陳瑾，秦霞，黃慧，許健

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與信息工程學(xué)院，杭州 310053）

細(xì)胞凋亡是在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過程，其受一系列基因、蛋白的嚴(yán)密調(diào)控，最后細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，被其他細(xì)胞吞噬。細(xì)胞凋亡異常與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]，準(zhǔn)確地對細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測是細(xì)胞化學(xué)研究的重要技術(shù)手段。目前在細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，生物化學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等技術(shù)均已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡的檢測[2]。流式細(xì)胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）因其快速、準(zhǔn)確、多參數(shù)，并能對單個細(xì)胞逐一檢測的特征，在凋亡檢測中占據(jù)重要地位，其中基于凋亡細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸（phosphatidyl-serine, PS）外翻特征的Annexin V-FITC/PI 雙染法操作簡便、重復(fù)性好，是目前最常用的細(xì)胞凋亡檢測方法[3]，許多高校加強(qiáng)了對該技術(shù)的教學(xué)重視。然而流式細(xì)胞儀為高精密度、復(fù)雜貴重儀器，高校實驗場地局限、儀器缺乏，教學(xué)還處于基本理論知識普及和基礎(chǔ)操作示教階段，學(xué)生僅在課堂上認(rèn)識和了解儀器結(jié)構(gòu)和原理，卻難以達(dá)到理論與應(yīng)用融會貫通[4]。

虛擬仿真實驗通過計算機(jī)模擬并創(chuàng)建三維動態(tài)視景和行為實體，將學(xué)習(xí)人員置于模擬實驗環(huán)境中操作學(xué)習(xí)，并完成各種實驗項目。利用虛擬仿真技術(shù)沉浸性、交互性和構(gòu)想性特征，全數(shù)字建模仿真，虛擬空間情景漫游，解決了課堂中復(fù)雜儀器技術(shù)艱深難懂的教學(xué)難點，提升學(xué)生的動手操作能力，在節(jié)約大型儀器投入的基礎(chǔ)上，讓學(xué)生熟悉儀器原理與操作環(huán)節(jié)，成為“互聯(lián)網(wǎng)+”實踐教學(xué)改革的新起點[5]。但虛擬仿真操作程序是一套既定的流程，無法完全預(yù)測學(xué)生在真實操作過程中可能遇到的突發(fā)狀況，不利于學(xué)生應(yīng)變能力、分析問題和解決問題的能力培養(yǎng)[6]。因此傳統(tǒng)的線下教學(xué)與孤立的線上教學(xué)都難以取得最佳學(xué)習(xí)效果。

混合式教學(xué)即線上學(xué)習(xí)和面授學(xué)習(xí)的混合，是在“互聯(lián)網(wǎng)+”背景下，現(xiàn)代信息技術(shù)與教學(xué)過程深度融合的產(chǎn)物?；旌鲜浇虒W(xué)模式以滿足學(xué)生個性化、智能化、信息化、定制化的學(xué)習(xí)需求為目標(biāo)，實現(xiàn)翻轉(zhuǎn)課堂，達(dá)成線上新知學(xué)習(xí)和線下知識內(nèi)化的完美結(jié)合[7]。針對“互聯(lián)網(wǎng)+”時代下混合式教學(xué)的學(xué)習(xí)理論、教法學(xué)基礎(chǔ)、方法論等已有系列研究[8,9]?；旌鲜綄W(xué)習(xí)用建構(gòu)主義理論解釋個性化知識的習(xí)得，用聯(lián)通主義理論解釋創(chuàng)造性知識的生成，促使教師由學(xué)科專家、知識傳授者轉(zhuǎn)變?yōu)閷W(xué)習(xí)設(shè)計者和學(xué)習(xí)促進(jìn)者。

因此，本文以細(xì)胞凋亡的流式檢測為例，著力構(gòu)建線上線下聯(lián)動教學(xué)，以線上虛擬仿真操作為主，掌握實驗原理、儀器結(jié)構(gòu)和基本操作，培養(yǎng)學(xué)生自主學(xué)習(xí)能力；輔以線下重點示教，解讀凋亡流式檢測過程中的注意事項和問題分析，提升學(xué)生綜合實踐能力。

1 教學(xué)目標(biāo)

知識目標(biāo)：通過線上虛擬演練、線下示教，學(xué)生掌握細(xì)胞凋亡流式檢測的基本原理、操作與技術(shù)要求，并掌握Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡雙染法流式檢測結(jié)果的解讀。

能力目標(biāo)：在線上虛擬仿真操作中，培養(yǎng)學(xué)生自主學(xué)習(xí)，發(fā)現(xiàn)問題、分析問題的能力，鍛煉獨立探索精神，結(jié)合線下重點示教、疑難解答，加強(qiáng)團(tuán)隊合作意識，提升解決問題的能力。

