王志強(qiáng)，韓曄紅，閆宏遠(yuǎn),

(1.河北大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,河北省公共衛(wèi)生安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 藥學(xué)院,藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002)

天然產(chǎn)物具有來源豐富、結(jié)構(gòu)多樣等特點(diǎn)，是藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的重要來源，在藥物研發(fā)中扮演著極為重要的角色.據(jù)統(tǒng)計(jì)，從1981年到2019年，在全球批準(zhǔn)的1 881種臨床藥物中有49.5%直接或間接來源于天然產(chǎn)物，以天然產(chǎn)物為基礎(chǔ)研發(fā)新藥的成功率遠(yuǎn)高于化學(xué)合成物質(zhì)[1].從天然提取物中發(fā)現(xiàn)藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)是天然來源藥物研發(fā)的基礎(chǔ)，新穎天然活性物質(zhì)的快速篩選鑒定是獲得藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)關(guān)鍵.但由于天然提取物的化學(xué)組成復(fù)雜且各組分含量差異巨大，給天然活性物質(zhì)的篩選鑒定造成了巨大困難，嚴(yán)重阻礙了新藥研發(fā)的進(jìn)程.

目前，從復(fù)雜提取物中篩選鑒定天然活性物質(zhì)的研究普遍面臨以下幾個(gè)問題：1)經(jīng)過數(shù)十年的篩選研究，大量天然活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)有的研究結(jié)果大都是對(duì)已知活性物質(zhì)的重復(fù)發(fā)現(xiàn)，新穎活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)比較困難；2)篩選復(fù)雜提取物中的微量組分是發(fā)現(xiàn)新穎天然活性物質(zhì)的有效途徑，但傳統(tǒng)活性追蹤分離法反復(fù)“分離-活性評(píng)價(jià)-組分鑒定”的過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不但無法在分離前確定活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)新穎性，而且還容易在富集純化過程中丟失微量活性物質(zhì)；3)隨著新技術(shù)和新材料的快速發(fā)展，現(xiàn)代分析化學(xué)技術(shù)可以為復(fù)雜提取物分析提供更全面和更準(zhǔn)確的成分與結(jié)構(gòu)表征信息，但各組分的生物活性仍很難做到分離前的表征和預(yù)測(cè)；4)常規(guī)的高通量篩選方法主要是針對(duì)小分子化合物庫所開發(fā)的，并不完全適用于從復(fù)雜混合物中篩選活性物質(zhì).因此，提高天然活性物質(zhì)篩選效率需要構(gòu)建新的策略.

1 親和超濾技術(shù)篩選天然活性物質(zhì)的原理和影響因素

1.1 親和超濾技術(shù)的原理

親和超濾是一種將親和捕獲與超濾分離相結(jié)合以實(shí)現(xiàn)化合物高通量篩選的技術(shù)，如圖1所示.

圖1 親和超濾技術(shù)原理Fig.1 Principles of affinity ultrafiltration techniques

其工作原理是將藥物靶標(biāo)(如蛋白酶、受體、DNA等生物大分子)與小分子混合物(如天然提取物等)在一定條件下培育后，藥物靶標(biāo)將從小分子混合物中選擇性吸附與其具有親和作用的小分子，并以非共價(jià)的形式結(jié)合成復(fù)合物，然后采用適當(dāng)孔徑的超濾膜，通過離心的方式將非共價(jià)復(fù)合物與其他游離小分子分開，繼而實(shí)現(xiàn)活性物質(zhì)分析檢測(cè)[2].親和超濾技術(shù)根據(jù)分析方式，可以分為解離配體小分子分析模式(BFA)和游離小分子分析模式(UFA)[3].BFA是親和超濾實(shí)驗(yàn)常用的分析方式，其一般工作流程包括親和培育、離心超濾、配體解離和分析檢測(cè)，即需要在親和超濾實(shí)驗(yàn)后，收集純化后的非共價(jià)復(fù)合物，并利用適當(dāng)?shù)姆椒?如加入有機(jī)試劑、改變pH、超聲等)將藥物靶標(biāo)變性，使配體小分子從非共價(jià)復(fù)合物上解離下來用于后續(xù)分析檢測(cè)，以獲取活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息.UFA則是在親和超濾實(shí)驗(yàn)后，直接分析超濾液中的游離小分子，通過與對(duì)照組(培育過程中未添加藥物靶標(biāo))比較檢測(cè)信號(hào)的差異，以鎖定活性物質(zhì)并獲取其結(jié)構(gòu)信息.

