宋鶴，步鵬，杜海艷，趙國海，張紅玲，王雅婧，張飛，郗彥鳳*

（1山西醫(yī)科大學(xué)病理教研室，太原030001；2山西省腫瘤醫(yī)院病理科，太原 030013）

T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤（T-LBL）是血液系統(tǒng)罕見的惡性腫瘤，具有高度侵襲性，其臨床進(jìn)展迅速且預(yù)后較差，傳統(tǒng)治療方案療效不顯著，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率均較高[1]。同時(shí)由于該疾病較為罕見，臨床資料和研究材料均具有一定的局限性，有關(guān)T-LBL的分子遺傳學(xué)及有效分子靶向治療的資料較為少見。因此，應(yīng)積極尋找與T-LBL的腫瘤形成和發(fā)展相關(guān)的理論機(jī)制，以提供有效的治療和預(yù)防方法。STATs（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子）蛋白是參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和造血等基本生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄因子，截至目前，在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)七種STAT，依次命名為STAT1~STAT6，其中STAT5包括STAT5A和STAT5B[1]。STAT5A和STAT5B是一種廣泛表達(dá)的蛋白，是JAK/STAT信號通路的一部分，具有參與造血調(diào)節(jié)和免疫系統(tǒng)調(diào)控等功能。研究表明，在不同的血液系統(tǒng)疾病中，均可發(fā)現(xiàn)STAT5A、STAT5B蛋白表達(dá)的失調(diào)，這被認(rèn)為是導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展的原因，因此，STAT5A和STAT5B也成為了當(dāng)今血液系統(tǒng)疾病藥物研究的重點(diǎn)[2]。本研究旨在明確STAT5A、STAT5B在T-LBL中的表達(dá)情況及預(yù)后相關(guān)性，著重分析STAT5A及STAT5B之間的臨床病理特征關(guān)系，為T-LBL的臨床診斷及藥物靶向治療提供潛在的理論參考。

資料與方法

1 病例資料

收集整理2001年1月至2020年10月山西省腫瘤醫(yī)院被明確診斷為T-LBL的新發(fā)病例，從中選取出術(shù)前未接受放化療且有完整的病程記錄者共104例，其中男性82例，女性22例；年齡分布在2~75歲，中位年齡為31歲；原發(fā)于淋巴結(jié)內(nèi)98例，原發(fā)于淋巴結(jié)外6例。另選取40例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生（LH）組織作為對照。患者隨訪時(shí)間截止為2020年9月。本研究所用標(biāo)本均已取得山西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會許可。

2 制作組織芯片

用標(biāo)準(zhǔn)石蠟組織芯片制作儀制備孔徑為2.0mm的空白組織芯片。選取T-LBL和LH的石蠟組織標(biāo)本，使用直徑為2.0mm的金屬空心穿刺針在目標(biāo)石蠟組織上穿刺提取組織，并將提取的組織填入組織芯片的相應(yīng)位置。后將制作完成的石蠟組織芯片置于55℃的烤箱中7min，取出室溫下冷卻7min，重復(fù)此步驟，直至目標(biāo)石蠟組織與空白組織芯片充分融合。將制備的組織芯片進(jìn)行3μm的連續(xù)切片，切下的組織置于載玻片之上，放于65℃烤箱中烘烤50min后備用。

3 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色由羅氏公司BenchMarkXT全自動免疫組織化學(xué)儀檢測完成。小鼠抗STAT5A、STAT5B單克隆抗體均購自ThermoFisher Scientific公司，分別按照1:3000和1:3200的稀釋比進(jìn)行稀釋，配備抗體工作液。選正常人體脾組織為STAT5A陽性對照，正常人體肺組織為STAT5B陽性對照。