2 教學(xué)理念與方法

在教學(xué)中，采用“建構(gòu)主義”教學(xué)思想[10]，最直接的體現(xiàn)就是以學(xué)生為中心，根據(jù)學(xué)生的不同狀況實施相應(yīng)的教學(xué)，實現(xiàn)因材施教，由傳統(tǒng)的知識歸納、邏輯演繹式的講解轉(zhuǎn)變?yōu)閯?chuàng)設(shè)情境、協(xié)作學(xué)習(xí)、自主學(xué)習(xí)，真正動手操作實驗，成為知識的探索者和學(xué)習(xí)認(rèn)知主體。采用線上線下虛實結(jié)合教學(xué)法（圖1）。

圖1 線上線下虛實結(jié)合教學(xué)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the online and offline mixed teaching mode

2.1 虛擬教學(xué)法

通過虛擬仿真技術(shù)在線還原流式細(xì)胞凋亡檢測的真實場景，完成細(xì)胞樣本準(zhǔn)備、流式細(xì)胞儀調(diào)試、檢測方案建立、數(shù)據(jù)采集與結(jié)果分析等在線虛擬操作，讓學(xué)生在虛擬實驗中掌握流式凋亡檢測原理、操作方法和注意事項等知識點。

2.2 現(xiàn)實教學(xué)法

虛擬仿真實驗按既定標(biāo)準(zhǔn)流程設(shè)置，針對實驗中可能出現(xiàn)的問題不能很好示范教學(xué)，因此在課堂教學(xué)中輔以樣品前處理操作和流式細(xì)胞儀檢測示教，重點指出流式凋亡檢測注意事項。

樣本制備：流式樣本要求單細(xì)胞懸液，樣本制備好壞直接影響檢測結(jié)果，在本實驗中采用Raw264.7細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，在收集細(xì)胞懸液過程更要注意消化過程對細(xì)胞活力影響。

儀器調(diào)試：流式的復(fù)雜在于其參數(shù)的設(shè)置，在檢測過程中，考慮流式細(xì)胞儀閾值、電壓、補(bǔ)償、圈門不合理對結(jié)果的影響。

上述注意點在虛擬仿真實驗中無法細(xì)致展示，通過課堂教學(xué)彌補(bǔ)，達(dá)到以虛促實，虛實結(jié)合的教學(xué)目的，同時培養(yǎng)學(xué)生發(fā)發(fā)現(xiàn)問題，分析問題，解決問題的能力。

3 教學(xué)過程實施

3.1 視頻演示自學(xué)

課程首先通過細(xì)胞凋亡和流式細(xì)胞術(shù)動畫演示視頻，引導(dǎo)學(xué)生主動學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞凋亡和流式細(xì)胞術(shù)的基本概念、原理、檢測步驟等，達(dá)到知識目標(biāo)。本實驗采用Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡，其原理是凋亡早期細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸由細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層內(nèi)層轉(zhuǎn)移到外層，其對FITC標(biāo)記的Annexin V具有高度親和力，顯示綠色熒光；PI不能通過細(xì)胞膜，只有當(dāng)細(xì)胞處于晚期凋亡和壞死狀態(tài)，細(xì)胞膜受損時，PI可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并嵌入DNA雙鏈顯示紅色熒光[11]。而流式細(xì)胞儀可對經(jīng)過特異熒光素染色的單細(xì)胞懸液樣品進(jìn)行逐一檢測，樣本被特定波長的激光束照射，細(xì)胞表面的熒光素產(chǎn)生熒光，同時產(chǎn)生光散射，這些混合的光信號經(jīng)光電倍增管和光電二極管轉(zhuǎn)變?yōu)殡娮有盘?，并?jīng)過模數(shù)轉(zhuǎn)換器以電子脈沖的形式被計算機(jī)系統(tǒng)接收并分析得出細(xì)胞的生物學(xué)特征[12]。因此將Annexin V-FITC與PI聯(lián)用，在488nm激光器照射下，根據(jù)產(chǎn)生的熒光信號，Annexin-V陰性-PI陰性代表正常細(xì)胞；Annexin-V陽性-PI陰性代表凋亡早期的細(xì)胞；Annexin-V陽性-PI陽性代表凋亡晚期的細(xì)胞或壞死的細(xì)胞；Annexin-V陰性-PI陽性，代表壞死細(xì)胞。學(xué)生通過線上自主學(xué)習(xí)后，在微助教上完成前測知識答題，評價自學(xué)情況。這一過程一方面有助于讓學(xué)生對照實驗?zāi)繕?biāo)找出學(xué)習(xí)薄弱環(huán)節(jié)，針對易錯點，課堂上重點闡述；另一方面可以激活先備知識，將相關(guān)的細(xì)胞化學(xué)、分子生物學(xué)、儀器分析等知識點串聯(lián)起來，逐步建立知識體系。

