韓如浩,張博倫,賈 如,胡 波,王珍珍,逯 宜*

(1陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點實驗室,西安 710004;2西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科;*通訊作者,E-mail:luyi1962@163.com)

牙周炎是口腔系統(tǒng)的常見疾病,表現(xiàn)為牙周組織的慢性炎癥,進(jìn)而導(dǎo)致牙槽骨等支持組織萎縮吸收,牙齒松動脫落,成為中老年人群牙齒缺失的首要原因。牙槽骨是人體最活躍的骨組織,一生都在進(jìn)行改建。牙周膜由致密的結(jié)締組織構(gòu)成,環(huán)繞牙根,位于牙根和牙槽骨之間。生理狀態(tài)下,牙周膜承擔(dān)并緩沖咬合力,保持牙槽骨骨吸收和骨沉積的動態(tài)平衡,在全身結(jié)締組織中代謝最活躍[1]。研究表明,機械應(yīng)力對于牙周膜及牙槽骨的改建具有雙向作用,維持著牙槽骨及牙周膜成骨及破骨效應(yīng)的動態(tài)平衡[2]。正畸力引起牙齒移動的組織學(xué)基礎(chǔ)是牙周膜和牙槽骨的改建,表現(xiàn)為壓力側(cè)牙槽骨吸收,張力側(cè)成骨細(xì)胞活躍。類骨質(zhì)沉積鈣化研究顯示,正畸力可引起牙周膜中與成骨和破骨有關(guān)的多種生物因子表達(dá)的變化[3]。在牙周炎狀態(tài)下,牙周膜受到炎癥因子侵襲時,骨代謝平衡則被打破,可發(fā)生不可控制的進(jìn)行性牙槽骨吸收,進(jìn)而導(dǎo)致骨量丟失,牙齒脫落[4],而在牙周組織的炎性微環(huán)境狀態(tài)下,不同大小的咀嚼負(fù)荷對于大鼠牙周膜及牙槽骨成破骨代謝效應(yīng)影響的在體研究仍未見報道。因此本課題擬通過在體實驗,利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)+高糖飲食構(gòu)建大鼠實驗性牙周炎模型,并利用不同硬度飼料加載不同大小的咀嚼負(fù)荷,利用形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)等方法觀察并檢測患牙牙周組織成/破骨效應(yīng)的改變,以探討牙周炎狀態(tài)下不同力學(xué)載荷對牙周組織骨改建的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與模型構(gòu)建

27只雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,8-10周齡,體質(zhì)量(200±20)g,由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供。隨機選取18只大鼠,建立實驗性牙周炎大鼠模型:10%葡萄糖水喂養(yǎng),每隔一天3%異氟烷吸入麻醉下使用微量進(jìn)樣器分別在雙側(cè)上頜第一磨牙腭側(cè)近中齦溝、根分叉處齦溝以及第一磨牙遠(yuǎn)中齦乳頭處齦溝內(nèi)注射濃度為10 μg/μl[5]的LPS各3 μl,共36 d,18次。隨后停止注射且將10%葡萄糖水喂養(yǎng)改為純凈水,并將大鼠隨機分為兩組:實驗性牙周炎+正常硬度飼料喂養(yǎng)組(LPS組,n=9),每日投喂足量正常硬度飼料,繼續(xù)喂養(yǎng)7 d;實驗性牙周炎+軟質(zhì)飼料喂養(yǎng)組(LPS+soft組,n=9):每日投喂足量定制軟質(zhì)飼料(由西安飛揚生物技術(shù)有限公司提供),繼續(xù)喂養(yǎng)7 d。其余9只未建模大鼠在同環(huán)境下以正常硬度飼料連續(xù)喂養(yǎng)43 d,期間不做特殊處理(control組,n=9)。正常硬度飼料與定制軟質(zhì)飼料成分完全一致,均為每千克食物包含160 g蛋白,710 g碳水化合物及30 g脂類(15 204 kJ/kg)。所有動物實驗均經(jīng)西安交通大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號:XJTU-2018-0037)。

