趙辰生,西 穎,潘阿曉,劉玉婷,程 娜,王智云,柴秀琴,楊 陽(yáng),安麗榮,胡 濤

(1山西省心血管病醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,太原 030024;2山西省人民醫(yī)院神經(jīng)外科;*通訊作者,E-mail:namucuoo2000@sina.com)

腦梗死(cerebral infarction,CI)屬于臨床常見(jiàn)疾病,發(fā)病率、致殘致死率高,發(fā)病涉及多因素,對(duì)患者造成嚴(yán)重影響[1]。糖尿病(diabetes mellitus,DM)并發(fā)腦血管病的發(fā)生率為16.4%-18.6%,而糖尿病合并腦梗死占糖尿病并發(fā)腦血管病的89.1%;同時(shí),約1/3的腦梗死患者患有糖尿病[2]。研究表明,遺傳基因在腦梗死發(fā)病中可能起重要作用。近年來(lái),探討腦梗死的遺傳易感基因標(biāo)記及基因多態(tài)性與腦梗死相關(guān)關(guān)系的研究越來(lái)越受到學(xué)者們的重視[3]。糖代謝異常是腦梗死的危險(xiǎn)因素[4],大量研究均證實(shí)腦梗死的發(fā)生與2型糖尿病有關(guān),其并發(fā)腦梗死的相對(duì)危險(xiǎn)程度是非糖尿病患者的2-3倍[5]。血糖升高可引起脂代謝紊亂,同時(shí)引發(fā)組織蛋白非酶糖化,加速加重動(dòng)脈粥樣硬化形成。

SCARB1基因全稱為scavenger receptor class B member 1,該基因編碼的蛋白質(zhì)是高密度脂蛋白膽固醇(HDL)的質(zhì)膜受體,編碼的蛋白質(zhì)介導(dǎo)膽固醇與HDL的相互轉(zhuǎn)移。研究表明[6],HDL刺激清道夫受體B類1型(SR-B1)促進(jìn)肝臟吸收膽固醇,而該受體正是由SCARB1基因編碼的。高密度脂蛋白對(duì)冠心病的臨床診斷是一個(gè)重要的參考指標(biāo)。它的升高是臨床冠心病保護(hù)因子之一,并能防治和延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。因此,SCARB1基因的罕見(jiàn)突變與冠心病(CHD)相關(guān)[6]。Ma等[6]的研究搜索了病例對(duì)照研究和隊(duì)列研究的數(shù)據(jù)庫(kù)后認(rèn)為,多態(tài)性rs5888與冠心病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān),尤其是在男性中表現(xiàn)尤甚。

KL基因全稱為Klotho,該基因編碼與β-葡萄糖苷酶有關(guān)的I型膜蛋白。2018年,Flotyńska等[7]的研究探討了1型糖尿病患者的Klotho蛋白功能。研究認(rèn)為,成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23(FGF23)和Klotho系統(tǒng)濃度的變化可能是糖尿病慢性并發(fā)癥或治療選擇的標(biāo)志。此外,Klotho基因多態(tài)性與健康衰老有關(guān)。2019年,Zhu等[8]研究表明,Klotho G-395 A多態(tài)性與尿石癥和心血管疾病有關(guān),Klotho F352 V多態(tài)性與癌癥和長(zhǎng)壽有關(guān),F等位基因在決定人類壽命方面起著保護(hù)作用。由此可見(jiàn),KL基因的多態(tài)性同樣可能與腦梗死的發(fā)生具有密切的關(guān)系。

關(guān)于SCARB1基因和KL基因的基因多態(tài)性與糖尿病合并腦梗死易感性之間關(guān)系的臨床數(shù)據(jù)分析尚未見(jiàn)于中國(guó)山西漢族人群。本研究旨在探討腦梗死患者SCARB1基因rs5888位點(diǎn),以及KL基因rs1207568位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)與未患有腦梗死或糖尿病對(duì)照者之間的關(guān)系,揭示SCARB1基因與KL基因的基因多態(tài)性與漢族人群糖尿病合并腦梗死易感性的關(guān)系。在山西省,本研究可能為糖尿病合并腦梗死易感性篩查和預(yù)防性干預(yù)提供可用的遺傳易感性標(biāo)記,這將有利于未來(lái)開(kāi)展糖尿病和腦梗死的預(yù)測(cè)性篩查,有助于早期發(fā)現(xiàn)糖尿病和腦梗死的潛在致病基因并進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析工具