3.2 線上虛擬仿真教學(xué)

學(xué)生在線完成細(xì)胞凋亡流式檢測模擬演練。首先是樣本制備，包括獲得暴露后的單細(xì)胞懸液、Annexin-V-FITC孵育、洗滌離心后PI孵育。隨后模擬操作流式細(xì)胞儀開機(jī)質(zhì)控，掌握流式檢測技術(shù)的基本操作及儀器性能評價。質(zhì)控通過后，方可開始檢測。進(jìn)入虛擬仿真實驗練習(xí)環(huán)節(jié)，每一操作步驟均設(shè)置了說明，指導(dǎo)學(xué)生完成實驗方案建立，上樣、數(shù)據(jù)采集、結(jié)果解讀（圖2）。在關(guān)鍵步驟設(shè)置提問，如在流式細(xì)胞儀調(diào)試中，判讀質(zhì)控結(jié)果，包括變異系數(shù)（coefficient of variation, CV）和熒光強(qiáng)度均值（mean fluorescence intensity, MFI）；在細(xì)胞凋亡檢測中涉及多色熒光，注意熒光補(bǔ)償?shù)恼_調(diào)節(jié)，系統(tǒng)實現(xiàn)實驗過程智能指導(dǎo)，學(xué)生與線上教師進(jìn)行互動提問與答疑，教師掌握每一位學(xué)生的線上學(xué)習(xí)狀態(tài)。系統(tǒng)具有錯誤提示和自動評價的功能，學(xué)生通過人機(jī)交互的方式，實現(xiàn)邊練習(xí)、邊學(xué)習(xí)、邊調(diào)整，錯誤和不足之處及時得到改正和補(bǔ)充，增強(qiáng)體驗感和互動趣味性。

圖2 細(xì)胞凋亡流式檢測線上虛擬仿真演練流程Fig. 2 Operation stream of the online virtual simulation of cell apoptosis detection by flow cytometry

3.3 線下實操演示

在課堂實驗教學(xué)中，因課時限制，凋亡樣本由教師提前制備好，進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測演示，在此過程中強(qiáng)調(diào)流式細(xì)胞儀凋亡檢測的注意事項，如消化處理產(chǎn)生的死細(xì)胞及細(xì)胞碎片在流式結(jié)果中的判斷，從而提示學(xué)生回憶樣本制備虛擬操作過程中細(xì)胞消化時間、離心條件設(shè)置等注意點，學(xué)會合格樣本的判斷；又如在補(bǔ)償調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，無補(bǔ)償和有補(bǔ)償情形下，各群細(xì)胞的分布，學(xué)生直觀領(lǐng)悟參數(shù)合理設(shè)置的重要性。最后針對流式應(yīng)用中，學(xué)生普遍反映的難點—流式圖譜解讀進(jìn)行重點講述（圖3）。根據(jù)凋亡檢測結(jié)果，闡述流式圖譜橫縱坐標(biāo)參數(shù)類型，結(jié)合視頻中流式采集信號原理，理解不同參數(shù)代表的信號類型、不同群體細(xì)胞揭示的生物學(xué)含義，充分調(diào)動學(xué)生積極思考，能舉一反三，真正學(xué)以致用。

在本實驗中，首先通過散射光信號，包括前向角散射光和側(cè)向角散射光，圈出目的細(xì)胞群，調(diào)節(jié)儀器閾值排除碎片干擾；隨后根據(jù)FITC單標(biāo)管和PI單標(biāo)管調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償；最后在Annexin-V-FITC和PI雙參數(shù)散點圖中，設(shè)置十字門，分析各象限細(xì)胞群含義及比例（圖3）。象限左下為雙陰性群為活細(xì)胞的比例，象限右下為Annexin-V-FITC單陽細(xì)胞群為凋亡早期細(xì)胞的比例，象限右上為雙陽性群為凋亡晚期細(xì)胞的比例，象限左上為PI單陽性群為壞死細(xì)胞群比例。

圖3 細(xì)胞凋亡流式檢測結(jié)果解讀。A，空白管；B ，F(xiàn)ITC單標(biāo)管；C， PI單標(biāo)管；D 雙標(biāo)管Fig. 3 Interpretation of the flow cytometry results of cell apoptosis. A, blank tube; B, FITC single stained tube; C, PI single stained tube; D, FITC and PI double stained tube

