梅志杰,楊慧娟,陳夢(mèng)杰,郭園園,潘 艷,徐 宇,孫 妍,梁金寶,楊小淮*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科,蚌埠 233000;2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科;3蚌埠醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院;4蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院;*通訊作者,E-mail:yxhyhr@163.com)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種慢性代謝性疾病,主要特點(diǎn)表現(xiàn)為血糖異常升高,從而引起嚴(yán)重的并發(fā)癥,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是糖尿病的常見(jiàn)形式,主要占糖尿病病例的90%[1,2]。根據(jù)最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)證實(shí):目前全球大約有5億人罹患糖尿病,到2045年,全球糖尿病患者人數(shù)將達(dá)到7億左右,盡管對(duì)于糖尿病診斷和治療愈發(fā)完善,但目前糖尿病仍是巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[3]。近年來(lái),糖尿病引起的男性生殖功能異常引起人們的廣泛關(guān)注,流行病學(xué)研究表明90%的糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)生育功能紊亂[4]。糖尿病患者男性不育率較高,可能是由于持續(xù)的高血糖刺激,炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激影響生殖器官、細(xì)胞及生殖激素等[5-7]。作為炎癥反應(yīng)的重要組成部分,已有研究證實(shí)NLRP3炎性小體通路參與了糖尿病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[8,9]。

鈉-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2,SGLT-2)抑制劑是近年來(lái)上市的新型降糖藥物,廣泛用于T2DM的治療,達(dá)格列凈是SGLT-2抑制劑的一種。研究證實(shí),達(dá)格列凈(dapagliflozin)通過(guò)降低血糖、血壓、甘油三酯及胰島素抵抗發(fā)揮對(duì)腎臟、心臟等保護(hù)效應(yīng)[10-12]。Ye等[13]研究證實(shí)達(dá)格列凈可以降低NLRP3炎性小體的表達(dá),從而保護(hù)糖尿病所造成的心臟損害,隨后Birnbaum等[14]亦證實(shí)了達(dá)格列凈抑制NLRP3炎性小體的表達(dá)對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。近年來(lái)越來(lái)越多的研究證實(shí)達(dá)格列凈亦可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)降低糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[15,16]。但達(dá)格列凈是否對(duì)糖尿病誘導(dǎo)的睪丸損害具有保護(hù)效應(yīng)尚未有報(bào)道,故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立2型糖尿病模型,觀察糖尿病大鼠睪丸損害情況,并用達(dá)格列凈干預(yù),觀察其對(duì)睪丸是否具有保護(hù)作用并探討具體機(jī)制,為開(kāi)發(fā)出藥物新用途提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠,清潔級(jí),8周齡左右,體質(zhì)量200-220 g,購(gòu)買于蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(豫)2019-0002。大鼠飼養(yǎng)于溫度、濕度適宜的動(dòng)物房,并進(jìn)行12 h明暗循環(huán),自由進(jìn)食、飲水。本研究嚴(yán)格按照蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)要求進(jìn)行(批準(zhǔn)號(hào):2020-227)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)于北京索萊寶公司,達(dá)格列凈購(gòu)于阿斯利康中國(guó)制藥公司,丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒、蘇木精伊紅染料均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司,Trizol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司,RT-PCR試劑盒購(gòu)于日本Takara公司。NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1和GAPDH引物均由上海生工生物工程公司所合成,序列見(jiàn)表1。

表1 用于RT-PCR分析的引物序列

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 T2DM模型的建立及干預(yù)方式 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常組(NC組,n=6)和T2DM模型組(n=12)。正常組喂食基礎(chǔ)飼料;T2DM模型組喂食高糖高脂飼料[17](67%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、0.5%膽酸鈉),喂養(yǎng)4周后,禁食12 h,T2DM模型組一次性腹腔注射45 mg/kg的STZ,正常組則腹腔注射等劑量的枸櫞酸緩沖液進(jìn)行對(duì)照。72 h后尾靜脈采血測(cè)量空腹血糖(FBG),以空腹血糖≥16.7 mmol/L確定為T2DM模型建立成功。將建模成功的大鼠分為T2DM組和達(dá)格列凈組(Dap組),用0.5%的羧甲基纖維素鈉將達(dá)格列凈片劑配制成1 mg/ml的溶液,灌胃劑量為每天10 mg/kg[18],正常組和T2DM組則灌以等量的羧甲基纖維素鈉溶液。連續(xù)灌胃8周后,處死大鼠,收集血液、睪丸。