基于NCBI,Protscale,SignalP,TMHMM,PSORT,ProtParam和SecretomeP數(shù)據(jù)庫(kù)或軟件,對(duì)SCARB1和klotho基因的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、表達(dá)和分布進(jìn)行基本的預(yù)測(cè)分析。表1中顯示了所使用的軟件URL(Uniform Resource Locator,統(tǒng)一資源定位器,網(wǎng)絡(luò)地址)。

表1 本研究使用的生物信息學(xué)軟件或數(shù)據(jù)庫(kù)及其URL

1.2 患病及對(duì)照受試者的基本特征

2019年1月至2019年6月,收集在山西心血管醫(yī)院的腦梗死合并2型糖尿病的臨床病例,所有病例均符合1995年第四屆全國(guó)腦血管會(huì)議修訂的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)。總共從山西省選出了173例漢族人群參加研究,49例腦梗死合并糖尿病患者、52例腦梗死患者和39例糖尿病患者為研究對(duì)象,33例無(wú)腦梗死或糖尿病患者為對(duì)照組,研究獲得受試者的知情同意和本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。抽取所有患病及對(duì)照受試者的外周血,每位受試者5 ml。血樣分別測(cè)量并記錄其HDL-C、LDL-C、尿酸、同型半胱氨酸等臨床相關(guān)指標(biāo),同時(shí)進(jìn)行基因特異性擴(kuò)增和二代基因測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序,獲得基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)信息,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 DNA的提取

對(duì)所有病例和對(duì)照人群的外周血樣,使用DNA血液試劑盒從外周有核血細(xì)胞中分離出DNA。將提取出的DNA保存在4 ℃下備用,隨后分析所有患病及對(duì)照受試者的SCARB1基因和Klotho基因的SNP。

1.4 rs5888和rs1207568位點(diǎn)基因分型檢測(cè)

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)突變擴(kuò)增系統(tǒng)(polymerase chain reaction amplification refractory mutation system,ARMS-PCR)分析SCARB1的rs5888和Klotho的rs1207568位點(diǎn)序列,設(shè)計(jì)原則是在PCR產(chǎn)物中加入SNP突變位點(diǎn),并保證引物的上下端之間有一定的距離。使用DNA Clean&Concentrator TM-5(ZYMO RESEARCH,目錄號(hào)D4013)試劑盒純化DNA樣品進(jìn)行純化。通過(guò)紫外測(cè)量和電泳測(cè)試所制備樣品合格。DNA的定量信息使用Nano Drop UV分光光度計(jì)測(cè)定的紫外吸光度值表示,樣品的A260/A280在1.8-2.1之間。用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),篩選合格樣品。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 21.0(美國(guó)伊利諾伊州芝加哥SPSS公司)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?；€數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。基因型頻率定義為攜帶突變等位基因的受試者的百分比。等位基因頻率定義為在群體中檢測(cè)到的突變等位基因的百分比。使用卡方檢驗(yàn)分析疾病關(guān)聯(lián),兩組間計(jì)量資料的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),當(dāng)P<0.05時(shí)被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCARB1和Klotho的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 SCARB1基因總體預(yù)測(cè)結(jié)果 SCARB1基因位于人類第12號(hào)染色體,位置為12q24.31,共含有15個(gè)外顯子。SCARB1基因所編碼的蛋白由481個(gè)氨基酸組成,其分子式為C2452H3771N617O683S32,分子量為53 847.56。組成SCARB1蛋白的氨基酸中,負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為41,正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為43。經(jīng)ProtParam軟件預(yù)測(cè),該蛋白的理論等電點(diǎn)為7.97,屬于弱堿性蛋白。SCARB1蛋白的理論消光系數(shù)由ProtParam提供,消光系數(shù)以(mol/L)-1·cm-1為單位,在水溶液中波長(zhǎng)280 nm處測(cè)量。當(dāng)假設(shè)所有Cys殘基都形成胱氨酸時(shí),Abs 0.1%(=1 g/L)為1.269;當(dāng)假設(shè)所有Cys殘基都消除時(shí),Abs 0.1%(=1 g/L)為1.260。ProtParam軟件還對(duì)SCARB1蛋白的半衰期、穩(wěn)定性、脂肪系數(shù)、親疏水性等基本性質(zhì)做出了預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,SCARB1蛋白氨基酸序列的N端氨基酸為甲硫氨酸,其在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期可達(dá)30 h。SCARB1的計(jì)算失穩(wěn)指數(shù)(II)為34.00,被ProtParam軟件判定為穩(wěn)定蛋白。該蛋白的脂肪指數(shù)為82.47,親水性(GRAVY)總平均值為-0.004。