1.2 主要實驗試劑和儀器

LPS(L-2880,10 mg)(Sigma,美國);異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);TRAP染色試劑(博士德生物科技有限公司);TRIzol裂解液(Invitrogen,美國),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific,美國),實時定量PCR(SYBR Premix Ex Taq II)試劑盒(TaKaRa,日本),real-time PCR引物(北京奧科生物技術(shù)有限公司),離心機(LX-200,海門市其林貝爾儀器制造有限公司);渦旋混合器(VORTEX-KB-3,海門市其林貝爾儀器制造有限公司);振蕩器(QB-8002,海門市其林貝爾儀器制造有限公司生物);酶標(biāo)儀(Multiskan MK3,Thermo Fisher Scientific,美國);顯微鏡(OLYMPUS,日本);輕簡型動物麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);小動物活體Micro-CT(PerkinElmer,美國);PCR擴增儀(Applied Biosystems,美國),熒光RT-qPCR儀(AB7500型)(Applied Biosystems,美國)。

1.3 標(biāo)本采集

實驗結(jié)束后于4%異氟烷吸入麻醉下斷頭處死所有大鼠,冰上刮取雙側(cè)第一磨牙牙周膜,即刻液氮冷凍后置于-80 ℃保存;分離雙側(cè)磨牙區(qū)含牙上頜骨標(biāo)本至4%多聚甲醛溶液保存并送Micro-CT掃描。

1.4 Micro-CT檢測各組標(biāo)本骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)

使用Micro-CT掃描三組大鼠的雙側(cè)磨牙區(qū)上頜骨標(biāo)本,并進(jìn)行三維重建,檢測各組樣本的骨組織復(fù)雜交錯指數(shù)(bone surface/bone volume,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(trabecular number,Tb.N)和骨小梁間隙(trabecular separation/spacing,Tb.Sp),每個樣本每組指標(biāo)測量3次取平均值,并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 組織切片及形態(tài)學(xué)實驗

三組大鼠共計27個含牙上頜骨樣本置于4%的多聚甲醛中固定48 h之后,蒸餾水沖洗3遍,置于濃度為20%甲酸脫鈣,脫鈣時間24 h。脫鈣標(biāo)準(zhǔn)為能夠用大頭針順利穿過。充分脫鈣后采用梯度酒精進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片,組織切片厚度為4 μm，切5張。隨機選取4個樣本的切片,分別進(jìn)行HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色各2張,具體實驗方法如下。

用于HE染色的切片置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各脫蠟3-5 min,在梯度酒精中各洗浴3-5 min;蘇木精染色5-10 min,自來水洗滌1 min;1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,自來水洗滌1 min;0.2%氨水返藍(lán)30 s左右,自來水洗滌1 min;伊紅染色3-5 min,自來水洗滌1 min;梯度酒精和二甲苯各脫水3-5 min;中性樹膠封片,光鏡下觀察染色結(jié)果,并利用Image J軟件測量分析每組大鼠第一磨牙近中及遠(yuǎn)中根釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x,每個樣本隨機選取5張同部位同視野照片納入統(tǒng)計,測量方法及實驗人員在各組間保持同質(zhì)性。

用于TRAP染色的切片置于3%H2O2中室溫下避光封閉10 min,蒸餾水洗滌5 min;置于含有100 ℃枸櫞酸鉀緩沖液的高壓鍋中修復(fù)抗原3 min,自然冷卻后PBS緩沖液洗滌5 min;按照TRAP染色試劑盒說明書配制染色試劑,將切片標(biāo)本浸入TRAP染色試劑中,37 ℃恒溫孵育1 h,蒸餾水洗滌5 min;中性樹膠封片,光鏡下觀察染色結(jié)果,Image J軟件進(jìn)行破骨細(xì)胞計數(shù)分析,每個樣本隨機選擇5張同部位同視野照片納入統(tǒng)計,測量方法及實驗人員在各組間保持同質(zhì)性。