1.3.2 空腹血糖及血睪酮的檢測(cè) 禁食12 h后,用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,將大鼠置于解剖臺(tái),打開(kāi)腹腔后腹主動(dòng)脈采血留取血標(biāo)本,于全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)空腹血糖及血睪酮(testosterone)含量。

1.3.3 睪丸組織病理學(xué)檢測(cè) 按照上述方法處死大鼠后,取出睪丸組織,在預(yù)冷PBS中沖洗2遍后濾紙吸干并稱重,計(jì)算睪丸質(zhì)量系數(shù),睪丸質(zhì)量系數(shù)(TW/BW)=(睪丸質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量)×100%。一側(cè)睪丸保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)氧化應(yīng)激及RT-PCR檢測(cè)。另一側(cè)睪丸則用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后,切片進(jìn)行HE染色,至少由2位資深病理專家于顯微鏡下讀片,觀察睪丸組織生精小管及各層生精細(xì)胞改變情況。

1.3.4 睪丸MDA和SOD指標(biāo)的檢測(cè) 稱取30 mg睪丸組織,加入300 μl PBS,制備10%的睪丸勻漿液。4 ℃,12 000g將勻漿液離心15 min,收集上清,BCA測(cè)定勻漿液濃度后,按照試劑盒所述比色法檢測(cè)MDA及氮藍(lán)四唑(NBT)顯色法檢測(cè)SOD含量。

1.3.5 RT-PCR檢測(cè)睪丸組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA的水平 通過(guò)Trizol試劑從睪丸組織中提取總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green Super Mix試劑盒,以2 μl cDNA為模板,總體積為20 μl的體系,條件為:預(yù)變性,95 ℃,180 s;以變性:95 ℃,30 s;退火:6 0℃,30 s;延伸72 ℃,15 s,反應(yīng)45個(gè)循環(huán)。用PT-PCR儀分析Ct值,用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀況

除了NC組,T2DM組與Dap組大鼠均出現(xiàn)飲水、飲食增多,小便增多,墊料潮濕,體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)。

2.2 各組大鼠空腹血糖水平

與NC組比較,T2DM組大鼠空腹血糖明顯增多[(7.66±1.54)mmol/Lvs(28.93±2.13)mmol/L,P<0.001];經(jīng)過(guò)達(dá)格列凈治療8周后,Dap組大鼠血糖值較T2DM組明顯降低[(28.93±2.13)mmol/Lvs(20.12±3.47)mmol/L,P<0.001,見(jiàn)圖1]。

與NC組相比,***P<0.001,與T2DM組相比,###P<0.001圖1 各組大鼠空腹血糖變化情況Figure 1 Changes of fasting blood glucose(FBG) in rats

2.3 各組大鼠血睪酮水平

與NC組比較,T2DM組大鼠血清睪酮含量明顯降低[(1.62±0.25)μg/Lvs(0.47±0.09)μg/L,P<0.001];經(jīng)過(guò)達(dá)格列凈治療后,Dap組大鼠睪酮值較T2DM組明顯增加[(0.47±0.09)μg/Lvs(0.91±0.12)μg/L,P<0.001,見(jiàn)圖2]。

與NC組相比,***P<0.001,與T2DM組相比,###P<0.001圖2 各組大鼠血清睪酮變化情況Figure 2 Changes of serum testosterone in rats