BFA在親和超濾之后仍需清洗非共價(jià)復(fù)合物、解離配體小分子、收集與富集配體小分子等操作[4]，工作流程較為復(fù)雜.由于實(shí)驗(yàn)過程中藥物靶標(biāo)的使用量一般比較少，回收得到的配體小分子濃度即使經(jīng)過濃縮往往仍然處于較低水平，導(dǎo)致分析檢測(cè)結(jié)果中活性物質(zhì)的信號(hào)響應(yīng)值普遍偏低，因此一般需要使用質(zhì)譜等較為靈敏的檢測(cè)手段.BFA工作流程需要在親和超濾實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)非共價(jià)復(fù)合物進(jìn)行反復(fù)清洗，以避免游離小分子殘留在非共價(jià)復(fù)合物層相中，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn).但清洗過程又可能會(huì)使低親和力配體小分子從非共價(jià)復(fù)合物上解離下來，因此BFA僅能用于藥物靶標(biāo)的高親和力配體篩選.此外，由于一些高親和力配體與藥物靶標(biāo)在培育過程中形成了極為穩(wěn)定的構(gòu)象，會(huì)產(chǎn)生配體小分子不易從非共價(jià)復(fù)合物上解離脫落的現(xiàn)象，也因此無法準(zhǔn)確獲取活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息.

UFA在親和超濾之后可以直接將超濾液中的游離小分子用于分析檢測(cè)，工作流程比較簡(jiǎn)單[5]，降低了因操作繁復(fù)導(dǎo)致結(jié)果誤差產(chǎn)生的可能性.因?yàn)閁FA省去了清洗、解離、收集與富集等步驟，所以UFA可以同時(shí)滿足高親和力配體和低親和力配體的靶向篩選，檢測(cè)分析結(jié)果也將具有更為靈敏的配體檢測(cè)信號(hào)響應(yīng).但是，通過UFA篩選活性物質(zhì)需要設(shè)置對(duì)照組，即不添加藥物靶標(biāo)進(jìn)行培育.與對(duì)照組相比，檢測(cè)結(jié)果中信號(hào)響應(yīng)值降低的小分子即視為活性物質(zhì)，表明其與生物大分子結(jié)合形成了非共價(jià)復(fù)合物.但是由于UFA具有更為靈敏的小分子檢測(cè)信號(hào)響應(yīng)，在信號(hào)響應(yīng)值比較的過程中，容易發(fā)生因本底信號(hào)噪聲過大，不易從復(fù)雜體系樣品中分辨活性物質(zhì)，導(dǎo)致假陰性結(jié)果現(xiàn)象.此外，若利用UFA篩選酶抑制劑時(shí)，復(fù)雜體系樣品中可能會(huì)存在一些物質(zhì)，在培育過程中作為底物參與酶催化反應(yīng)被轉(zhuǎn)化為了其他物質(zhì)，因此檢測(cè)結(jié)果中一些物質(zhì)的信號(hào)響應(yīng)值降低，并不能完全表明該物質(zhì)與藥物靶標(biāo)結(jié)合形成了非共價(jià)復(fù)合物，容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)[6-7].