2.1.2 SCARB1蛋白親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果 Protscale軟件對(duì)SCARB1蛋白更為詳細(xì)的親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1,其中,最低點(diǎn)位于第453號(hào)的絲氨酸殘基,得分為-2.733,最高點(diǎn)位于第27位的纈氨酸殘基和第28位的甲硫氨酸殘基,得分均為2.900。軟件分析結(jié)果認(rèn)為,SCARB1蛋白應(yīng)為親水性蛋白。

圖1 SCARB1蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果Figure 1 The prediction results of the hydrophilicity and hydrophobicity of SCARB1 protein

2.1.3 SCARB1信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果 SignalP 4.0 Server對(duì)SCARB1信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果見(jiàn)圖2。在這項(xiàng)預(yù)測(cè)中,SCARB1蛋白的氨基酸序列第26位處C值達(dá)到最大,為0.273;第9位氨基酸處Y值達(dá)到最大,為0.228;S值的最大值位于第6位氨基酸處,得分0.544,平均值(1-8位)為0.893。按照軟件預(yù)測(cè)結(jié)果,SCARB1蛋白是不存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的。SecretomeP 2.0 Server對(duì)SCARB1蛋白的非經(jīng)典蛋白質(zhì)分泌做出了預(yù)測(cè),該蛋白的SecP得分(NN-得分)為0.408 960,未超過(guò)哺乳動(dòng)物推薦閾值0.6,因此SCARB1蛋白不是非經(jīng)典分泌蛋白。

圖2 SCARB1信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Figure 2 Analysis results of SCARB1 signal peptide structure

2.1.4 SCARB1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 SCARB1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)由TMHMM Server v. 2.0預(yù)測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖3,該蛋白在第13-35位氨基酸處存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),第1-12位氨基酸位于膜內(nèi),第36-481位氨基酸位于膜外。

圖3 SCARB1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)Figure 3 Transmembrane structure of SCARB1 protein

2.1.5 SCARB1組織表達(dá)特異性結(jié)果 NCBI的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)為確定所有蛋白質(zhì)編碼基因的組織特異性,對(duì)代表27種不同組織的95個(gè)人類組織樣本進(jìn)行了RNA-seq。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(見(jiàn)圖4),SCARB1在腎上腺中的表達(dá)最為廣泛,其RPKM(reads per kilobase per million mapped reads,每百萬(wàn)reads中來(lái)自于某基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù))為333.624±44.562,在胰腺中的表達(dá)最少,其RPKM為0.875±0.013。

圖4 SCARB1在組織中的表達(dá)情況Figure 4 SCARB1 expression in the tissues

2.1.6 SCARB1蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果 PSORT Ⅱ?qū)CARB1蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果如下,EDN1蛋白主要位于過(guò)氧化物酶體中(占33.30%),線粒體中占22.20%,細(xì)胞質(zhì)中占22.20%,細(xì)胞核中占22.20%。

