趙 航，張文豹，張淑欣，何學(xué)梅，梁 麗

（曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

昆蟲(chóng)授粉是一項(xiàng)重要的生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)，不僅在野生植物的發(fā)育與繁衍中發(fā)揮重要作用，而且保證了農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約有65%的被子植物和86%的農(nóng)作物需要昆蟲(chóng)授粉[2]。蜜蜂是最主要的授粉昆蟲(chóng)，大約有40%的昆蟲(chóng)授粉由蜜蜂完成。蜜蜂授粉可以大幅提升農(nóng)作物收益，我國(guó)每年由蜜蜂授粉促進(jìn)的農(nóng)作物增產(chǎn)產(chǎn)值超過(guò)500 億[3,4]。蜜蜂種類(lèi)繁多，其中意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica） 和中華蜜蜂（Apis cerana cerana） 是我國(guó)2 個(gè)主要養(yǎng)殖品種[5]。中華蜜蜂具有多種優(yōu)良特性，如相較于意大利蜜蜂，中華蜜蜂具有更好的抗螨能力[6]。然而，從1896 年至今，中華蜜蜂種群數(shù)量至少下降了40%[7,8]。近年氣候變化、農(nóng)藥濫用、病蟲(chóng)害頻發(fā)是中華蜜蜂種群數(shù)量快速下降的主要驅(qū)動(dòng)力[7,9,10]。

熱激脅迫是環(huán)境脅迫的一種，它不僅擾亂線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)、破壞細(xì)胞功能，導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷[11]。對(duì)蜜蜂而言，熱激脅迫雖然很少直接殺死蜜蜂，但是會(huì)影響蜜蜂的分布、行為和生理狀態(tài)[12-14]。研究表明，熱激脅迫對(duì)蜜蜂的身體形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育和生殖功能產(chǎn)生不利影響[15-18]。同時(shí)，熱激脅迫還可以與其它脅迫協(xié)同作用，降低蜜蜂對(duì)其它脅迫的耐受能力[12,19]。綜上所述，熱激脅迫對(duì)蜜蜂的生命活動(dòng)產(chǎn)生不可忽視的影響。

在進(jìn)化過(guò)程中，蜜蜂獲得了許多熱激脅迫防御機(jī)制，以減輕熱激脅迫對(duì)自身的傷害[20]。在行為水平上，當(dāng)蜂巢溫度過(guò)高時(shí)，工蜂會(huì)煽動(dòng)翅膀增加散熱。同時(shí)，增加負(fù)責(zé)采水蜜蜂的數(shù)量，并將采集到的水灑在蜂巢上，以降低蜂巢溫度[21-23]。在分子水平上，蜜蜂通過(guò)上調(diào)多種基因和蛋白的表達(dá)來(lái)抵御熱激脅迫，如熱激蛋白家族（Heat shock protein，Hsp）、核因子Y（Nuclear factor Y, NF-Y）、乙酰膽堿酯酶1（Acetylcholinesterase 1, AchE1）[24-26]。其 中，Hsp 家族是熱激脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的一類(lèi)保守蛋白質(zhì)，能幫助蛋白質(zhì)保持正確的構(gòu)象，防止蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集[27]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)揮分子伴侶功能的Hsp 家族是蜜蜂抵御熱激脅迫的關(guān)鍵蛋白。在熱激脅迫條件下，蜜蜂的sHsp22.6、Hsp60、Hsp70ab、Hsp90 均誘導(dǎo)表達(dá)，幫助蜜蜂抵御熱激脅迫[28-30]。這些結(jié)果表明Hsp 家族在抵御熱激脅迫中發(fā)揮重要作用。