1.2 影響親和超濾競(jìng)爭(zhēng)性親和的因素

因?yàn)樘烊惶崛∥锝M成成分復(fù)雜且各組分的含量和性質(zhì)各異，所以無論是采用BFA還是UFA分析模式，在親和超濾實(shí)驗(yàn)過程中，天然提取物都極易與藥物靶標(biāo)產(chǎn)生復(fù)雜的相互作用，即原本能和藥物靶標(biāo)結(jié)合生成非共價(jià)復(fù)合物的配體小分子，由于其他小分子的競(jìng)爭(zhēng)性親和作用，使該配體-靶標(biāo)非共價(jià)復(fù)合物無法形成的現(xiàn)象.影響上述競(jìng)爭(zhēng)性親和作用的因素主要有2個(gè)，一個(gè)是配體小分子與藥物靶標(biāo)的結(jié)合親和力，另一個(gè)是配體小分子與藥物靶標(biāo)在親和培育體系中的濃度[8].配體小分子與藥物靶標(biāo)的結(jié)合親和力越強(qiáng)，表明該配體越易與該靶標(biāo)結(jié)合形成非共價(jià)復(fù)合物.當(dāng)2種配體小分子濃度相近且與某藥物靶標(biāo)具有相同結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，具有較高結(jié)合親和力的配體小分子會(huì)優(yōu)先與藥物靶標(biāo)形成非共價(jià)復(fù)合物；一旦藥物靶標(biāo)濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于配體小分子的濃度，低親和力配體小分子則無法與藥物靶標(biāo)形成復(fù)合物.然而，即使靶標(biāo)濃度較低，若具有較高結(jié)合親和力配體小分子的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于低親和力配體小分子，由于高親和力配體與靶標(biāo)接觸的概率大大降低，低親和力配體則有了與靶標(biāo)結(jié)合形成非共價(jià)復(fù)合物的機(jī)會(huì).這種復(fù)雜的競(jìng)爭(zhēng)性親和作用是導(dǎo)致親和超濾假陰性篩選結(jié)果的主要原因，通過優(yōu)化樣品濃度、靶標(biāo)濃度、培育時(shí)間、培育溫度、緩沖液pH、離心轉(zhuǎn)速等親和超濾實(shí)驗(yàn)條件因素，可以增加復(fù)雜提取物中各類型配體與靶標(biāo)形成非共價(jià)復(fù)合物的機(jī)會(huì)，能最大程度上減少競(jìng)爭(zhēng)性親和作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[9].

然而，優(yōu)化親和超濾實(shí)驗(yàn)條件會(huì)促進(jìn)配體小分子與藥物靶標(biāo)的非特異性結(jié)合，這種非特異性結(jié)合則是導(dǎo)致親和超濾假陽性篩選結(jié)果的主要原因.相關(guān)研究結(jié)果表明[10]，通過合理運(yùn)用競(jìng)爭(zhēng)性親和作用，即在親和培育體系中加入某已知配體分子作為阻位劑，利用阻位劑占據(jù)靶點(diǎn)的特異性結(jié)合位點(diǎn)，阻礙提取物中活性物質(zhì)與藥物靶標(biāo)形成非共價(jià)復(fù)合物，達(dá)到區(qū)分配體小分子與靶標(biāo)特異性和非特異性結(jié)合的目的.為了獲得更好的區(qū)分效果，阻位劑與藥物靶標(biāo)應(yīng)具有較高的親和力，其在親和培育體系中的濃度也需要優(yōu)化.實(shí)際上，復(fù)雜提取物與藥物靶標(biāo)的相互作用是更為復(fù)雜的，利用阻位劑的競(jìng)爭(zhēng)性親和作用也并不能適用于區(qū)分所有靶標(biāo)與配體的非特異性結(jié)合.例如，醛糖還原酶與輔酶和底物的結(jié)合位點(diǎn)是一條極為深廣的溝壑，幾乎不存在能完整占據(jù)整個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)的阻位劑存在，當(dāng)選擇的阻位劑與配體分子的結(jié)合位點(diǎn)不能重合時(shí)，這一方法也就失效了.

綜上所述，與其他天然活性物質(zhì)篩選方法相比，親和超濾技術(shù)無需對(duì)藥物靶標(biāo)或任何小分子進(jìn)行標(biāo)記，僅需數(shù)微克至數(shù)十毫克的藥物靶標(biāo)，即可從復(fù)雜混合物中選擇性識(shí)別藥物靶標(biāo)的特異性配體.此外，由于親和超濾靶標(biāo)與小分子結(jié)合為非共價(jià)復(fù)合物的過程是在靶標(biāo)分子最適的緩沖溶液體系中進(jìn)行的，因此可以最大程度上的保持靶標(biāo)與非共價(jià)復(fù)合物的天然構(gòu)象，保障篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性.利用親和超濾技術(shù)篩選天然活性物質(zhì)時(shí)，要依據(jù)靶標(biāo)特性和實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮侠磉x用BFA或UFA分析模式，優(yōu)化親和超濾實(shí)驗(yàn)分析條件，選擇合適的阻位劑，可以大大提高篩選結(jié)果的可靠性(圖2)[8].