2.1.7 klotho基因總體預(yù)測(cè)結(jié)果 klotho基因位于人類第13號(hào)染色體,位置為13q13.1,共含有6個(gè)外顯子。klotho基因所編碼的蛋白由1 012個(gè)氨基酸組成,其分子式為C5337H8024N1410O1452S30,分子量為116 132.80。組成Klotho蛋白的氨基酸中,負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為102,正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為105。經(jīng)ProtParam軟件預(yù)測(cè),該蛋白的理論等電點(diǎn)為8.06,屬于堿性蛋白。當(dāng)假設(shè)所有Cys殘基都形成胱氨酸時(shí),Klotho蛋白的理論消光系數(shù)Abs 0.1%(=1 g/L)為2.056;當(dāng)假設(shè)所有Cys殘基都消除時(shí),Abs 0.1%(=1 g/L)為2.049。Klotho蛋白氨基酸序列的N端氨基酸為甲硫氨酸,它在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h。Klotho的計(jì)算失穩(wěn)指數(shù)(II)為41.72,被ProtParam軟件判定為不穩(wěn)定蛋白。該蛋白的脂肪指數(shù)為83.69,親水性總平均值為-0.264。

2.1.8 Klotho蛋白親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果 Protscale軟件對(duì)Klotho蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5,其中,最低點(diǎn)位于第1 008位的精氨酸殘基,得分為-2.667,最高點(diǎn)位于第986位的異亮氨酸殘基,得分為3.100。從圖中可以看出,Klotho蛋白的氨基酸殘基大多位于零點(diǎn)以下的負(fù)值親水區(qū)域,因此該蛋白應(yīng)為親水性蛋白。該結(jié)論與ProtParam預(yù)測(cè)到的結(jié)論相同,互為印證,可信度較高。

圖5 Klotho蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果Figure 5 The prediction results of the hydrophilicity and hydrophobicity of Klotho protein

2.1.9 klotho信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果 SignalP 4.1 Server對(duì)klotho信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果見(jiàn)圖6。在這項(xiàng)預(yù)測(cè)中,Klotho蛋白的氨基酸序列第34位處C值與Y值達(dá)到最大,分別為0.494和0.594,S值的最大值位于第7位,為0.893,S值平均值(1-33位)為0.669。因此,按照判定標(biāo)準(zhǔn),Klotho蛋白是可能存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的。

圖6 klotho信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Figure 6 Analysis results of klotho signal peptide structure

2.1.10 Klotho蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 Klotho蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7,該蛋白在第982-1004位處存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),第1-981位位于膜內(nèi),第1005-1012位位于膜外。

圖7 Klotho蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)Figure 7 Transmembrane structure of Klotho protein

2.1.11 klotho組織表達(dá)特異性結(jié)果 NCBI對(duì)klotho進(jìn)行RNA-seq分析后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,klotho在腎臟中的表達(dá)最為廣泛,其RPKM為80.634±30.462,在骨髓中的表達(dá)最少,其RPKM為0.05±0.045(見(jiàn)圖8)。

圖8 klotho在組織中的表達(dá)情況Figure 8 Klotho's expression in the tissues

2.1.12 Klotho蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果 PSORT Ⅱ?qū)lotho蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果如下,Klotho蛋白主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(占44.40%),其他部位如高爾基體中占33.30%,質(zhì)膜中占22.20%。

2.2 患病及對(duì)照受試者的基本特征

患者和對(duì)照之間的年齡和性別沒(méi)有顯著差異(P>0.05,見(jiàn)表2)。各組研究對(duì)象的基本特征見(jiàn)表2。

表2 患病及對(duì)照受試者的基本特征

2.3 SCARB1基因rs5888及Klotho基因rs1207568的位點(diǎn)分析

SCARB1基因rs5888為同義替換,轉(zhuǎn)錄本雖然出現(xiàn)改變,但原丙氨酸密碼子在突變并經(jīng)翻譯后,該位點(diǎn)仍為丙氨酸。圖9所示的三維模型(Swiss-PdbViewer 4.1.0軟件制作)展示了該突變位點(diǎn)的具體位置,圖中紫色蛋白為突變后被替換的丙氨酸,表中表示的是SCARB1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的具體信息。