DnaJ 家族也稱(chēng)Hsp40 家族，因具有高度保守的J 結(jié)構(gòu)域而得名。蜜蜂DnaJ 家族有二十多個(gè)成員，依據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分為DnaJA、Dna-JB、DnaJC 3 個(gè)亞家族[31]。DnaJ 作為輔助伴侶蛋白，激活分子伴侶蛋白Hsp70 的ATP 酶活性，參與蛋白質(zhì)的翻譯、折疊、去折疊、轉(zhuǎn)位和降解過(guò)程[32]。DnaJB6 是廣泛表達(dá)、功能多樣的1 個(gè)J 結(jié)構(gòu)域蛋白[34]。它具有3 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為N 端的J 結(jié)構(gòu)域、G/F 富集區(qū)和C 端的絲氨酸富集區(qū)域[35,36,37]。由于選擇性剪接，人的DnaJB6 具有2 個(gè)不同長(zhǎng)度的cDNA，它們編碼2 種不同的蛋白質(zhì)，分別稱(chēng)為Dna-JB6a 和DnaJB6b[38]。它們的N 端氨基酸殘基相同，但是DnaJB6a 的C 端有105 個(gè)氨基酸殘基而DnaJB6b 的C 端僅有10 個(gè)氨基酸殘基[39]。C 端氨基酸的差異使二者具有不同的亞細(xì)胞定位。DnaJB6a 具有核定位信號(hào)序列，定位于細(xì)胞核；DnaJB6b 則缺少核定位信號(hào)序列，主要定位于細(xì)胞質(zhì)[40]。在哺乳動(dòng)物中，DnaJB6 參與多種生命活動(dòng)，如小鼠胎盤(pán)發(fā)育、疾病、神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新等[41-45]。但是，作為熱激蛋白家族的成員之一，DnaJB6在中華蜜蜂中的結(jié)構(gòu)以及在熱激脅迫中的作用卻少有報(bào)道。

本研究主要對(duì)中華蜜蜂DnaJB6 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并檢測(cè)其在熱激脅迫下的表達(dá)模式，從而闡明DnaJB6 在中華蜜蜂抵御熱激脅迫中的可能作用。本研究可為進(jìn)一步研究中華蜜蜂DnaJB6 的結(jié)構(gòu)與功能提供理論依據(jù)。同時(shí)，還豐富了蜜蜂熱激脅迫響應(yīng)機(jī)制的理論知識(shí)，對(duì)蜜蜂的育種工作有一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 核酸和氨基酸序列

先前實(shí)驗(yàn)室同學(xué)克隆得到的中華蜜蜂DNAJB6 的編碼區(qū)（Coding sequence，CDS）。其他10 種昆蟲(chóng)的DnaJB6 氨基酸序列是從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的，它們的登錄號(hào)及物種名分 別 為 XP_006564598（Apis mellifera） 、XP_006619442（Apis dorsata）、XP_012342620（Apis florea）、XP_016919326（Apis cerana）、XP_033185595（Bombusvancouverensis nearcticus） 、 XP_012135622（Megachile rotundata） 、 XP_011138491（Harpegnathos saltator）、XP_029665386（Formica exsecta）、XP_035726509（Vespamandarinia） 、XP_015182179（Polistes dominula）。

1.2 生物信息學(xué)分析

首先依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)密碼子表，計(jì)算DnaJB6 的CDS 編碼的氨基酸序列。然后，進(jìn)入Blastx 分析界面，選擇默認(rèn)數(shù)據(jù)庫(kù)、物種insects(taxid:6960)，對(duì)DNAJB6 的CDS 進(jìn)行比對(duì)，尋找與其編碼相似蛋白質(zhì)的基因，初步預(yù)測(cè)DnaJB6的功能。再利用多種生物信息學(xué)軟件分析DnaJB6 的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、信號(hào)序列、蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)、蛋白質(zhì)同源性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、相互作用的蛋白。本文使用的各種生物信息學(xué)分析軟件詳見(jiàn)表1，未特殊說(shuō)明的生物信息學(xué)軟件，均使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

表1 本文使用的多個(gè)生物信息學(xué)分析軟件

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 理化性質(zhì)分析結(jié)果

為了確定中華蜜蜂DnaJB6 的各種理化性質(zhì)，我們利用ProtParam 計(jì)算了它的多個(gè)參數(shù)，結(jié)果如表2 所示。表2 顯示，DnaJB6 相對(duì)分子質(zhì)量為 37.21 kD， 分子式為C1647H2527N479O501S5。在所有氨基酸殘基中，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基有39 個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基54 個(gè)，理論等電點(diǎn)為9.71。DnaJB6的不穩(wěn)定系數(shù)為45.83，大于40 表示蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。同時(shí)，該蛋白質(zhì)的脂溶系數(shù)為47.09，總的親水性平均系數(shù)為-0.913。上述結(jié)果表明，DnaJB6 是一個(gè)帶正電的不穩(wěn)定的親水性蛋白。