圖2 提高親和超濾篩選結(jié)果可靠性的實(shí)驗(yàn)流程Fig.2 Approach for improving the results reliability of affinity ultrafiltration screening

2 親和超濾篩選數(shù)據(jù)的量化分析

活性物質(zhì)與藥物靶標(biāo)之間的結(jié)合親和力是決定其生物活性的關(guān)鍵因素之一，也是評(píng)價(jià)該活性物質(zhì)成藥潛力的重要指標(biāo)之一.親和超濾作為一種天然活性物質(zhì)篩選技術(shù)，目前絕大部分研究均是對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單的定性篩選，鮮有量化分析親和超濾數(shù)據(jù)的報(bào)道，因此研究人員無法利用篩選結(jié)果計(jì)算或推測(cè)活性物質(zhì)與靶標(biāo)之間的結(jié)合親和力.在一些工作中，研究人員利用UFA分析模式，分別獲取活性物質(zhì)與靶標(biāo)親和培育前后的信號(hào)響應(yīng)值，活性物質(zhì)與靶標(biāo)親和培育前的信號(hào)響應(yīng)值可以反映活性物質(zhì)在復(fù)雜樣品體系中的初始濃度，活性物質(zhì)與靶標(biāo)親和培育后的信號(hào)響應(yīng)值可以反映復(fù)雜樣品體系中未與靶標(biāo)結(jié)合的活性物質(zhì)濃度，利用式(1)可以計(jì)算出該物質(zhì)與靶標(biāo)的結(jié)合率(BD).

(1)

式中，BD表示結(jié)合率；A0表示活性物質(zhì)與靶標(biāo)親和培育前的信號(hào)響應(yīng)值；A表示活性物質(zhì)與靶標(biāo)親和培育后達(dá)到平衡時(shí)的信號(hào)響應(yīng)值.Wang等[8]通過計(jì)算擬合發(fā)現(xiàn)BD確實(shí)與結(jié)合親和力存在一定的相關(guān)性，但該方法僅能通過比較不同活性物質(zhì)的BD值來推測(cè)各活性物質(zhì)親和力的大小關(guān)系，而無法真正做到親和力的量化計(jì)算.

2011年，Shibata等[11]首次建立了親和超濾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的化學(xué)計(jì)量值與結(jié)合親和力之間的函數(shù)關(guān)系，見式(2)，并通過計(jì)算擬合和實(shí)驗(yàn)計(jì)算的方式證明了該函數(shù)關(guān)系的成立.

(2)

式中，[L]表示親和培育后未與靶標(biāo)結(jié)合的游離小分子濃度；[L]0表示親和培育前游離小分子的初始濃度；[P]0表示靶標(biāo)的初始濃度；Kd表示解離常數(shù).但該研究并未考慮復(fù)雜體系樣品中多配體與藥物靶標(biāo)之間存在的競(jìng)爭(zhēng)性親和等復(fù)雜相互作用，在計(jì)算親和力時(shí)需要提前獲知靶標(biāo)初始濃度、配體初始濃度和配體達(dá)到親和平衡時(shí)的濃度，因此該函數(shù)僅適用于單個(gè)分子與藥物靶標(biāo)的親和超濾分析結(jié)果量化.

2015年，Qin等[12]重新構(gòu)建了親和超濾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的化學(xué)計(jì)量值與結(jié)合親和力之間的函數(shù)關(guān)系，見式(3)，并通過實(shí)驗(yàn)計(jì)算和等溫滴定量熱法驗(yàn)證了該函數(shù)關(guān)系是成立的.

(3)

式中,n代表某混合物中含有n個(gè)配體;m代表混合物中的一個(gè)特定配體;i代表混合物中的一個(gè)任意配體；Kdm表示配體m的解離常數(shù);[P]0表示靶標(biāo)的初始濃度;[Lm]0表示配體m的初始濃度;[PLi]表示各配體與靶標(biāo)形成復(fù)合物的總濃度；[PLm]表示配體m與靶標(biāo)形成復(fù)合物的濃度.該研究考慮了復(fù)雜體系樣品中多配體與藥物靶標(biāo)之間存在的競(jìng)爭(zhēng)性親和等復(fù)雜相互作用，但在計(jì)算親和力時(shí)同樣需要提前獲知靶標(biāo)初始濃度、配體初始濃度和配體達(dá)到親和平衡時(shí)的濃度等參數(shù)，因此該方法僅適用于小分子化合物庫的親和超濾分析結(jié)果量化.

