王 鑫,黃美玲,蘇玉霞,任曉東,劉 濤,陳明會*

(1漢中市人民醫(yī)院藥劑科,漢中 723000;2漢中市鐵路中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科;3西安交通大學第一附屬醫(yī)院藥學部;*通訊作者,E-mail:951036067@qq.com)

益腦心顆粒(國藥準字Z20025079),具有活血散瘀,平肝熄風等功效,由六味中藥即天麻、山楂、郁金、丹參、制何首烏、川芎組成[1-3]。方中川芎含有腺苷、沒食子酸、阿魏酸等成分,其對心血管疾病、中樞神經系統(tǒng)有治療作用[4-6];天麻含有沒食子酸、5-羥甲基糠醛、天麻素、腺苷等成分,具有鎮(zhèn)靜催眠與腦保護等作用[7-9];何首烏含有沒食子酸、二苯乙烯苷類、腺苷等成分,具有明顯的神經保護與抗衰老等作用[10-12];郁金有抗炎、腫瘤等作用[13];山楂有較高含量的沒食子酸,有抗氧化作用[14-19];丹參中含丹酚酸B、迷迭香酸、5-羥甲基糠醛等成分,有改善微循環(huán)、抗凝血等作用[20,21]。前期筆者對益腦心顆粒進行了定性研究,并鑒定出制劑中的丹酚酸B、迷迭香酸、二苯乙烯苷、5-羥甲基糠醛、沒食子酸、天麻素、腺苷等成分[22]。本文旨在通過建立HPLC法測定益腦心顆粒與藥材中的7個活性成分的含量,探討7種成分在制備過程中的轉移情況,為制劑的質量控制提供科學依據(jù),為臨床應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

島津Prominence UFLC型高效液相色譜儀,配SPD-M20A二極管陣列檢測器與LC/Labsoluion色譜工作站,日本島津公司;KQ-100DA臺式數(shù)控超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;十萬分之一電子分析天平,型號MD200,德國賽多利斯公司;0.45 μm微孔濾膜,東莞市皇賢科學儀器有限公司。乙腈、甲醇,色譜級,美國Fisher公司;水為娃哈哈純凈水,公司名稱杭州娃哈哈集團有限公司;磷酸、無水乙醇均為分析純,北科化學天津有限責任公司。腺苷(批號10879-201703,質量分數(shù)99.7%)、天麻素(批號110807-202010,質量分數(shù)95.5%)、沒食子酸(批號110831-201906,質量分數(shù)91.5%)、5-羥甲基糠醛(批號111626-202013,質量分數(shù)99.5%)、迷迭香酸(批號111871-202007,質量分數(shù)98.1%)等對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;二苯乙烯苷(批號HO118401,質量分數(shù)98%)、丹酚酸B(批號HS034208,質量分數(shù)98%),購于寶雞辰光生物技術有限公司;藥材與益腦心顆粒(國藥準字Z20025079,規(guī)格7 g×9袋/盒),購自陜西漢王藥業(yè)股份有限公司,藥材與制劑對應關系見表1。

表1 藥材與制劑對應關系

1.2 含量測定方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),按表2進行梯度洗脫。記錄時間:70 min。體積流量:0.8 ml/min;柱溫:28 ℃;檢測波長:270 nm;進樣量:10 μl[22]。

表2 梯度洗脫程序方法

1.2.2 各種溶液的制備

1.2.2.1 混合對照品溶液的配制 分別精密稱取沒食子酸5.46 mg,5-羥甲基糠醛8.04 mg于100 ml量瓶中,加50%甲醇至刻度,搖勻,作為A溶液;再分別精密稱取腺苷18.05 mg,天麻素5.86 mg,二苯乙烯苷3.06 mg,迷迭香酸4.08 mg,丹酚酸B 20.41 mg置于10 ml量瓶中,加A溶液至刻度,搖勻,即得7種混合對照溶液,作為儲備液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品5袋內容物,研細,混勻,取7 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入50%乙醇25 ml,稱定質量,超聲處理(功率100 W,頻率100 Hz)30 min,取出,放冷,再稱定質量,用50%乙醇補足其減失的質量,搖勻,0.45 μm的微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液得到供試品溶液[22]。