表2 中華蜜蜂DnaJB6 的多種理化性質(zhì)

為了進(jìn)一步掌握中華蜜蜂DnaJB6 的親水性，我們使用Protscale 進(jìn)行更加準(zhǔn)確的親疏水性分析，結(jié)果如圖1 和表3 所示。圖1 和表3 顯示，在所有氨基酸中，疏水性最強(qiáng)的是第160 位的甘氨酸殘基，其得分為1.344；親水性最強(qiáng)的是323 位的賴(lài)氨酸殘基，其得分為-3.500。并且該蛋白質(zhì)83%的氨基酸殘基得分為負(fù)數(shù)，負(fù)數(shù)表示親水性。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了中華蜜蜂DnaJB6 的親水性。

圖1 中華蜜蜂DnaJB6 親疏水性分析結(jié)果

表3 中華蜜蜂DnaJB6 的親疏水分析結(jié)果

2.1.3 保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

為了確定中華蜜蜂DnaJB6 的保守結(jié)構(gòu)域，我們利用CD-Search 分析它的氨基酸系列，從而找到保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖2 所示。圖2 顯示，DnaJB6 的3-66 位氨基酸構(gòu)成Pfam 序號(hào)為PF00226 的J 結(jié)構(gòu)域。并且HPD基序與其它的5 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成保守的Hsp70 相互作用位點(diǎn)，介導(dǎo)DnaJB6 與Hsp70的相互作用。這結(jié)果表明，中華蜜蜂DnaJB6具有保守的J 結(jié)構(gòu)域，屬于DnaJ 超家族。

圖2 中華蜜蜂DnaJB6 保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

2.1.4 跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

為了獲知中華蜜蜂DnaJB6 是否具有跨膜結(jié)構(gòu)，我們使用TMHMMServer v.2.0 分析其氨基酸序列，確定其是否具有可形成跨膜結(jié)構(gòu)的α-螺旋，結(jié)果如圖3 所示，DnaJB6 蛋白不僅跨膜螺旋數(shù)為零，而且沒(méi)有跨膜信號(hào)。由此可推測(cè)中華蜜蜂DnaJB6 不具有跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于膜蛋白。

圖3 中華蜜蜂DnaJB6 跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.1.5 亞細(xì)胞定位分析結(jié)果

為了確定中華蜜蜂DnaJB6 的亞細(xì)胞定位，我們采用PSORT II Prediction 預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位，結(jié)果如表4 所示。從表4 可以看出，DnaJB6 有73.9%的可能定位于細(xì)胞核，14.4%的可能定位在細(xì)胞質(zhì)，定位線(xiàn)粒體和細(xì)胞骨架的概率均為4.3%。通過(guò)上述結(jié)果可知中華蜜蜂DnaJB6 很可能是定位于細(xì)胞核的核蛋白。

表4 中華蜜蜂DnaJB6 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果

2.1.6 信號(hào)序列分析結(jié)果

為了確定中華蜜蜂DnaJB6 是否具有信號(hào)序列。如果有，有的又是哪類(lèi)信號(hào)序列。我們使用SignalP-5.0 Server 分析其是否具有信號(hào)肽，結(jié)果如表5 所示，DnaJB6 具有信號(hào)肽的可能性?xún)H為0.06%，無(wú)信號(hào)肽的概率為99.94%。由此可斷定,中華蜜蜂DnaJB6 無(wú)信號(hào)肽。

表5 中華蜜蜂DnaJB6 信號(hào)肽分析結(jié)果

為了確定中華蜜蜂是否具有核定位信號(hào)，我們使用NLStradamus 1.8 分析其可能具有的核定位信號(hào)，結(jié)果如圖4 所示。圖4 顯示，DnaJB6 有86.7%的可能性具有核定位信號(hào)，核定位序列為318-327 位的TKKHDKSKRK。該結(jié)果表明，中華蜜蜂DnaJB6 很可能具有核定位信號(hào)序列。