2019年，Wang等[13]在充分考慮了復(fù)雜體系樣品中多配體與藥物靶標(biāo)之間存在的競(jìng)爭(zhēng)性親和等復(fù)雜相互作用后，構(gòu)建了一種基于one-to-one結(jié)合模式的適用于復(fù)雜未知樣品體系的親和超濾分析結(jié)果量化策略(圖3)，詳細(xì)描述了親和超濾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的化學(xué)計(jì)量值與結(jié)合親和力之間的關(guān)系，見式(4)，該研究通過計(jì)算擬合、動(dòng)力學(xué)分析和等溫滴定量熱技術(shù)分析等方法對(duì)量化關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證.

圖3 基于one-to-one結(jié)合模式的親和超濾分析結(jié)果量化策略[13]Fig.3 Strategy of affinity ultrafiltration for results quantification based on one-to-one binding mode[13]

(4)

式中,i代表混合物中的一個(gè)特定配體;S/Ni表示配體i的信噪比;BDi表示配體i的結(jié)合率;Ri表示配體i的回收率;[E]0表示靶標(biāo)的初始濃度;[Lall]0表示全部配體的初始總濃度;[Lall]表示達(dá)到親和平衡時(shí)全部配體的總濃度;Kdi表示配體i的解離常數(shù).在該關(guān)系中，靶標(biāo)初始濃度可依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜我庠O(shè)置，是實(shí)驗(yàn)已知參數(shù)，S/Ni、BDi和Ri等化學(xué)計(jì)量值均可通過實(shí)驗(yàn)計(jì)算獲得.通過計(jì)算擬合發(fā)現(xiàn)，雖然([Lall]0-[Lall])是無法獲取的未知參數(shù)，但當(dāng)靶標(biāo)初始濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于([Lall]0-[Lall])時(shí)，([Lall]0-[Lall])并不會(huì)影響Kd值計(jì)算結(jié)果，因此該親和超濾分析結(jié)果量化策略滿足了復(fù)雜未知體系樣品的分析要求.

3 親和超濾與其他分析技術(shù)的聯(lián)用情況

3.1 親和超濾與其他分析檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)用

親和超濾技術(shù)本質(zhì)上屬于一種樣品前處理方法，將親和超濾技術(shù)與其他現(xiàn)代分析技術(shù)聯(lián)用，可以實(shí)現(xiàn)不同的分析檢測(cè)目的.如表1所示，親和超濾技術(shù)與液質(zhì)聯(lián)用搭配使用的情況最為常見，因?yàn)殡S著色譜與質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和聯(lián)用技術(shù)的成熟，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可以快速檢測(cè)由親和超濾技術(shù)篩選得到的天然活性物質(zhì)，并獲取其結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)天然活性成分的快速篩選與初步鑒定.此外，親和超濾技術(shù)還常常與搭載紫外或DAD檢測(cè)器的液相色譜技術(shù)聯(lián)用，但由于其檢測(cè)器靈敏度較差，難以應(yīng)用于BFA分析模式，因此在UFA分析模式中更為常見.親和超濾-液相色譜或親和超濾-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在獲取活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的同時(shí)，還能獲取其色譜保留信息，通過與高速逆流色譜技術(shù)聯(lián)用，在天然活性物質(zhì)靶向篩選的基礎(chǔ)上還可以實(shí)現(xiàn)靶向制備分離，用于結(jié)構(gòu)解析和活性確認(rèn).目前，親和超濾-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)還常常與電腦模擬分子對(duì)接等虛擬活性篩查手段聯(lián)合使用，在獲取活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的快速優(yōu)化和活性預(yù)測(cè)，加快新藥研發(fā)的進(jìn)程[14].