1.2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按益腦心顆粒處方分別制備缺天麻樣品(天麻素陰性對照),缺制首烏樣品(二苯乙烯苷陰性對照),缺丹參樣品(迷迭香酸與丹酚酸B陰性對照),缺天麻、山楂、川芎與制首烏樣品(沒食子酸陰性對照與腺苷陰性對照),缺天麻與丹參(5-羥甲基糠醛陰性對照)的陰性樣品;再按“1.2.2.2”項下方法分別制備各陰性樣品溶液。

1.2.2.4 天麻藥材溶液的制備 取本品粉末0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入50%乙醇25 ml,稱定質量,超聲處理(功率100 W,頻率100 Hz)30 min,取出,放冷,再稱定質量,用50%乙醇補足其減失的質量,搖勻,0.45 μm的微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液得到供試品溶液。

1.2.2.5 制首烏藥材溶液的制備 溶液的制備同“1.2.2.4”項。

1.2.2.6 丹參藥材溶液的制備 溶液的制備同“1.2.2.4”項。

1.2.2.7 川芎藥材溶液的制備 溶液的制備同“1.2.2.4”項。

1.2.2.8 山楂藥材溶液的制備 溶液的制備同“1.2.2.4”項。

1.2.3 方法學考察

1.2.3.1 線性關系考察 分別精密量取儲備液0.010,0.050,0.250,0.500,1.000 ml置于各個2 ml量瓶中,分別加50%甲醇定容,混勻,即得系列混合對照溶液。用0.45 μm微孔濾膜濾過,進樣。以各對照品的濃度(μg/ml)為橫坐標(x),峰面積值為縱坐標(y)進行線性回歸。

1.2.3.2 專屬性試驗 分別精密量取混合對照溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl進樣,分別記錄色譜圖。

1.2.3.3 精密度試驗 精密吸取供試品溶液(批號010012),重復進樣6次,測得腺苷、天麻素、沒食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面積的RSD值。

1.2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液(批號010012),在第0,2,4,8,12,24小時進樣。測定腺苷、天麻素、沒食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面積的RSD值。

1.2.3.5 重復性試驗 精密稱取樣品(批號010012)6份,分別按“1.2.2.2”項下方法制備供試品,按“1.2.1”項下條件測定。測定平均含量與RSD值。

1.2.3.6 加樣回收率試驗 取本品(批號010012)內容物,添加對照品后,照“1.2.2.2”項下方法制備樣品溶液,按照“1.2.1”項下色譜條件測定,制備6份樣品溶液,測定峰面積計算加樣回收率。

1.2.3.7 藥材含量測定 分別精密稱取川芎、制何首烏、丹參、郁金、山楂、天麻樣品0.5 g,分別按“1.2.2.4-1.2.2.8”項下方法制備藥材供試品,按“1.2.1”項下條件測定。

1.2.3.8 制劑含量測定 精密稱取9批樣品,分別按“1.2.2.2”項下方法制備供試品,按“1.2.1”項下條件測定。測定腺苷、天麻素、沒食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的平均含量(mg/g)。

1.2.4 轉移率 依據(jù)如下公式計算:藥材中成分轉移率(%)=對應制劑中成分總含量(mg)/處方藥材成分總含量(mg)×100%。

2 結果

2.1 線性關系考察

結果表明7種對照品在相應濃度范圍內線性關系良好(見表3)。

表3 對照品的線性方程、線性濃度范圍及相關系數(shù)

2.2 專屬性試驗

結果表明陰性對照無干擾,專屬性強(見圖1)。

1.腺苷;2.天麻素;3.沒食子酸;4.5-羥甲基糠醛;5.二苯乙烯苷;6.迷迭香酸;7.丹酚酸B圖1 混合對照品、供試品、陰性對照樣品HPLC色譜圖Figure 1 High performance liquid chromatogram of mixed control samples, test samples and negative control samples

2.3 精密度試驗

結果顯示,腺苷、天麻素、沒食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.95%,0.93%,0.89%,1.02%,0.94%,0.91%,0.87%,均小于2.0%(見表4),表明該方法精密度良好。

表4 精密度試驗結果

2.4 穩(wěn)定性試驗

結果顯示,腺苷、天麻素、沒食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.82%,0.96%,1.13%,1.01%,1.21%,1.15%,1.08%,均小于2.0%(見表5),表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性試驗結果