1.6 骨代謝相關(guān)因子基因表達(dá)水平檢測

將-80 ℃中保存的牙周膜組織放入液氮預(yù)冷的研缽中,按照總RNA提取試劑盒說明書提取各組牙周膜樣本的總RNA,提取完成后,用分光光度計檢測RNA的純度及濃度,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟合成cDNA。采用real time-PCR測定各組牙周膜組織中核因子κB受體激活因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)、Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen,COL-1)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、組織蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)、甲狀腺旁腺激素樣激素(parathyroid hormone-like hormone,PTHLH)的mRNA表達(dá)。PCR采用20 μl反應(yīng)體系,實驗數(shù)據(jù)使用Bio-rad Rotor Gene real time Analysis Software 6.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析和計算,以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參,運用相對Ct法計算mRNA的表達(dá),目的基因的值=2(Ct內(nèi)參基因-Ct目的基因)。各基因引物序列見表1。

表1 Real-time PCR各基因引物序列

1.7 統(tǒng)計分析

使用SPSS 26.0軟件(IBM,美國)分析所得數(shù)據(jù),數(shù)值資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示(精確至小數(shù)點后四位)。對所有數(shù)值資料進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性分析,多組間比較采用單因素方差分析,數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊時采用Kruskal-Wallis檢驗,多組數(shù)據(jù)之間的兩兩比較采用LSD-t檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 牙槽骨吸收情況

三組大鼠雙側(cè)磨牙區(qū)上頜骨標(biāo)本經(jīng)Micro-CT掃描,三維重建結(jié)果見圖1。與control組相比,LPS組和LPS+soft組大鼠第一磨牙與第二磨牙間牙槽骨均有顯著的弧形吸收(如紅色箭頭所示)、近中根處的牙周膜間隙明顯增寬(如黃色箭頭所示);相比于LPS+soft組,LPS組牙槽骨的弧形吸收更加顯著、牙根與牙槽骨表面更為粗糙。通過對三維重建后的大鼠含牙頜骨的形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測量、統(tǒng)計、分析后發(fā)現(xiàn),與control組相比,LPS組BV/TV、Tb.Th、Tb.N等成骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)均明顯下降(P=0.000),而破骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)Tb.Sp水平明顯升高(P=0.000)。與LPS組相比,LPS+soft組BV/TV、Tb.Th、Tb.N均明顯上升(P=0.000),Tb.Sp水平明顯下降(P=0.000)。與control組相比,LPS+soft組BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp等指標(biāo)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。綜上所述,LPS組較control組BV/TV、Tb.Th、Tb.N降低,Tb.Sp升高,而LPS+soft組BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp恢復(fù),提示較軟的飲食對脂多糖+高糖飲食介導(dǎo)的牙槽骨吸收有減輕的作用。

圖1 大鼠上頜骨Micro-CT三維重建圖Figure 1 3D reconstruction of the maxilla of rats in micro-CT

表2 組大鼠上頜骨Micro-CT圖像三維重建后形態(tài)學(xué)指標(biāo)的檢測結(jié)果

2.2 HE染色結(jié)果

H&E染色結(jié)果顯示:與control組相比,LPS組和LPS+soft組表現(xiàn)出明顯的骨吸收陷窩形成和廣泛的炎細(xì)胞浸潤;相比于LPS+soft組,LPS組牙槽骨表面骨吸收陷窩數(shù)量更多,炎細(xì)胞浸潤更加明顯(見圖2)。利用Image J軟件進(jìn)一步測量、統(tǒng)計、分析各組大鼠第一磨牙釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x。結(jié)果顯示,LPS組和LPS+soft組大鼠第一磨牙釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)钠骄嚯x,較control組顯著增加。其中,LPS組大鼠第一磨牙的釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)钠骄嚯x顯著大于control組和LPS+soft組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。證實與control組相比,LPS組及LPS+soft組大鼠的牙槽骨均有不同程度的吸收,其中LPS組的牙槽骨吸收量明顯大于LPS+soft組。