4 結(jié)果判讀

STAT5A和STAT5B陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核。根據(jù)免疫組織化學(xué)評分法（IRS），STAT5A和STAT5B的染色結(jié)果判讀為陽性細(xì)胞比例評分和染色強(qiáng)度評分的乘積。陽性細(xì)胞比例評分：無陽性細(xì)胞（0分），≤10%陽性細(xì)胞（1分），10%-50%陽性細(xì)胞（2分），51%-80%陽性細(xì)胞（3分），≥80%陽性細(xì)胞（4分）。染色強(qiáng)度評分：無染色（0分），淡黃染色（1分），棕黃染色（2分），棕褐染色（3分）。兩項(xiàng)乘積所得分?jǐn)?shù)即為總分?jǐn)?shù)，總分≥2即判定為陽性，具體評分細(xì)則：0~1分（-）、2~3分（+）、4~8分（++）、9~12分（+++）[3]。所有免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由兩名病理科中級及以上職稱的醫(yī)師采取雙盲法進(jìn)行判讀。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較各組間計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，比較各個(gè)變量之間的相關(guān)性分析使用Spearman相關(guān)性分析，生存及預(yù)后分析采用Kaplan-Meier法進(jìn)行，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 STAT5A在T-LBL中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系

在104例T-LBL臨床病例中，STAT5A陽性率為69%（72/104），其中9例呈弱陽性（+），51例呈陽性（++），12例呈強(qiáng)陽性（+++）。在對照組40例LH標(biāo)本中，STAT5A主要呈弱陽性或陰性，陽性率為5%（2/40），顯著低于T-LBL臨床病例組織（χ2= 12.462，P=0.020）（圖 1，表 1）。

圖1 STAT5A在T-LBL及LH組織中表達(dá)的EnVision法免疫組織化學(xué)檢測。A，STAT5A在LH組織中低表達(dá)/不表達(dá)； B，STAT5A在T-LBL組織中呈弱陽性；C，STAT5A在T-LBL組織中呈中等陽性； D，STAT5A在T-LBL組織中呈強(qiáng)陽性；比例尺20μmFig. 1 Immunohistochemical examination for the expression of STAT5A in T-LBLand LH tissues. A, low expression or no expression of STAT5A in LH tissues; B, weak expression of STAT5A in T-LBL tissues; C, moderate expression of STAT5A in T-LBL tissues; D, strong expression of STAT5A in T-LBL tissues; scale bar, 20μm

STAT5A的表達(dá)與患者的性別有關(guān)（P=0.014，表1），男性患者的陽性表達(dá)率顯著高于女性患者，而與患者的年齡、國際預(yù)后指數(shù)（IPI）評分、血清乳酸脫氫酶（LDH）水平、Ann Arbor分期、縱膈是否增寬、是否累犯骨髓、有無B癥狀等均無關(guān)（表1）?？v膈的寬度與患者的年齡、體型以及呼吸相等相關(guān)，不同的病人其縱膈寬度不同。根據(jù)山西省腫瘤醫(yī)院影像科CT結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)中所涉及104例T-LBL病例中，縱膈增寬者為58例，檢查未見縱膈明顯增寬者為46例。

截止2020年6月底，104例T-LBL患者中，已死亡病例79例，生存病例25例，STAT5A高表達(dá)者總生存期低于低表達(dá)者（P=0.027)（圖2）。

圖2 STAT5A表達(dá)水平與T-LBL患者預(yù)后關(guān)系的 Kaplan-Meier 生存曲線分析Fig. 2 Kaplan-Meier survival curve analysis for the relationship between STAT5A expression level and the prognosis of T-LBL patients

2 STAT5B在T-LBL中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系

STAT5B在T-LBL中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為71%（74/104），其中62例呈強(qiáng)陽性（+++），7例呈陽性（++），5例呈弱陽性（+）。40例LH中，生發(fā)中心呈弱陽性表達(dá)，總陽性表達(dá)率為22.5%（9/40）。STAT5B在T-LBL中的陽性表達(dá)率顯著低于其在LH中的陽性表達(dá)率（χ2=10.753，P=0.043)（表1，圖3）。

圖3 STAT5B在T-LBL及LH組織中表達(dá)的EnVision法免疫組織化學(xué)檢測。A，STAT5B在LH生發(fā)中心低表達(dá)； B，STAT5B在T-LBL組織中呈弱陽性；C，STAT5B在T-LBL組織中呈中等陽性； D，STAT5B在T-LBL組織中呈彌漫性強(qiáng)陽性；比例尺20μmFig. 3 Immunohistochemical examination for the expression of STAT5B in T-LBL and LH tissues. A, low expression of STAT5B in LH tissues; B, weak expression of STAT5B in T-LBL tissues; C, moderate expression of STAT5A in T-LBL tissues; D, diffuse and strong expression of STAT5B in T-LBL tissues; scale bar, 20μm

