肖會敏,楊 旭,羅歡歡,李雨欣,李 捷,林 奮,羅定強,王四旺*

(1陜西鳳丹正元生物科技有限公司研發(fā)部,西安 710077;2西北大學生命科學與醫(yī)學部;3空軍軍醫(yī)大學中藥與天然藥物教研室;4陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院;*通訊作者,E-mail:wangsiw@fmmu.edu.cn)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)花瓣為牡丹屬毛茛科芍藥屬灌木的花瓣。牡丹花瓣作為特色的天然生物資源和新資源食品,在我國有悠久的藥用和食用歷史,《四川中藥志》中記載:牡丹花性平、苦、淡,具有調(diào)經(jīng)活血的功能,主治月經(jīng)不調(diào),痛經(jīng)。牡丹花花瓣富含黃酮類化合物[1-7];牡丹花中含有單萜糖苷類化合物如吡啶芍藥苷、芍藥苷等及酚酸類化合物如沒食子酸和沒食子酸甲酯等[1,7,8]。芍藥苷有抗神經(jīng)細胞氧化、抑制神經(jīng)炎癥、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[9-13];沒食子酸及其衍生物有抗菌、抗病毒、抗腫瘤作用[14],可調(diào)控宮頸癌HeLa細胞的凋亡及具有抗炎、抗突變等活性[15,16]。牡丹花瓣對酒精性肝炎有保護作用[17]。雖然牡丹花瓣有廣泛的藥理活性,但目前尚無國家或地方藥材標準。我國有大面積的牡丹種植基地如陜西合陽與蒲城、安徽亳州、河南洛陽、云南等地,資源極為豐富,但對藥材質(zhì)量缺乏科學的評判標準。因此,亟需建立一種全面科學的牡丹花瓣藥材標準來評價其質(zhì)量。本文采用顯微鑒別法、薄層色譜法、高效液相色譜法對牡丹花瓣藥材進行定性、定量研究,為建立藥材標準提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

高效液相色譜儀(UFLC-20AD-PDA),日本島津公司;色譜柱:Kromasil C18柱(5 μm,4.6 mm×250 mm,瑞典NOBEL公司);梅特勒-托利多電子分析天平,XPE105型,梅特勒公司;超聲波發(fā)生器,型號KQ-5200D數(shù)控,昆山超聲儀器有限公司;顯微鏡型號:OLYMPUS CX23,拍攝軟件:KoPa WiFi EDU,日本奧林巴斯公司;HWT-6B型恒溫水浴箱,天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

甲醇、乙腈均為HPLC級,美國Fisher公司;硅膠G薄層板(100×100 mm)、硅膠GF254薄層板(100×100 mm),青島基億達硅膠試劑有限公司;水合氯醛(AR級,批號20180611),成都市科龍化工試劑廠;乙醇(AR級,批號20181012)、磷酸(AR級,批號201800928)、三氯甲烷(AR級,批號20180312)、乙酸乙酯(AR級,批號20180312)、甲酸乙酯(AR級,批號20190415),天津市富宇精細化工有限公司;甲酸(AR級,批號20180924),天津市富宇精細化工有限公司;香草醛(AR級,批號20180516),上海展云化工有限公司;硫酸(AR級,批號20180423),西安耀皇化工科技有限公司;甘油(AR級,批號20180822),國藥集團化學試劑公司;超純水,自制;其余試劑為分析純。對照品:芍藥苷(批號110736-202044,純度96.8%)、沒食子酸(批號11083-201906,純度91.50%),均購自中國食品藥品檢定研究院。牡丹花瓣(采自山東菏澤、陜西合陽、陜西蒲城、陜西旬陽、陜西西安),經(jīng)陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院羅定強主任藥師鑒定為牡丹花瓣(PaeoniasuffruticosaAndr. petal)藥材,詳細信息見表1。藥材在50 ℃烘干,過4號藥典篩,置于干燥器中備用。