2.5 重復性試驗

結果顯示,腺苷、天麻素、沒食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面積,計算得平均含量的RSD均小于2.5%(見表6),表明該方法重復性良好。

表6 重復性試驗結果

2.6 加樣回收率試驗

結果顯示,腺苷、天麻素、沒食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面積,分別計算得各成分平均回收率在97%-99%之間,各成分RSD均小于2.0%(見表7),表明該方法回收率良好。

表7 加樣回收率試驗結果

2.7 藥材含量測定

藥材含量測定的結果見表8。天麻中腺苷、天麻素、沒食子酸、5-羥基糠醛的平均含量分別為10.732 5 mg/g,11.107 4 mg/g,2.660 5 mg/g,27.233 2 mg/g;制首烏中腺苷、沒食子酸、二苯乙烯苷的平均含量分別為2.247 4 mg/g,16.136 8 mg/g,7.074 4 mg/g;丹參中5-羥基糠醛、迷迭香酸、丹酚酸B的平均含量分別為109.446 8 mg/g,2.042 0 mg/g,31.988 4 mg/g;川芎中腺苷、沒食子酸的平均含量分別為482.166 8 mg/g,10.592 0 mg/g;山楂中沒食子酸的平均含量為22.197 4 mg/g。

表8 三批藥材7個成分測定結果

2.8 制劑含量測定

制劑含量測定的結果見表9。010012,010013,010014,010017,010018,010019,010021,010022,010023批中腺苷、天麻素、沒食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的平均含量分別為0.477 41 mg/g,0.680 90 mg/g,0.051 40 mg/g,0.130 06 mg/g,1.146 14 mg/g,0.342 45 mg/g,4.753 30 mg/g。

表9 批益腦心顆粒中7個成分含量試驗結果 (mg/g)

2.9 轉移率

7個成分的轉移率均超過50%,RSD均小于3%,最小轉移率成分為二苯乙烯苷,最大轉移率成分為天麻素(見表10)。

表10 三批藥材對應9批制劑轉移率測定結果

3 討論

3.1 色譜條件

使用二極管陣列檢測器對益腦心顆粒樣品進行全波長掃描,結果表明腺苷的最大吸收波長為265 nm,天麻素為220 nm和269 nm,沒食子酸為271 nm,5-羥甲基糠醛為281 nm,二苯乙烯苷為309 nm,迷迭香酸為311 nm,丹酚酸B為288nm,因此依據(jù)每個化合物的最大吸收值,確定共同檢測波長為270 nm。色譜條件的選擇與供試品制備方法依據(jù)文獻[22]。

3.2 專屬性實驗研究

腺苷在川芎、天麻、制首烏中均含有,所以陰性對照制備供試品是需要去除;沒食子酸在天麻、山楂、川芎、制首烏含有,制備陰性對照時需要去掉天麻、山楂、川芎、制首烏;5-羥甲基糠醛在天麻、丹參中均含有,制備陰性對照時需要去掉天麻、丹參;二苯乙烯苷僅在制首烏中含有,制備陰性對照時需要去掉制首烏;迷迭香酸、丹酚酸B僅在丹參中含有,制備陰性對照時需要去掉丹參;天麻素僅在天麻中含有,制備陰性對照時需要去掉天麻。

3.3 轉移率研究

對3批藥材對應9批益腦心顆粒中7種成分含量分析,結果,平均轉移率大小順序:天麻素>迷迭香酸>沒食子酸>腺苷>5-羥甲基糠醛>丹酚酸B>二苯乙烯苷。二苯乙烯苷轉移率較低可能是在生產過程中受光照、溫度及空氣中氧化等原因影響[23,24],但轉移率均在50%以上,表明藥材中7種活性成分的轉移率較高,說明制劑工藝良好,很好地控制了制劑質量。

綜上所述,成功建立益腦心顆粒7種成分的HPLC含量測定方法,該方法操作簡單易于實施、準確、穩(wěn)定、重復性好、專屬性強,因此該方法可作為益腦心顆粒質量的有效評價方法之一;7種成分的轉移率較高,表明制劑的制備工藝有利于7個活性成分的轉移,為制劑生產提供了科學依據(jù),為制劑療效提供了理論基礎。