Rs5888Amino acid residueBondsAnglesTorsionImproperHonbondedElectrostaticConstraintTotalAALA3502.7153.6011.6660.082-23.040.320.000 0E=-14.658

klotho基因rs1207568突變屬于上游轉(zhuǎn)錄本變體,并未對(duì)該基因所編碼蛋白的氨基酸序列造成影響,且尚未在ClinVar中有過(guò)具體臨床意義的記錄。圖10中紫色框內(nèi)所顯示的序列即為rs1207568突變位點(diǎn)(數(shù)據(jù)獲取自美國(guó)NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù))。

圖10 klotho基因rs1207568位點(diǎn)信息Figure 10 Information of klotho gene rs1207568 locus

2.4 SCARB1基因rs5888及Klotho基因rs1207568的基因型和等位基因頻率及與臨床參數(shù)的關(guān)系

首先分別在SCARB1 rs5888和Klotho rs1207568的患者或?qū)φ战M中對(duì)臨床參數(shù)進(jìn)行比較分析,結(jié)果見(jiàn)表3-10。經(jīng)過(guò)對(duì)不同基因型受試者在凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)、總膽固醇標(biāo)準(zhǔn)值(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、尿酸(UA)、同型半胱氨酸(HCY)、血糖(BS)、糖化血紅蛋白(HbA1C)等臨床參數(shù)上的統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析,認(rèn)為受試者的基因型分布沒(méi)有明顯偏離Hardy-Weinberg平衡。測(cè)序證實(shí)SCARB1基因和klotho基因分別在rs5888和rs1207568具有基因多態(tài)性。

從表3可以看到,腦梗死合并糖尿病組除UA在Klotho rs1207568不同基因型之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)外,其他臨床參數(shù)PT、APTT、INR、CHO、TG、HDL-C、LDL-C、HCY、BS和HbA1C在不同基因型之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由于CC組的例數(shù)相對(duì)比較多,CT和TT組的例數(shù)比較少,為減少統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差,將CT基因型和TT基因型合并為一組,進(jìn)行分析。

表3 腦梗死合并糖尿病組Klotho rs1207568基因型臨床參數(shù)比較

腦梗死合并糖尿病組所有臨床參數(shù)在SCARB1 rs5888不同基因型之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表4)。

表4 腦梗死合并糖尿病組SCARB1 rs5888基因型臨床參數(shù)比較

單純性腦梗死組所有臨床參數(shù)在Klotho rs1207568不同基因型之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表5)。

表5 單純性腦梗死組Klotho rs1207568基因型臨床參數(shù)比較

單純性腦梗死組所有臨床參數(shù)在SCARB1 rs5888不同基因型之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表6)。

表6 單純性腦梗死組SCARB1 rs5888基因型臨床參數(shù)比較

單純性糖尿病組TG在Klotho rs1207568不同基因型之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其他臨床參數(shù)不同基因型之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表7)。

表7 單純性糖尿病組Klotho rs1207568基因型臨床參數(shù)比較

單純性糖尿病組APTT在SCARB1 rs5888不同基因型之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其他臨床參數(shù)不同基因型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表8)。

表8 單純性糖尿病組SCARB1 rs5888基因型臨床參數(shù)比較

對(duì)照組所有臨床參數(shù)Klotho rs1207568不同基因型之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表9);所有臨床參數(shù)SCARB1 rs5888不同基因型之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表10)。

表9 對(duì)照組Klotho rs1207568基因型臨床參數(shù)比較

表10 對(duì)照組SCARB1 rs5888基因型臨床參數(shù)比較

山西省漢族173例SCARB1基因rs5888多態(tài)性的基因型和等位基因頻率結(jié)果顯示:腦梗死合并糖尿病患者組SCARB1 rs5888的CT/TT頻率明顯高于正常對(duì)照組,但CC頻率低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表11)。

表11 不同組患者SCARB1基因rs5888基因多態(tài)性比較 [例(%)]

山西省漢族人群Klotho基因rs1207568多態(tài)性的173例基因型和等位基因頻率結(jié)果顯示,各組間在Klotho rs1207568中的CT/TT和CC頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表12)。