表1 采集樣品時間與產(chǎn)地

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)物質(zhì)檢查與浸出物含量測定 分別按照2020年版《中國藥典》四部[19]通則0832水分測定法第二法、2302灰分測定法、2201浸出物測定法(冷浸法)測定水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物含量。

1.2.2 顯微鑒別 取花瓣樣品(過四號篩),取少許粉末置載玻片上,滴加水合氯醛(取水合氯醛50 g,加蒸餾水15 ml與甘油10 ml溶解即得濃度為2 g/ml)1-2滴,蓋上蓋玻片。在酒精燈上加熱使之透化,在顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 芍藥苷的薄層色譜鑒別

1.2.3.1 薄層色譜鑒別方法一 取本品粉末1 g,加95%乙醇25 ml,超聲處理15 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加乙醇1 ml使溶解,作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品,加乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液,作為芍藥苷的對照品溶液。吸取上述兩種溶液各10 μl分別點于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40 ∶5 ∶10 ∶0.2)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,加熱至斑點顯色清晰[18,19]。

1.2.3.2 薄層色譜鑒別方法二 取本品粉末1 g,加石油醚(30-60 ℃)50 ml,超聲處理30 min,濾過,棄去濾液,藥渣揮干石油醚,加丙酮50 ml,超聲處理30 min,濾過,濾液濃縮至約2 ml,作為供試品溶液[20]。另取芍藥苷對照品,加丙酮制成每1 ml含1 mg的溶液,作為芍藥苷的對照品溶液。余同“1.2.3.1項”。

1.2.3.3 薄層色譜鑒別方法三 供試品溶液與對照品溶液的制備同“1.2.3.2項”。吸取上述兩種溶液各10 μl分別點于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5 ∶5 ∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,加熱至斑點顯色清晰[19]。

1.2.4 沒食子酸與芍藥苷含量測定

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)為流動相,梯度洗脫,洗脫方法見表2;檢測波長為234 nm,柱溫為30 ℃,流速為0.8 ml/min,進樣量為10 μl。理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計算應不低于4 000。

表2 梯度洗脫程序

1.2.4.2 對照品溶液的制備 分別稱取芍藥苷對照品10.66 mg、沒食子酸對照品7.13 mg,置于5 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得混合對照品溶液,作為儲備液。

1.2.4.3 供試品溶液的制備 取本品粉碎(過四號篩),稱取0.45 g,精密稱定,置200 ml具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇100 ml,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率300 W,頻率50 kHz)30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用50%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液1 ml,置10 ml量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得供試品溶液。

1.2.4.4 標準曲線及線性范圍 分別精密量取儲備液0.025,0.050,0.100,0.200,0.400,0.800,1.600 ml,分別置于各個5 ml的量瓶中,加50%甲醇定容至5 ml,分別得對照品溶液1,2,3,4,5,6,7。進樣測定,記錄峰面積,考察對照品濃度(x)與峰面積(y)的線性關(guān)系。

1.2.4.5 專屬性實驗 依據(jù)1.2.4.1色譜條件分別進樣空白溶劑、混合對照溶液、供試品溶液,分別記錄色譜圖。

1.2.4.6 精密度實驗 取供試品溶液(樣品M1),連續(xù)測定6次,進樣測定峰面積,計算RSD值。

1.2.4.7 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液(樣品M1),分別于0,2,4,8,12,24 h,進樣測定峰面積,計算RSD值。

1.2.4.8 重復性實驗 稱取樣品(樣品M1)0.45 g,精密稱定,按上1.2.4.3項供試品制備方法制備6份供試品溶液及按1.2.4.1項測定方法測定。計算沒食子酸與芍藥苷的含量(mg/g)與RSD(%)。

1.2.4.9 加樣回收率實驗 稱取樣品(樣品M1,沒食子酸含量2.56 mg/g,芍藥苷含量7.46 mg/g)0.23 g,精密稱定,稱取6份,分別添加對照品溶液1.0 ml(每1 ml甲醇含芍藥苷1.70 mg/ml、沒食子酸0.58 mg/ml混合對照溶液),再依據(jù)1.2.4.3項制備溶液與1.2.4.1項測定方法測定,計算回收率(%)。