3.4 課后拓展

課程結(jié)束后，選取以往凋亡檢測中出現(xiàn)的幾種異常結(jié)果進(jìn)行案例討論，思考實驗中出現(xiàn)的問題以及解決方案，如有的樣本結(jié)果PI單染細(xì)胞比例較高，提示有較多壞死細(xì)胞，可能的原因是什么？判斷熒光補(bǔ)償不足與過度？最后結(jié)合理論介紹的細(xì)胞凋亡檢測方法，形態(tài)變化、DNA斷裂檢測、線粒體膜電位變化等，比較各方法特點，引導(dǎo)學(xué)生實現(xiàn)知識的進(jìn)一步內(nèi)化，充分理解凋亡進(jìn)程。

4 教學(xué)效果評價

基于虛擬仿真技術(shù)的細(xì)胞凋亡流式檢測線上線下混合式教學(xué)改革，形成了“多層次、多形式、多內(nèi)容”的立體化實驗教學(xué)體系。通過課堂前測、后測及虛擬仿真考核模塊，構(gòu)建雙線考核評價和教學(xué)質(zhì)量監(jiān)控體系，切實提高學(xué)生學(xué)習(xí)成效。虛擬仿真系統(tǒng)通過人機(jī)對話模式，實行實時考核方式，系統(tǒng)將根據(jù)學(xué)生在考核中的表現(xiàn)給出系統(tǒng)評價和具體的數(shù)據(jù)分析，通過可視化圖形方式直觀體現(xiàn)學(xué)生操作過程中正確、錯誤及未完成步驟，并給予正確的前10%學(xué)生獎勵分（圖4A），既調(diào)動學(xué)生積極性，又能及時對薄弱的部分進(jìn)行強(qiáng)化改進(jìn)，真正實現(xiàn)過程中全方位評價，并使考核、效果評估進(jìn)一步規(guī)范化與標(biāo)準(zhǔn)化。課堂評測注重理論知識點的掌握，虛擬仿真考核模塊側(cè)重學(xué)生觀察能力、思維能力和操作能力，兩者相互補(bǔ)充。課后對課堂滿意度及學(xué)習(xí)效果開展問卷調(diào)查（圖4B），對教學(xué)設(shè)計、虛擬仿真演練、課后拓展及考核形式的滿意度分別為82.1%、68.2%、88.3%和70.4%，其中對于虛擬仿真演練主要存在問題是軟件操作界面友好性，有待后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行技術(shù)改進(jìn)。在學(xué)習(xí)效果方面，混合式教學(xué)對學(xué)生學(xué)習(xí)興趣、探索精神、實踐能力、自主學(xué)習(xí)能力和分析解決問題能力均有明顯提升（圖4C）。

圖4 教學(xué)效果評價Fig. 4 Evaluation of the teaching effect

5 討論

傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡實驗教學(xué)以實體課堂為教學(xué)形態(tài)，學(xué)校、教材和教師主導(dǎo)著教學(xué)的整個過程，學(xué)生學(xué)習(xí)受到時空和資源等方面條件限制，凋亡檢測多采用形態(tài)觀察，與目前研究中的先進(jìn)檢測技術(shù)脫節(jié)。虛擬仿真技術(shù)有效規(guī)避高校實驗室硬件環(huán)境不足的限制，可促進(jìn)細(xì)胞化學(xué)教學(xué)體系的完善。虛擬仿真項目已成為混合式教學(xué)中優(yōu)質(zhì)在線資源的重要組成部分，本實驗依托流式細(xì)胞儀凋亡檢測虛擬仿真項目，開展線上線下混合式教學(xué)改革。線上虛擬演練，其無時間、空間限制的“游戲式”網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)，提高了學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)自主學(xué)習(xí)能力；線下重點示教，加深理論知識的內(nèi)化，將課堂教學(xué)中理論講解的深刻特點與虛擬仿真實踐操作中高度靈活的自由特點相結(jié)合，形成混合式教學(xué)模式，更有助于提升教學(xué)效果[13]。

在教學(xué)過程及反饋中也發(fā)現(xiàn)了一些問題：首先，線上自學(xué)過程依賴學(xué)生自覺性及領(lǐng)悟性，存在學(xué)生個體差異，對線下的重點示教造成一定難度，后續(xù)將進(jìn)一步加強(qiáng)線上學(xué)習(xí)的過程管理，開展個性化指導(dǎo)，補(bǔ)齊短板；其次，對于虛擬仿真演練，鼠標(biāo)的點擊與實際動手操作存在差異，無法完全預(yù)測學(xué)生在真實操作過程中可能遇到的突發(fā)狀況，尤其在流式參數(shù)設(shè)置中，隨樣本狀態(tài)需不斷調(diào)整，但針對大型儀器課堂教學(xué)無法滿足人人都有操作機(jī)會，因此鼓勵學(xué)生課外多參與學(xué)科競賽，讓科研反哺教學(xué)，提升學(xué)生創(chuàng)新能力。