STAT5B的表達(dá)水平與患者年齡呈負(fù)相關(guān)（P=0.038），而與患者有無B癥狀（B癥狀：1、不明原因高熱，體溫通?！?8℃；2、體重下降，6個(gè)月內(nèi)體重減少超過總體重的10%；3、盜汗）呈正相關(guān)（P=0.036），與患者的性別、IPI評分、Ann Arbor分期、縱膈是否增寬、是否累犯骨髓等無關(guān)（表1）。在104例T-LBL中，STAT5B高表達(dá)患者的總生存期低于低表達(dá)者（P=0.037）（圖4）。

圖4 STAT5B表達(dá)水平與T-LBL患者預(yù)后關(guān)系的 Kaplan-Meier 生存曲線分析Fig. 4 Kaplan-Meier survival curve analysis for the relationship between STAT5B expression level and the prognosis of T-LBL patients

3 T-LBL患者中STAT5A和STAT5B共表達(dá)者與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

在104例T-LBL中，STAT5A、STAT5B均陽性者53例，將其分為一組，其他表達(dá)者共51例，分為另一組，與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析顯示，STAT5A+/STAT5B+組與患者Ann Arbor分期呈正相關(guān)，與患者性別、年齡、IPI評分、LDH活性、是否縱膈增寬、是否累犯骨髓等均無明顯相關(guān)性。STAT5A+/STAT5B+組患者總生存期低于其他組患者（表1，圖5）

圖5 STAT5A與STAT5B共表達(dá)與T-LBL患者預(yù)后關(guān)系的 Kaplan-Meier 生存曲線分析Fig.5 Kaplan-Meier survival curve analysis for the relationship between the co-expression of STAT5A and STAT5B and the prognosis of T-LBL patients

表1 T-LBL組織中STAT5A和STAT5B的免疫組織化學(xué)表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Tab. 1 The expression of STAT5A and STAT5B in T-LBL tissues and their correlation with the clinicopathological factors

討 論

T-LBL是一種罕見的具有高度侵襲性的非霍奇金淋巴瘤，由不成熟的前體T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變生成，多見于兒童及青少年，男性患者多于女性，早期局限于淋巴組織，晚期可累犯骨髓[4]。目前，臨床上治療T-LBL仍以化療為主，但由于其復(fù)發(fā)率較高（40%~60%），此類疾病的總生存率（OS）仍舊較低[5]，因此尋找新的治療方法及預(yù)后指標(biāo)尤為重要。

STAT5是一種廣泛表達(dá)的蛋白質(zhì)，參與干擾素和生長激素等細(xì)胞因子激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其包括STAT5A和STAT5B兩種蛋白，二者具有94%的結(jié)構(gòu)同源性，但從不同的基因轉(zhuǎn)錄而來[6]。STAT5可通過轉(zhuǎn)錄改變或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，誘導(dǎo)抗凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，提供其致癌活性。多項(xiàng)研究表明，各類癌癥如肺癌、胃癌、乳腺癌等，呈STAT5高表達(dá)。Moriggle等[7]的研究顯示，在造血譜系中，單獨(dú)的STAT5激活即可導(dǎo)致骨髓細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。而Li等人[8]的研究證實(shí)，在骨髓瘤和淋巴瘤中，激活的STAT5與TEL/JAK2癌基因的關(guān)聯(lián)可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。STAT5A和STAT5B也分別被認(rèn)為是慢性髓系白血病的發(fā)生、發(fā)展以及急性髓系白血病細(xì)胞的增殖、存活的主要驅(qū)動力[9]。基于多項(xiàng)研究結(jié)果，多種信號通路是白血病/淋巴瘤中化療耐藥的主要原因，而STAT5參與這一系列信號通路，它在白血病/淋巴瘤的增殖中起著至關(guān)重要的作用[10]。Barbara等的研究顯示，增強(qiáng)的STAT5A或STAT5B的作用都可以驅(qū)動外周T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)展，從而將這兩種STAT5分子都定義為治療干預(yù)的靶標(biāo)[11]。目前臨床上，一些針對STAT5蛋白的抑制劑正在進(jìn)行研究，STAT5蛋白在各類腫瘤疾病中的表達(dá)情況，也是人們研究的熱點(diǎn)，而STAT5蛋白在T-LBL中的表達(dá)特點(diǎn)，目前尚無定論，STAT5A及STAT5B在T-LBL的發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)系也需進(jìn)一步的探索。