圖4 中華蜜蜂DnaJB6 核定位信號(hào)序列分析結(jié)果

2.1.7 蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)分析結(jié)果

為了解中華蜜蜂DnaJB 的肽鏈合成后加工情況，我們使用NetPhos 3.1 Server 分析磷酸化修飾位點(diǎn)，結(jié)果如圖5。圖5 顯示，DnaJB6具有49 個(gè)可能的磷酸化修飾位點(diǎn)。在這些磷酸化位點(diǎn)中，絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸位點(diǎn)分別為30、15、4 個(gè)。并且，不同位點(diǎn)的氨基酸殘基由不同的蛋白質(zhì)激酶磷酸化。

圖5 中華蜜蜂DnaJB6 磷酸化修飾位點(diǎn)分析結(jié)果

為了解中華蜜蜂DnaJB 的糖基化修飾情況，我們使用NetOGlyc 4.0 Server 分析DnaJB6的糖基化修飾位點(diǎn)，結(jié)果如圖6 所示。圖6 顯示，DnaJB6 具有15 個(gè)潛在的糖基化修飾位點(diǎn)，分 別 是15、16、74、165、169、172、173、175、177、227、229、240、307、311、318 位氨基酸。在這些糖基化修飾位點(diǎn)中，絲氨酸有11 個(gè)、蘇氨酸為4 個(gè)。綜合磷酸化修飾位點(diǎn)結(jié)果可知，中華蜜蜂DnaJB6 肽鏈合成后，需要進(jìn)行糖基化和磷酸化修飾才能形成成熟的蛋白質(zhì)。

圖6 中華蜜蜂DnaJB6 糖基化修飾位點(diǎn)分析結(jié)果

2.1.8 蛋白質(zhì)同源性分析結(jié)果

為了研究中華蜜蜂DnaJB6 在進(jìn)化過(guò)程中的保守性，我們下載了中華蜜蜂DnaJB6 的Blastp 序列比對(duì)結(jié)果中的蜜蜂科6 個(gè)物種、蟻科2 個(gè)物種和胡蜂科2 個(gè)物種的氨基酸序列。在DNAMAN 軟件中，利用全局比對(duì)算法進(jìn)行多序列比對(duì)，計(jì)算這11 條序列的總體相似度，結(jié)果如圖7 所示，黑色標(biāo)記的是相同的氨基酸位點(diǎn)，粉色標(biāo)記的是75%相似度以上的氨基酸位點(diǎn)，藍(lán)色標(biāo)記的是50%相似度以上的氨基酸位點(diǎn)，未標(biāo)記的為50%以下的氨基酸位點(diǎn)，短橫線(xiàn)為插入的空位。這11 條氨基酸的總相似度達(dá)到86.73%。由此可知，DnaJB6 在進(jìn)化過(guò)程中較為保守。

圖7 11 種膜翅目昆蟲(chóng)DnaJB6 的多序列比對(duì)結(jié)果

為了探究膜翅目DnaJB6 之間的親緣關(guān)系，我們使用Mega7 軟件中的最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建蜜蜂科中蜜蜂屬的Apis mellifera、Apis dorsata、Apis florea、Apis cerana、Apis cerana cerana、熊蜂屬的Bombus nearcticus、切葉蜂屬的Megachile rotundata； 蟻 科 的Harpegnathos saltator、Formica exsecta和胡蜂科Vespa mandarinia、Polistes dominula的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖8 所示。從圖8 可以看出，蟻科和胡蜂科聚為一類(lèi)，再與Megachile rotundata 和Bombus nearcticus聚成大類(lèi)。在自展檢驗(yàn)值高于70的分支中，蟻科的兩個(gè)物種離中華蜜蜂的遺傳距離最遠(yuǎn)，熊蜂屬的Bombus nearcticus遺傳距離最近。由此推測(cè)，在膜翅目Dna-JB6 的遺傳進(jìn)化上，相較于蟻科，中華蜜蜂與胡蜂科親緣關(guān)系更近；在蜜蜂科中，熊蜂屬與中華蜜蜂的親緣關(guān)系更近，切葉蜂屬較遠(yuǎn)。