圖2 三組大鼠上頜骨及牙周組織HE染色結(jié)果 (箭頭指示破骨細(xì)胞及骨吸收陷窩)Figure 2 HE staining results of maxillary and periodontal tissues of rats (Arrow indicates osteoclasts and bone resorption lacunars)

與control組比較,***P<0.001;與LPS組之間比較,#P<0.05圖3 三組大鼠上頜第一磨牙釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂距離的測量結(jié)果 (n=9)Figure 3 Distance between the cemento-enamel junction and the alveolar crest of the first molar of rats in three groups (n=9)

2.3 TRAP染色結(jié)果

破骨細(xì)胞TRAP染色結(jié)果見圖4。利用Image J軟件進(jìn)一步統(tǒng)計、分析各組同部位視野下破骨細(xì)胞數(shù)目,結(jié)果顯示相比于control組,LPS組及LPS+soft組的大鼠牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)量均顯著增加(P<0.05);而相較LPS+soft組,LPS組的牙周組織破骨細(xì)胞數(shù)量增加更明顯(P<0.05,見圖5)。提示LPS組大鼠牙槽骨吸收活動較LPS+soft組更為活躍。

圖4 三組大鼠上頜骨及牙周組織TRAP染色結(jié)果 (箭頭指示破骨細(xì)胞及骨吸收陷窩)Figure 4 TRAP staining results of maxillary and periodontal tissues of rats (Arrows indicated osteoclasts and bone resorption lacunars)

2.4 real-time PCR結(jié)果

real-time PCR結(jié)果顯示,成骨標(biāo)志因子ALP、COL-1和RUNX-2的mRNA表達(dá)水平在三組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05,見圖6)。相比于control組,LPS組破骨標(biāo)志因子RANKL、CTSK和PTHLH的mRNA表達(dá)量顯著升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而LPS+soft組破骨標(biāo)志因子RANKL、CTSK和PTHLH的mRNA表達(dá)量存在升高趨勢,但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此外LPS+soft組的破骨標(biāo)志因子RANKL和CTSK基因表達(dá)水平較LPS組顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

與control組比較,*P<0.05;與LPS組比較,#P<0.05圖5 三組大鼠牙周組織破骨細(xì)胞計數(shù)結(jié)果 (n=9)Figure 5 The count of osteoclasts in periodontal tissues of rats in three groups (n=9)

3 討論

咀嚼負(fù)荷引起的牙槽骨改建保持了骨吸收和骨沉積的平衡,負(fù)荷去除后牙周膜可恢復(fù)正常的寬度[6]。而當(dāng)患牙發(fā)生牙周炎,牙周膜受到炎癥因子侵襲時,骨代謝平衡則被打破,可發(fā)生不可控制的進(jìn)行性牙槽骨吸收,導(dǎo)致骨量丟失,最終牙齒脫落。既往研究證實,咀嚼負(fù)荷引起牙槽骨改建必須有牙周膜的存在,且正常力范圍內(nèi)咀嚼負(fù)荷所引起的牙槽骨改建不會引起牙槽嵴頂高度降低;而炎癥則可導(dǎo)致牙槽骨骨量丟失,且其導(dǎo)致的骨吸收不需要牙周膜存在[7]。生理條件下,咀嚼負(fù)荷和炎癥因子都可影響牙周膜細(xì)胞的分化[8-10]。當(dāng)牙周膜存在炎癥時,咀嚼負(fù)荷與炎癥因子對牙周膜細(xì)胞的分化產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用,通過影響成骨細(xì)胞的分化成熟程度,影響其自身的表型蛋白和功能蛋白的表達(dá),并調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和功能[11,12]。我們課題組既往研究表明,牙周炎伴正常硬度飼料喂養(yǎng)組中牙齦組織中IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性因子的基因表達(dá)水平相比于control組均顯著升高,而軟飼料喂養(yǎng)組牙齦組織TNF-α mRNA表達(dá)水平則顯著低于正常硬度飼料喂養(yǎng)組,提示軟質(zhì)飼料喂養(yǎng)有減輕其牙周組織炎性狀態(tài)的趨勢[13],但對于其牙槽骨骨代謝平衡的影響仍未可知。