3.2 親和超濾與其他樣品前處理技術(shù)的聯(lián)用

天然提取物組成成分復(fù)雜且各組分的含量和性質(zhì)各異，由于受到液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用等分析技術(shù)的分辨率和靈敏度限制，親和超濾技術(shù)難以從復(fù)雜體系樣品中檢測(cè)到由親和超濾技術(shù)篩選的微量活性物質(zhì).高速逆流色譜是一種液-液色譜分離技術(shù)，不需要任何固態(tài)載體，能避免固相載體表面與樣品發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致樣品的污染、失活、變性和不可逆吸附等不良影響.如圖4所示，Wang等[15]將高速逆流色譜與親和超濾技術(shù)結(jié)合，從天麻提取物的212種代謝物中篩選出了17種微量酪氨酸酶抑制劑，實(shí)現(xiàn)了中藥微量活性物質(zhì)的快速篩選，通過控制分析分離條件，高速逆流色譜技術(shù)可以分餾天然產(chǎn)物中的主要成分，并富集微量成分，消除天然產(chǎn)物中不同組分間濃度差異的影響，從而使微量活性物質(zhì)能被親和超濾篩選技術(shù)檢測(cè)分析[15].在另外一項(xiàng)工作中(圖5)，研究人員[16]利用半制備液相色譜分別富集了金銀花提取物中的主要組分和微量組分，同樣達(dá)到了消除提取物中不同組分間濃度差異影響的目的，并應(yīng)用親和超濾-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)篩選鑒定了17種微量神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑.

圖4 基于高速逆流色譜-親和超濾-液相色譜的微量酪氨酸酶抑制劑篩選策略[15]Fig.4 Screening strategy of minor tyrosinase inhibitors based on hyphenation of high-speed countercurrent chromatography, affinity ultrafiltration and liquid chromatography[15]

圖5 2D-HPLC-UF-MS篩選策略[16]Fig.5 Screening strategy of 2D-HPLC-UF-MS[16]

4 親和超濾技術(shù)篩選天然活性物質(zhì)的應(yīng)用現(xiàn)狀

親和超濾技術(shù)1981年首次被應(yīng)用于血清蛋白結(jié)合率的測(cè)定[17].1997年，Wieboldt等[18]首次將親和超濾技術(shù)與液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合，應(yīng)用于小分子化合物庫中藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)，自此親和超濾技術(shù)受到了藥學(xué)界的廣泛關(guān)注.由于親和超濾技術(shù)克服了傳統(tǒng)天然活性物質(zhì)篩選研究面臨的諸多問題，近年來被廣泛應(yīng)用于藥用植物和中藥提取物中活性物質(zhì)的快速靶向篩選(表1).2014年，徐晨等[19]首次應(yīng)用親和超濾技術(shù)篩選中藥復(fù)方二妙丸中的黃嘌呤氧化酶抑制劑，馬麗娜等[20]利用親和超濾技術(shù)首次明確了板藍(lán)根中抗流感病毒的活性成分，共同開啟了親和超濾技術(shù)在中藥復(fù)方及其制劑中藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的應(yīng)用.2021年，Zhong等[21]首次利用親和超濾技術(shù)從蛋白水解物中篩選到具有黃嘌呤氧化酶抑制效果的功能性小分子肽，進(jìn)一步擴(kuò)展了親和超濾技術(shù)的天然活性物質(zhì)篩選范圍.

表1 親和超濾技術(shù)篩選天然活性物質(zhì)的應(yīng)用情況(2016.01～2021.05)

續(xù)表1Continued Tab.1

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從復(fù)雜體系樣品中篩選酶抑制劑是親和超濾技術(shù)最廣泛的一種應(yīng)用，如ɑ-葡萄糖苷酶抑制劑、黃嘌呤氧化酶抑制劑、酪氨酸酶抑制劑、醛糖還原酶抑制劑等.酶作為一類重要的藥物靶標(biāo)，目前已有至少1 500余種被鑒定可作為疾病防治的靶標(biāo)[22-23].然而，從筆者統(tǒng)計(jì)的文獻(xiàn)情況來看，近5年親和超濾技術(shù)僅被應(yīng)用于23種酶抑制劑的篩選研究，這是由于大部分酶試劑還未實(shí)現(xiàn)商品化，而實(shí)驗(yàn)室制備純化過程又極為復(fù)雜，研究人員缺乏獲取新穎靶標(biāo)的途徑，嚴(yán)重限制親和超濾技術(shù)在天然活性成分篩選中的應(yīng)用.即便是商品化成熟的酶試劑，由于其昂貴的價(jià)格，同樣限制了親和超濾技術(shù)的推廣與普及.如圖6所示，Wang等[24]在一項(xiàng)研究中，構(gòu)建了一種從混合靶標(biāo)體系中識(shí)別特定靶標(biāo)配體的親和超濾篩選方法，以肝微粒體為靶標(biāo)，從丹參提取物中靶向篩選了CYP1A2、3A4、2C9的抑制劑，有望解決親和超濾篩選技術(shù)靶標(biāo)獲取困難的問題.