圖8 最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建的DnaJB6 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.1.9 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

為了解中華蜜蜂DnaJB6 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，我們利用Psipred 4.0 預(yù)測(cè)它的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖9 所示。圖9 顯示，DnaJB 的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括7 個(gè)α 螺旋（粉紅色）、6 個(gè)β 疊片（黃色） 和多個(gè)無(wú)規(guī)卷曲（灰色）。其中，DnaJB6的4-7、16-30、39-55、59-73 位的4 個(gè)α螺旋構(gòu)成保守J 結(jié)構(gòu)域。并且，第二個(gè)和第三個(gè)螺旋之間包含一個(gè)保守的HPD 基序。由此可知，中華蜜蜂DnaJB6 的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋、β 折疊和無(wú)規(guī)卷曲。

圖9 中華蜜蜂DnaJB6 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

為了探究中華蜜蜂DnaJB6 的三維結(jié)構(gòu)，我們采用同源建模的方法，對(duì)中華蜜蜂Dna-JB6 的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表6 和圖10A 所示。表6 和圖10A 顯示，Swiss-model軟件以PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中序號(hào)為6u3r.1 的蛋白為模板。它與中華蜜蜂DnaJB6 的序列相似度為52.69%。該三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的GMQE 值為0.4，QMEAN 為-4.13，存在形式為單體。并且，為了更好的展示中華蜜蜂DnaJB6 的三維結(jié)構(gòu)，我們利用Pymol 2.4.1 軟件對(duì)其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。同時(shí)，計(jì)算DnaJB6 三維結(jié)構(gòu)的表面靜電勢(shì)分布，顯示最保守的HPD 基序的棒狀結(jié)構(gòu)，可視化結(jié)果如圖10B 所示。

表6 同源建模結(jié)果的參數(shù)

圖10 中華蜜蜂DnaJB6 的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及其可視化結(jié)果

在A 和B 圖卡通模式的三維結(jié)構(gòu)中，不同顏色代表不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)。B 圖的表面靜電勢(shì)分布圖中的紅色代表負(fù)的靜電勢(shì)，藍(lán)色代表正的靜電勢(shì)。

2.1.10 蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果

為了研究與中華蜜蜂DnaJB6 相互作用的蛋白質(zhì)，我們使用String11.0 軟件分析與其相互作用的蛋白質(zhì)。 String11.0 自動(dòng)匹配LOC408966 蛋白質(zhì)作為相似蛋白質(zhì)，并依此進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析，得到的結(jié)果如圖11 所示。圖11 顯示，高度可信（得分高于0.7） 的相互作用蛋白質(zhì)有7 個(gè)，其中有4 個(gè)Hsc70 蛋白質(zhì)家 族 蛋 白， 分 別 為 Hsc70-3、 Hsp70cb、Hsc70-4 和Hsc70-5。Hsc70 是Hsp70 家族的成員。這些結(jié)果表明，中華蜜蜂DnaJB6 與多種熱激蛋白家族蛋白質(zhì)相互作用，特別是Hsc70 蛋白家族。并且，很可能作為輔助伴侶分子，與Hsp70 相互作用，從而發(fā)揮生物功能。

圖11 中華蜜蜂DnaJB6 相互作用蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2 討論

由于選擇性剪接，DnaJB6 具有多個(gè)亞型。在東方蜜蜂中，DnaJB6 具有2 個(gè)亞型，分別為長(zhǎng)327 bp 的亞型1（XP_016919326） 和290 bp 的亞型2（XP_016919327）[46]。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，克隆得到中華蜜蜂DnaJB6 與東方蜜蜂的DnaJB6 亞型1 完全相同，亞型2 缺少的59-95 位氨基酸殘基。中華蜜蜂DnaJB6 的59-73 位氨基酸構(gòu)成J 結(jié)構(gòu)域的第四個(gè)α-螺旋（圖9）。但是，利用Psipred 4.0 對(duì)東方蜜蜂DnaJB6 亞型2 進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)卻發(fā)現(xiàn)其59-69 位仍可以形成α- 螺旋，即其仍具有4個(gè)α-螺旋組成的J 結(jié)構(gòu)域。盡管在哺乳動(dòng)物中，DnaJB6 的部分亞型可能會(huì)因?yàn)槿鄙貱 端的核定位信號(hào)序列而分布于細(xì)胞質(zhì)，這可能會(huì)造成二者功能上的差異[40]。但同時(shí)，也有研究報(bào)道，在熱激脅迫條件下，定位于細(xì)胞質(zhì)的亞型可以轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核[47]。這些結(jié)果表明，由于選擇性剪接形成的中華蜜蜂DnaJB6 的兩個(gè)亞型在功能上很可能相同。