與control組比較,*P<0.05,**P<0.01;與LPS組比較,#P<0.05圖6 三組大鼠第一磨牙牙周膜中成、破骨標(biāo)志因子的mRNA表達(dá)量 (n=9)Figure 6 The mRNA expression levels of osteogenesis and osteoclast markers in the periodontium of rats in three groups (n=9)

Micro-CT是一種直觀、準(zhǔn)確、可靠的觀察骨微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)技術(shù)手段,其分辨率與光學(xué)顯微鏡接近,可達(dá)微米級別,并能通過軟件重建出小型標(biāo)本的三維影像,實現(xiàn)對牙齒及周圍骨組織的準(zhǔn)確、客觀的定量分析[14,15]。本實驗中,我們對牙周炎合并不同硬度飼料喂養(yǎng)組的大鼠進(jìn)行含牙上頜骨取材,通過Micro-CT掃描結(jié)合三維重建的結(jié)果可以直觀地看到,在牙周炎基礎(chǔ)上,正常飼料喂養(yǎng)的大鼠,對比軟飼料喂養(yǎng)的大鼠,其牙槽骨表面更加粗糙,我們分析這是牙槽骨吸收持續(xù)存在的一種表現(xiàn)。經(jīng)過對牙槽骨吸收程度進(jìn)行定量分析,可以看到不同硬度飼料可導(dǎo)致大鼠上頜骨微結(jié)構(gòu)的改變程度不同。BV/TV是描述骨小梁微結(jié)構(gòu)的重要參數(shù),通常用于評價骨代謝的狀態(tài),其降低說明破骨活動增強,骨密度降低,而Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp是評估骨小梁的3個重要指標(biāo)。在本實驗結(jié)果中,與control組對比,無論軟飼料喂養(yǎng)組還是正常飼料喂養(yǎng)組其BV/TV、Tb.Th、Tb.N等參數(shù)值顯著降低,同時Tb.Sp參數(shù)值顯著升高,牙槽骨的吸收更加明顯;而軟質(zhì)飼料組相比正常飼料組骨吸收程度有所減輕,其BV/TV、Tb.Th、Tb.N等參數(shù)值升高,且Tb.Sp參數(shù)值降低,此定量分析結(jié)果提示軟質(zhì)飼料喂養(yǎng)可以對牙周炎誘導(dǎo)下的牙槽骨持續(xù)吸收發(fā)揮抑制作用。因此我們分析牙周炎患牙在受到較小咀嚼載荷的狀態(tài)下,牙槽骨吸收速率會有所下降。

此外,通過對實驗結(jié)束后取材的大鼠含牙上頜骨進(jìn)行標(biāo)本采集及HE、TRAP染色,我們直觀地看到了正常硬度飼料喂養(yǎng)下,牙周炎癥狀態(tài)持續(xù)存在,牙槽骨表面呈現(xiàn)凹凸不平的形態(tài),且破骨細(xì)胞數(shù)量較control組顯著增多。而軟質(zhì)飼料喂養(yǎng)組雖然依舊存在炎細(xì)胞的浸潤,但其炎性浸潤程度較正常飼料喂養(yǎng)組明顯減輕,牙槽骨平整度也相對較好,破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少,也進(jìn)一步證實了三維重建后的Micro-CT觀察結(jié)果。