表12 不同組患者Klotho基因rs1207568基因多態(tài)性比較 [例(%)]

3 討論

本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)的手段對(duì)人SCARB1及klotho基因及蛋白的相關(guān)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。研究發(fā)現(xiàn),SCARB1蛋白為親水性堿性蛋白,該結(jié)論與ProtParam預(yù)測(cè)到的結(jié)論相同,互為印證,可信度較高。SCARB1蛋白不存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu),不是非經(jīng)典分泌蛋白,該蛋白存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),主要表達(dá)于腎上腺中,并主要定位于過(guò)氧化物酶體。Klotho蛋白為親水性堿性蛋白,可能存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu),存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),在腎臟中的表達(dá)最為廣泛,并主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,預(yù)測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

先前的研究發(fā)現(xiàn)SCARB1多態(tài)性與脂質(zhì)代謝有關(guān)[9]。對(duì)SCARB1 SNP rs5888 C/T基因型的分析顯示,在對(duì)照組中,TT基因型攜帶者中老年男性和年輕女性的血脂譜具有動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)表型[10]。同時(shí),大量研究表明,人klotho基因多態(tài)性與血管疾病有關(guān),可能是一個(gè)潛在的調(diào)控位點(diǎn)[11]。由于rs1207568存在于該基因的啟動(dòng)子區(qū),不影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列,可能影響klotho基因的轉(zhuǎn)錄活性,從而影響klotho基因的表達(dá),導(dǎo)致血管修復(fù)能力弱,導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

本研究中測(cè)序結(jié)果表明SCARB1基因及klotho基因分別存在rs5888及rs1207568位點(diǎn)上的基因多態(tài)性。我們的研究表明,Klotho rs1207568不同基因型間臨床參數(shù)比較,除腦梗死合并糖尿病組UA和單純性糖尿病組TG有顯著差異(P<0.05)外,其他臨床參數(shù)均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。SCARB1 rs5888不同基因型間臨床參數(shù)比較,除單純性糖尿病組APTT有顯著差異(P<0.05)外,其他臨床參數(shù)均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。腦梗死合并糖尿病患者SCARB1 rs5888的CT/TT頻率明顯高于正常對(duì)照,但CC頻率低于正常對(duì)照(P<0.05)。各組間在Klotho rs1207568中的CT/TT和CC頻率差異不顯著(P>0.05)。本研究表明SCARB1基因rs5888多態(tài)性與人類對(duì)糖尿病合并腦梗死的易感性密切相關(guān),并且可能是對(duì)其進(jìn)行評(píng)估的重要分子標(biāo)志物。

另一方面,我們注意到,rs5888多態(tài)性導(dǎo)致的編碼氨基酸雖然沒(méi)有改變,仍然是編碼丙氨酸,因此推測(cè)該多態(tài)性的生物學(xué)意義也可能通過(guò)涉及剪接調(diào)控系統(tǒng)的機(jī)制起到功能性作用。從這個(gè)角度來(lái)看,值得注意的是,與純合CC或TT相比,雜合子個(gè)體中SCARB1 mRNA表達(dá)明顯降低,因此該位點(diǎn)的基因多態(tài)性還是可以提供一個(gè)主要的基因表達(dá)負(fù)調(diào)控效應(yīng)[12]。進(jìn)一步的研究有望對(duì)這個(gè)有趣的問(wèn)題提供更深刻的見(jiàn)解。

動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一,也是腦梗死的主要致病因素,近年來(lái),隨著糖尿病發(fā)病率的不斷上升,糖尿病相關(guān)并發(fā)癥也成為了糖尿病患者致殘、致死的主要因素[13],而合并糖尿病的腦梗死越發(fā)引起人們的重視[2]。本課題對(duì)klotho基因啟動(dòng)子區(qū)rs1207568多態(tài)性,以及SCARB1 rs5888單核苷酸多態(tài)性與合并2型糖尿病的腦梗死相關(guān)性的探索,是對(duì)研究相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制和診治方法進(jìn)行的一次探索,為該領(lǐng)域更進(jìn)一步的研究提供一定的基礎(chǔ)。