2.4 各組大鼠睪丸質(zhì)量系數(shù)變化

相比于NC組的大鼠睪丸質(zhì)量系數(shù),造模后T2DM組大鼠睪丸質(zhì)量系數(shù)明顯增加[(0.80±0.10)%vs(1.33±0.13)%,P<0.001];達(dá)格列凈干預(yù)后,睪丸質(zhì)量系數(shù)較T2DM組明顯下降[(1.33±0.13)%vs(1.00±0.07)%,P<0.001,見(jiàn)圖3]。

與NC組相比,***P<0.001,與T2DM組相比,###P<0.001圖3 各組大鼠睪丸質(zhì)量系數(shù)變化Figure 3 Changes of TW/BW in rats

2.5 各組大鼠睪丸病理學(xué)改變

HE染色觀察三組大鼠睪丸組織形態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn):NC組大鼠生精小管中精原細(xì)胞核大而圓,貼于基膜內(nèi),排列整齊,各級(jí)精母細(xì)胞層數(shù)清晰可見(jiàn),近管腔側(cè)可見(jiàn)大量精子細(xì)胞,管腔內(nèi)充滿精子;T2DM組生精小管形態(tài)明顯受損,各級(jí)生精細(xì)胞減少,層數(shù)減少,排列紊亂,腔內(nèi)精子明顯減少;Dap組精原細(xì)胞較T2DM組明顯增多,各級(jí)精母細(xì)胞層數(shù)及數(shù)量較T2DM組增多,腔內(nèi)可見(jiàn)少量精子(見(jiàn)圖4)。這些結(jié)果均表明糖尿病可導(dǎo)致睪丸發(fā)生病理?yè)p害,達(dá)格列凈可改善糖尿病誘導(dǎo)的睪丸功能障礙。

黑色箭頭所指為生精細(xì)胞;黑色三角形所指為精子圖4 各組大鼠睪丸病理結(jié)構(gòu)變化情況 (HE染色,×200)Figure 4 Pathological changes of the testis in rats (HE staining,×200)

2.6 各組大鼠MDA和SOD水平

結(jié)果表明,T2DM組MDA水平較NC組明顯增多(P<0.001),而T2DM組SOD水平較NC組明顯下降(P<0.01)。達(dá)格列凈治療后,Dap組MDA水平較T2DM組顯著下降(P<0.001),SOD水平則明顯升高(P<0.05,見(jiàn)圖5)。

與NC組相比,**P<0.01,***P<0.001；與T2DM組相比,#P<0.05,###P<0.001圖5 各組大鼠睪丸MDA和SOD水平Figure 5 The levels of MDA, SOD in the testes of rats

2.7 各組大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA的表達(dá)情況

與NC組比較,T2DM組大鼠睪丸組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.001),達(dá)格列凈治療后,Dap組大鼠上述基因相對(duì)表達(dá)量較T2DM組顯著下降(P<0.01,見(jiàn)圖6)。

與NC組相比,***P<0.001,與T2DM組相比,##P<0.01,###P<0.001圖6 各組大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平Figure 6 The levels of NLRP3, ASC, Caspase-1, IL-1β, TNF-α, TGF-β1 mRNA in rats

3 討論

隨著生活方式及生活環(huán)境的改變,T2DM已經(jīng)成為一種全球流行病,其伴隨而來(lái)的并發(fā)癥對(duì)全球健康構(gòu)成主要威脅。除了人們熟知的心臟、腎臟損害,近年來(lái)T2DM所并發(fā)的生殖系統(tǒng)損傷引起了人們的廣泛關(guān)注[19,20]。持續(xù)的高血糖刺激,可以改變精液質(zhì)量,誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡,破壞血-睪屏障,抑制睪丸激素分泌等,從而損害男性患者生育能力[21,22]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ,破壞胰島β細(xì)胞,建立T2DM模型。本研究發(fā)現(xiàn),造模后大鼠出現(xiàn)多飲、多食和多尿等臨床表現(xiàn),空腹血糖增加,體質(zhì)量減輕,睪丸質(zhì)量系數(shù)增加,睪丸發(fā)生萎縮。組織學(xué)結(jié)果表明睪丸生精小管發(fā)生明顯變化,生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少,血清睪酮值下降,這一系列結(jié)果均提示糖尿病刺激導(dǎo)致睪丸功能障礙。