1.2.4.10 樣品含量測定 測定5個不同產(chǎn)地11批藥材中芍藥苷的含量(mg/g),按照1.2.4.3項供試品制備方法制備樣品溶液,按照1.2.4.1項檢測方法測定。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)物質(zhì)檢查與浸出物含量測定

水分含量均小于9.00%,浸出物均超過36.00%,總灰分均小于13.00%,酸不溶性灰分均小于0.50%(見表3)。

表3 水分、浸出物、總灰分、酸不溶性灰分含量測定結(jié)果 (n=3,%)

2.2 顯微鑒別

顯微鑒別發(fā)現(xiàn)牡丹花瓣特征組織結(jié)構(gòu)有薄壁細胞、導管、花粉粒、螺紋導管(見圖1)。

圖1 牡丹花瓣粉末顯微鑒別Figure 1 Microscopical identification of peony petal powder

2.3 芍藥苷的薄層色譜鑒別

2.3.1 TLC鑒別方法一 供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上顯相同的藍紫色斑點。斑點清晰,Rf值適中,專屬性強(見圖2)。

1,2.芍藥苷對照品;3.M1樣品;4.M2樣品;5.M3樣品;6.M4樣品A.M1、M2、M3與M4樣品鑒別 1,2.芍藥苷對照品;3.M5樣品;4.M6樣品;5.M7樣品B.M5、M6與M7樣品鑒別 1,2.M8樣品;3,4.芍藥苷對照品;5,6,7.M9樣品C.M8與M9樣品鑒別1.芍藥苷對照品;.2,3.M10樣品;4,5.M11樣品 D.M10與M11樣品鑒別圖2 牡丹花瓣中芍藥苷TLC鑒別Figure 2 TLC identification of paecniflorin in peony petal

2.3.2 TLC鑒別方法二 供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上顯相同的藍紫色斑點,斑點清晰,Rf值適中,但有擴散現(xiàn)象明顯(見圖3A)。

2.3.3 TLC鑒別方法三 供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上,顯相同的藍紫色斑點,斑點清晰,Rf值適中,但邊緣效應與擴散現(xiàn)象明顯(見圖3B)。

A.TLC鑒別方法二結(jié)果B.TLC鑒別方法三結(jié)果1.芍藥苷對照品;2.M1樣品;3.M4樣品;4.M6樣品; 5.M8樣品圖3 牡丹花瓣中芍藥苷TLC鑒別Figure 3 TLC identification of paecniflorin in peony petal

2.4 沒食子酸與芍藥苷含量測定

2.4.1 標準曲線及線性范圍 沒食子酸、芍藥苷分別在濃度9.75-624.25 μg/ml、6.90-441.72 μg/ml范圍內(nèi),線性關(guān)系良好(r>0.999,見表4,圖4,5)。

圖4 沒食子酸標準曲線Figure 4 Standard curve of gallic acid

圖5 芍藥苷標準曲線Figure 5 Standard curve of paeoniflorin

表4 線性方程與范圍及相關(guān)系數(shù)

2.4.2 專屬性實驗 空白對照無干擾,樣品中目標物分離度良好,專屬性強(見圖6)。

1.沒食子酸;2.芍藥苷圖6 空白對照、混合對照與牡丹花瓣樣品HPLC色譜圖Figure 6 HPLC chromatograms of blank control, mixed control and Paeonia suffruticosa Andr. petals

2.4.3 精密度實驗 沒食子酸與芍藥苷峰面積的RSD分別為1.39%和2.04%,均小于3%(見表5),說明該方法精密度良好。

表5 精密度實驗測定結(jié)果

2.4.4 穩(wěn)定性實驗 沒食子酸與芍藥苷峰面積的RSD分別為1.96%和2.40%,均小于3%(見表6),說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表6 穩(wěn)定性實驗測定結(jié)果