研究發(fā)現(xiàn),成骨細(xì)胞的特征性蛋白,如堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白(osteopontin)和骨鈣蛋白(osteocalcin)等在牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)隨負(fù)荷施加而加強,并且與咀嚼負(fù)荷作用時間呈正相關(guān)關(guān)系[16]。同時間歇性基底牽張力可使人牙周膜細(xì)胞中與破骨細(xì)胞生成相關(guān)的RANKL和骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)的表達(dá)也產(chǎn)生變化,有利于誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成。正畸患者的齦溝液中RANKL/OPG的比率也明顯高于對照側(cè),證明咀嚼負(fù)荷可以使牙周膜成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,并具備誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的能力[17,18]。另有研究發(fā)現(xiàn),許多骨改建的調(diào)節(jié)因子并不直接作用于破骨細(xì)胞,而是通過影響骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的RANKL表達(dá),來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生成和功能[19]。RANKL為骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞調(diào)控破骨細(xì)胞的重要蛋白,動物實驗證明咀嚼負(fù)荷可以引起牙周膜中RANKL表達(dá)的改變,并且與負(fù)荷大小和作用時間呈相關(guān)關(guān)系,與破骨細(xì)胞的數(shù)目也呈相關(guān)關(guān)系[20-22]。因此,在觀察到形態(tài)學(xué)方面的差異后,我們對取自實驗大鼠的牙周膜組織樣本中COL-1、ALP、RUNX-2等成骨相關(guān),以及RANKL、CTSK和PTHLH等破骨相關(guān)標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行real-time PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比于control組而言,兩個實驗組中RANKL、CTSK和PTHLH等破骨相關(guān)標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05),但其在LPS+soft組的基因表達(dá)水平較LPS有明顯降低的趨勢,其中RANKL和CTSK在LPS組及LPS+soft組間的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。目前研究認(rèn)為RANKL是破骨細(xì)胞活化的關(guān)鍵因子,也有研究證實PTHLH參與了RANKL的表達(dá)和牙槽骨吸收的過程[23,24],CTSK則被認(rèn)為是參與骨吸收過程的關(guān)鍵酶。這些破骨因子在正常硬度飼料喂養(yǎng)組中的高表達(dá)與在軟飼料喂養(yǎng)組中相對較低的表達(dá)無疑是個很好的證據(jù),提示破骨效應(yīng)在正常硬度飼料喂養(yǎng)組中較軟質(zhì)飼料喂養(yǎng)組更加活躍。本實驗中,COL-1、ALP、RUNX-2等成骨相關(guān)因子的基因表達(dá)水平在LPS組、LPS+soft組及control組的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義,這可能與大鼠局部炎癥狀態(tài)下的成骨微環(huán)境、樣本數(shù)量以及實驗觀察時間等有關(guān)。以上結(jié)果表明在不同的咀嚼載荷作用下,牙周膜細(xì)胞的成/破骨狀態(tài)會達(dá)到一個新的平衡,但想要通過較小的力刺激,來達(dá)到促進(jìn)成骨的目的,還需要進(jìn)一步的研究證實,后期實驗設(shè)計中可以嘗試延長實驗周期、增加樣本數(shù)量等方法驗證實驗結(jié)論。

綜上所述,通過本實驗我們可以得到以下結(jié)論:通過改變食物硬度的方法來探究不同大小力學(xué)載荷下實驗性牙周炎大鼠牙周組織的骨代謝效應(yīng)變化是可行的;改變食物硬度會導(dǎo)致炎性牙周組織出現(xiàn)不同的破骨效應(yīng);牙周炎癥環(huán)境下,較軟食物有減輕其炎性狀態(tài)及破骨效應(yīng)的作用。但對于不同咀嚼載荷下炎性牙周膜細(xì)胞骨代謝效應(yīng)改變的相關(guān)分子機制,仍需后續(xù)實驗研究進(jìn)一步探討。

在臨床工作中,牙列缺損的患者其余留牙常常伴有不同程度的牙周炎癥,采取傳統(tǒng)修復(fù)方式則需要鄰缺隙基牙承擔(dān)更多的咀嚼載荷,這就給因炎癥本身牙周潛力已經(jīng)下降的余留牙帶來了更大的負(fù)擔(dān)。而本研究結(jié)果提示我們,在為患有牙周炎的牙列缺損患者設(shè)計制作義齒時,除了應(yīng)盡可能地分散基牙所受咬合力,還應(yīng)囑咐患者盡量降低食物硬度,減輕咀嚼負(fù)載,以減輕患牙區(qū)牙槽骨吸收程度,從而延長余留牙及義齒的使用壽命。