蛋白質(zhì)由20 種常見(jiàn)氨基酸連接而成。由于不同氨基酸側(cè)鏈殘基的性質(zhì)差異，氨基酸的組成、排列賦予了蛋白質(zhì)特性，如等電點(diǎn)、半衰期、親/疏水性、穩(wěn)定性等。預(yù)先掌握蛋白質(zhì)這些特征參數(shù)，有利于開(kāi)展后續(xù)的生化實(shí)驗(yàn)。中華蜜蜂DnaJB6 總的親水性平均系數(shù)為-0.913，并且83%的氨基酸表現(xiàn)為親水性（表3 和圖1）。這些結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)很可能易溶于水。同時(shí)，DnaJB6 含有的帶正電的殘基明顯多于帶負(fù)電的殘基，說(shuō)明中華蜜蜂Dna-JB6 帶正電。

結(jié)構(gòu)域是在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的三級(jí)結(jié)構(gòu)局部折疊區(qū)，是相對(duì)獨(dú)立的穩(wěn)定的緊密球狀實(shí)體。在進(jìn)化過(guò)程中，相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域稱(chēng)為保守結(jié)構(gòu)域。并且保守結(jié)構(gòu)域多為蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域。DnaJ 蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域?yàn)镴結(jié)構(gòu)域。并且，J 結(jié)構(gòu)域包含4 個(gè)α- 螺旋，其中螺旋Ⅱ和螺旋Ⅲ反向平行，通過(guò)含HPD基序的柔性環(huán)相連，兩端的短螺旋Ⅰ、Ⅳ則穩(wěn)定反向平行螺旋間的相互作用[48]。其中的HPD 是DnaJ 蛋白最保守的基序，同時(shí)也是激活Hsp70 的ATP 酶活性所必須的[49]。中華蜜蜂DnaJB6 具有較為保守的由4 個(gè)α- 螺旋構(gòu)成的J 結(jié)構(gòu)域（圖9）。并且，具有保守的HPD 基序。DnaJB6 作為DnaJ 蛋白質(zhì)家族的一員，可能參與蛋白質(zhì)的翻譯、折疊、去折疊、轉(zhuǎn)位和降解過(guò)程[32]。

蛋白質(zhì)磷酸化修飾是指肽鏈合成后加工過(guò)程中，在各種蛋白激酶的作用下，將ATP 的γ- 磷酸基轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的Ser、Thr、Tyr 殘基的羥基上的過(guò)程，是存在于各類(lèi)生物中調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的一種基本的、普遍的機(jī)制。并且，蛋白質(zhì)的磷酸化修飾也影響蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。糖基化修飾能夠改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。中華蜜蜂DnaJB6具有15 個(gè)糖基化與49 個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)（圖5 和圖6）。并且，DnaJB6 蛋白為不穩(wěn)定蛋白（表2）。綜上可推測(cè)，磷酸化與糖基化修飾可能是維持DnaJB6 穩(wěn)定的重要原因。

同源建模指在已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)中，選取與待測(cè)蛋白質(zhì)同源性較高的蛋白質(zhì)作為模板，再利用計(jì)算機(jī)模擬和計(jì)算預(yù)測(cè)其三維空間結(jié)構(gòu)。模板與中華蜜蜂DnaJB6 的序列相似度為52.69%。并且，同源建模的GMQE 值為0.4，QMEAN 為-4.13（表6）。這些結(jié)果表明，預(yù)測(cè)獲得的三維結(jié)構(gòu)模型的可信度一般，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與調(diào)整。