2.4.5 重復性實驗 沒食子酸含量與芍藥苷含量的RSD分別為1.24%和1.96%,均小于2.00%(見表7),說明重復性良好。

表7 重復性實驗測定結(jié)果

2.4.6 加樣回收率實驗 沒食子酸與芍藥苷的平均加樣回收率分別98.58%和98.70%,RSD均小于2.00%(見表8),說明回收率良好。

表8 加樣回收率實驗測定結(jié)果 (n=6)

2.4.7 樣品含量測定 5個產(chǎn)地芍藥苷的平均含量:陜西合陽>陜西西安>陜西蒲城>陜西旬陽>山東菏澤;沒食子酸的平均含量:陜西合陽>陜西蒲城>陜西西安>陜西旬陽>山東菏澤(見表9),說明不同產(chǎn)地不同成分含量有差異。

表9 11批藥材中沒食子酸與芍藥苷的含量 (n=3)

3 討論

3.1 定性鑒別

筆者對芍藥苷的TLC的制樣方法、展開系統(tǒng)、顯色劑等進行了篩選。方法一:參照文獻[18]白芍TLC鑒別的制樣方法、展開系統(tǒng)與顯色方法,結(jié)果顯示供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上顯相同的藍紫色斑點,Rf值適中。方法二:參照文獻[19]牡丹葉TLC鑒別的制樣方法,結(jié)果顯示供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同的藍紫色斑點。方法三:按照方法二制備供試品與對照品溶液、點樣、展開(三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸5 ∶5 ∶1)[18]、顯色,結(jié)果顯示在與對照品色譜相應的位置上,顯相同的藍紫色斑點,但展開邊緣效應與擴散現(xiàn)象明顯、Rf值較小。因此,將制樣簡單、斑點清晰、Rf值適中的方法一(即1.2.3.1項)列入質(zhì)量標準。此外,顯微鑒定5個產(chǎn)地11批樣品的粉末特征組織結(jié)構(gòu)為薄壁細胞、導管、花粉粒、螺紋導管。

3.2 含量測定

對沒食子酸與芍藥苷檢測條件進行了比較。比較了不同色譜洗脫系統(tǒng)(水-乙腈,水-甲醇,0.1,0.2,0.3%磷酸-甲醇或乙腈等)、不同柱溫(20,25,30,35,40 ℃)、不同流速(0.5,0.8,1.0,1.2 ml/min),結(jié)果顯示,流動相為0.1%磷酸-乙腈進行梯度洗脫、柱溫在30 ℃、流速為0.8 ml/min時目標物分離度良好,柱溫低于或高于30 ℃、流速小于或大于0.8 ml/min時芍藥苷與相鄰不能分開;在不同進樣量(5,10,20 μl)中,進樣量5 μl的峰面積小,不便于計算,進樣量20 μl芍藥苷峰拖尾明顯,所以選擇10 μl較為理想。比較不同制樣方法如超聲(15,30,45,60 min等)、加熱回流(15,30,45,60 min),不同濃度溶劑甲醇或乙醇(40%,50%,60%,70%,80%,100%),結(jié)果顯示,超聲超過30 min不能增加目標物的溶出度,加熱處理目標物濃度有所降低,故選擇50%甲醇超聲30 min較為理想。在高效液相色譜儀(Waters 2695主機+Waters 2996二極管陣列檢測器)進行重復,兩種儀器檢測結(jié)果相差很小,說明該方法重現(xiàn)性良好。通過上述研究,建立了制樣簡單、靈敏可靠、操作方便、重復性與穩(wěn)定性良好的高效液相色譜法,并測定了11批5個產(chǎn)地牡丹花瓣中芍藥苷與沒食子酸含量,可作為標準的質(zhì)控方法。

綜上所述,顯微鑒定出特征組織結(jié)構(gòu),對多批藥材中水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物的含量進行測定,建立了專屬性強、重復性好、操作簡便的芍藥苷TLC鑒別方法,以及具有良好穩(wěn)定性、重復性的芍藥苷與沒食子酸HPLC含量測定方法,為該藥材質(zhì)量標準的制定及牡丹花瓣資源的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。