本研究中，我們用免疫組織化學(xué)方法對T-LBL中的STAT5A、STAT5B的表達(dá)進(jìn)行了檢測，與LH組織相比，T-LBL中的STAT5A、STAT5B的表達(dá)均明顯增高，且STAT5B的表達(dá)主要是在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，而STAT5A的表達(dá)則主要集中在細(xì)胞核，此結(jié)果與S?awinska等人[12]在基底細(xì)胞癌中的報(bào)道一致。另根據(jù)免疫反應(yīng)評分法，在104例T-LBL病例中，STAT5B表達(dá)強(qiáng)陽性者為62例，占總表達(dá)陽性者的比例為84%（62/74），而STAT5A蛋白表達(dá)陽性者為51例，占總表達(dá)陽性者比重為71%（51/72），STAT5B的表達(dá)更強(qiáng)烈，這表明STAT5B可能在TLBL的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮更為重要的作用。

此外，STAT5B可能與維持性別差異有關(guān)，在肺組織中的實(shí)驗(yàn)表明，男性STAT5B的表達(dá)普遍低于女性[13]。本研究顯示，STAT5A在T-LBL中的表達(dá)與患者性別有一定的相關(guān)性，男性患者的陽性表達(dá)率高于女性患者，而STAT5B的表達(dá)與患者的性別無明顯的相關(guān)性，此與以前報(bào)道不符，表明STAT5B在不同組織表達(dá)中結(jié)果可能有所不同，也可能與T-LBL多發(fā)于男性患者有關(guān)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)STAT5B的表達(dá)與T-LBL患者的年齡具有一定的相關(guān)性，分析顯示， 60歲以上患者的STAT5B的陽性表達(dá)率明顯低于60歲以下的患者，但由于本實(shí)驗(yàn)中60歲以上患者僅為4例，結(jié)論僅作參考。STAT5B的陽性表達(dá)與患者是否存在B 癥狀有關(guān)，存在B癥狀的患者陽性表達(dá)率較高，這一結(jié)果或可幫助臨床醫(yī)生進(jìn)行診斷。

在生存分析中我們發(fā)現(xiàn)，STAT5A及STAT5B陽性表達(dá)者的總生存率均低于陰性表達(dá)者，表明二者均可獨(dú)立影響T-LBL的發(fā)生和發(fā)展，而STAT5A及STAT5B共表達(dá)者人數(shù)為53，占所有患者的比例為51%，且總生存率最低，其次為STAT5A-/STAT5B+者，表明STAT5A及STAT5B均參與T-LBL疾病的發(fā)生與發(fā)展，并具有協(xié)同作用，二者在T-LBL患者中常同時(shí)高表達(dá)，預(yù)后最差，而STAT5B與T-LBL的疾病發(fā)展關(guān)系更為密切，STAT5B高表達(dá)者的生存期低于STAT5A高表達(dá)者。而STAT5A及STAT5B在T-LBL中的表達(dá)相關(guān)性不明顯,表明二者在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中具有獨(dú)立性影響。

綜上，本研究利用免疫組織化學(xué)的方法檢測了STAT5A及STAT5B的表達(dá)，證實(shí)其在T-LBL中均有異常高表達(dá)，且高表達(dá)與患者的生存預(yù)后息息相關(guān)，所以抑制STAT5A及STAT5B的表達(dá)將有利于患者的預(yù)后，可為T-LBL患者的臨床診斷及預(yù)后提供一定的參考，也為T-LBL的靶向治療提供了新的潛在的研究方向。但本研究僅限于蛋白水平，對于STAT5A及STAT5B更深層次的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。