圖6 混合靶標(biāo)體系中識(shí)別特定靶標(biāo)配體的親和超濾篩選策略[24]Fig.6 Screening strategy of affinity ultrafiltration for identifying the ligands of a specific target in a mixed target system[24]

除了酶以外，細(xì)胞器、蛋白受體、DNA等生物大分子，同樣可以作為藥物靶標(biāo)用于活性物質(zhì)的親和超濾篩選.例如，Choi等[25]利用親和超濾技術(shù)篩選了艾草提取物中的PPARɑ配體；Yang等[26]和Liang等[27]分別在2個(gè)研究中，以線粒體作為藥物靶標(biāo)，從虎杖、黃芩和羌活提取物中篩選鑒定了多種天然活性物；Chen等[28]利用親和超濾技術(shù)，從金銀花提取物中發(fā)現(xiàn)了8種與脂質(zhì)體具有相互作用的潛在天然活性成分；馬蕾等[29]利用親和超濾技術(shù)從紅車軸草中發(fā)現(xiàn)了5種DNA結(jié)合劑.

近年來，親和超濾技術(shù)也被應(yīng)用于中藥和藥用植物等天然產(chǎn)物中多靶點(diǎn)活性成分的篩選.例如，2010年，Mulabagal等[30]首次利用親和超濾技術(shù)篩選了惡性瘧原蟲硫氧還蛋白還原酶和谷胱甘肽還原酶的雙靶點(diǎn)配體；2018年，Wang等[24]首次利用親和超濾技術(shù)從丹參提取物中篩選了CYP1A2、3A4和2C9的多靶點(diǎn)抑制劑.中藥和藥用植物等天然產(chǎn)物多組分和多靶點(diǎn)的特性，為闡明其藥效作用機(jī)制帶來了巨大困難，親和超濾技術(shù)在天然多靶點(diǎn)活性物質(zhì)篩選上具有巨大優(yōu)勢(shì)，有望為解決這一科學(xué)問題提供技術(shù)支撐.

5 結(jié)語

親和超濾技術(shù)是一種快速、簡(jiǎn)單、高效的篩選方法，常與高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)結(jié)合使用，近年來被廣泛應(yīng)用于天然提取物、中藥復(fù)方及其制劑、蛋白水解物等復(fù)雜未知樣品體系中酶抑制劑、蛋白受體配體、DNA結(jié)合劑等活性物質(zhì)的篩選.在利用親和超濾技術(shù)篩選天然活性成分時(shí)，由于復(fù)雜樣品體系極易與藥物靶標(biāo)產(chǎn)生復(fù)雜的相互作用，因此要依據(jù)靶標(biāo)特性和實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮侠磉x用BFA或UFA分析模式，優(yōu)化親和超濾實(shí)驗(yàn)分析條件，選擇合適的阻位劑，這樣可以大大提高篩選結(jié)果的可靠性.然而，因?yàn)榇蟛糠炙幬锇袠?biāo)還未實(shí)現(xiàn)商品化，其制備純化過程又極為復(fù)雜，所以研究人員缺乏獲取新穎靶標(biāo)的途徑，親和超濾技術(shù)的應(yīng)用范圍受到了嚴(yán)重限制.隨著新技術(shù)和新材料的快速發(fā)展，將親和超濾技術(shù)與其他現(xiàn)代分析化學(xué)技術(shù)聯(lián)用，有望實(shí)現(xiàn)親和超濾結(jié)果的定量分析，為復(fù)雜樣品體系中天然活性物質(zhì)和多靶點(diǎn)活性物質(zhì)的篩選提供更全面和更準(zhǔn)確的成分與結(jié)構(gòu)表征信息.