近年來(lái),作為炎性反應(yīng)重要組成部分,NLRP3/ASC/Caspase-1炎性小體通路與多種炎癥性疾病如痛風(fēng)、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等關(guān)系備受關(guān)注,NLRP3炎性小體的激活可以導(dǎo)致活性Caspase-1及IL-1β產(chǎn)生,分泌的IL-1β促進(jìn)TNF-α、IL-6等炎性因子的分泌,從而增強(qiáng)了機(jī)體炎癥反應(yīng)[23-25]。NLRP3炎性小體通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激關(guān)系密切,活性氧(ROS)可以激活NLRP3促進(jìn)組織炎癥并激活免疫反應(yīng)[26]。越來(lái)越多的研究證實(shí)氧化應(yīng)激在T2DM的并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用,MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要指標(biāo),代表性抗氧化物質(zhì)SOD可以保護(hù)組織免受自由基的損害。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),抑制MDA、增加SOD的產(chǎn)生,可以明顯改善T2DM并發(fā)的睪丸損害[27],Liu等[28]亦證實(shí)降低NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),對(duì)T2DM并發(fā)的腎臟具有保護(hù)作用。T2DM模型建立成功后,我們觀察到大鼠睪丸組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯增加,提示糖尿病可能激活NLRP3/ASC/Caspase-1炎癥小體通路,引起促炎基因IL-1β、TNF-α的表達(dá)量增加,介導(dǎo)睪丸損害,MDA含量增加,SOD含量降低,提示糖尿病可能通過(guò)NLRP3炎性體通路介導(dǎo)睪丸組織發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)。研究證實(shí),TGF-β1參與調(diào)節(jié)類固醇的合成、精子的生成與發(fā)育等,持續(xù)的血糖刺激可誘導(dǎo)TGF-β1大量表達(dá),從而誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致睪丸功能障礙[29,30]。我們發(fā)現(xiàn)T2DM組大鼠TGF-β1 mRNA表達(dá)水平較NC組顯著增加,并觀察到睪酮水平下降及生精細(xì)胞明顯受損。

達(dá)格列凈抑制腎小管SGLT-2減少葡萄糖的吸收,促進(jìn)其排泄,從而獨(dú)立于胰島素而降低葡萄糖水平,降糖效果優(yōu)于其他傳統(tǒng)藥物。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)達(dá)格列凈可降低機(jī)體炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等過(guò)程,從而改善糖尿病所造成的并發(fā)癥損害。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn),達(dá)格列凈通過(guò)抑制NLRP3炎性小體信號(hào)及氧化應(yīng)激水平來(lái)降低糖尿病損害[31]。本研究發(fā)現(xiàn),達(dá)格列凈治療后,可明顯降低T2DM大鼠的血糖水平及睪丸質(zhì)量系數(shù),血睪酮值增加,睪丸生精細(xì)胞數(shù)量增多,損傷減輕。本研究亦發(fā)現(xiàn),與模型組比較,達(dá)格列凈干預(yù)后NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α和TGF-β1的表達(dá)量明顯下調(diào),過(guò)氧化指標(biāo)MDA明顯下降,抗氧化指標(biāo)SOD顯著增多,該結(jié)果提示達(dá)格列凈可能通過(guò)抑制NLRP3炎性小體增加機(jī)體抗炎癥、抗氧化反應(yīng),減輕糖尿病所并發(fā)的睪丸損傷。

綜上所述，在T2DM所并發(fā)的睪丸損傷中,達(dá)格列凈可以降低NLRP3炎性小體,降低睪丸組織發(fā)生炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激從而改善糖尿病大鼠睪丸損害,為臨床上治療男性糖尿病生殖系統(tǒng)疾病提供新思路。