血清中炎癥因子含量。除理中湯低劑量組以外，理中湯高劑量組和中劑量組大鼠血清中炎癥因子含量均低于陽(yáng)性對(duì)照組，并呈劑量依賴(lài)性，表明理中湯加味方可降低ROU大鼠血清中炎癥因子的水平。NF-κB信號(hào)通路是經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，其中IKKα、p-IκBα、NF-κB p65在NF-κB炎癥通路的激活中具有重要作用，可參與到潰瘍性疾病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程[20-21]。Surboyo等[22]研究表明，降低NF-κB的表達(dá)對(duì)糖尿病相關(guān)口腔潰瘍的愈合有較強(qiáng)的治療作用。Xie等[23]研究證明，埃索美拉唑通過(guò)抗分泌、抑制NF-κB信號(hào)通路及抗氧化作用在應(yīng)激性潰瘍中發(fā)揮對(duì)胃的保護(hù)作用。與上述研究結(jié)果一致，在本研究中，ROU模型大鼠潰瘍組織中IKKα、p-IκBα、NF-κB p65等蛋白表達(dá)顯著高于正常大鼠，使用理中湯加味治療后，上述蛋白的表達(dá)水平則被顯著降低。除理中湯低劑量組以外，理中湯高劑量組和中劑量組IKKα、p-IκBα、NF-κB p65蛋白表達(dá)均低于陽(yáng)性對(duì)照組，并呈劑量依賴(lài)性，表明理中湯加味方可抑制NF-κB信號(hào)通路在ROU疾病中的活化。

綜上所述，理中湯加味方可以減少大鼠口腔潰瘍的發(fā)病頻率，縮短潰瘍愈合時(shí)間，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB炎癥通路發(fā)揮對(duì)口腔潰瘍黏膜的修復(fù)作用。但ROU疾病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，理中湯加味方是否通過(guò)其他途徑發(fā)揮抗?jié)兗梆つば迯?fù)作用仍需進(jìn)一步深入探討。