戴梓茹，孔 艷，王 培，婁氣永，李東亮

(1.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，欽州 535011；2.廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，南寧 530004；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 水生生物研究所 水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072；4.華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境健康實(shí)驗(yàn)室，上海 200241)

SOCS家族蛋白(suppressors of cytokine signaling)是一類在細(xì)胞內(nèi)分泌的蛋白，并可以作為負(fù)向調(diào)節(jié)因子反饋性抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。目前在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)SOCS 家族蛋白有細(xì)胞因子誘導(dǎo)的含有SH2 結(jié)構(gòu)域的蛋白(cytokine inducible SH2-containing protein，CIS)以及SOCS1～SOCS7共8種[1]。其中能夠抑制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白被命名為SOCS1[2]，是一個(gè)由外顯子編碼的基因，并能夠參與多種細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，如：SOCS1能夠負(fù)反饋調(diào)節(jié)JAK/STAT(janus kinase/signal transduction and activators of transcription；絡(luò)氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子)應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路[3]。此外，SOCS1還具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)[4]、調(diào)節(jié)機(jī)體造血功能[5]、調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)和機(jī)體代謝等生物學(xué)功能[6]。

氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)是機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡被打破而傾向于氧化，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧分子(ROS)大量積累而引起機(jī)體產(chǎn)生的一種氧化損傷，它會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生負(fù)面的影響，是導(dǎo)致衰老的一個(gè)重要因素。目前，已有大量報(bào)道證實(shí)了SOCS1基因的生物功能，SOCS1基因?qū)ρ趸瘧?yīng)激的影響也有報(bào)道，選擇性誘導(dǎo)SOCS蛋白可阻止宿主巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡[7]，SOCS-1 蛋白表達(dá)升高，能夠減輕LPS引起的小鼠成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激水平[8]。為進(jìn)一步探討SOCS1基因與氧化應(yīng)激的關(guān)系，本文分析斑馬魚SOCS1基因敲除系在高脂誘導(dǎo)的條件下，肝臟抗氧化酶含量變化，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析肝臟氧化應(yīng)激基因表達(dá)和信號(hào)通路變化情況，為SOCS1基因功能的研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒(A001-1-2)、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒 (A007-1-1)、谷胱甘肽還原酶(GR)測(cè)定試劑盒(A062-1-1)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。Evolution 300紫外-可見分光光度計(jì)；MIKRO 200R 型離心機(jī)；Hitach-7650 透射電鏡。

1.2 斑馬魚喂養(yǎng)方法

SOCS1a基因敲除系(SOCS1a-/-)和野生型(SOCS1a+/+)斑馬魚均由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所分子病理課題組提供。成年斑馬魚的養(yǎng)殖條件為水溫28 ℃，pH值為7.2～7.6，電導(dǎo)率為500～550 μs/cm，日光燈照射和黑暗各12 h。常規(guī)喂養(yǎng)90 d后，分為4組，分別是SOCS1a-/-高脂飼料組(MH)和普通飼料組(MC)、SOCS1a+/+高脂飼料組(CH)和普通飼料組(CC)，每組15條魚。斑馬魚飼料配方見表1。每天分別投喂飼料用量為魚體重的6%，分為2次喂養(yǎng)(早上9:00和下午5:00)，每隔2周測(cè)1次體重和體長(zhǎng)并重新計(jì)算飼料用量，投喂6周。

表1 斑馬魚飼料實(shí)驗(yàn)配方Table 1 Experimental formula of zebrafish feed

1.3 電鏡實(shí)驗(yàn)(TEM)

采用透射電鏡觀察斑馬魚肝組織線粒體，參考Iregui等[9]的方法并稍加修改。將斑馬魚活體用冰塊麻醉后，用生理鹽水漂洗后放入2.5% 戊二醛磷酸緩沖液中固定24 h后，再用1% 鋨酸固定1 h，然后梯度酒精脫水，丙酮置換，包埋在Epon 812樹脂中后進(jìn)行定位、切片(超薄)，最后用醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色，并在透射電鏡下觀察、拍照并記錄。

1.4 抗氧化酶活性測(cè)定

取各試驗(yàn)組斑馬魚肝臟，加入無(wú)菌的生理鹽水(1∶9,W/V)，在冰水浴條件下，制備成10% 的組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液，用于蛋白含量及各抗氧化酶活力測(cè)定。蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[10]。SOD、CAT和GR的測(cè)定均嚴(yán)格參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 轉(zhuǎn)錄組分析

剖解采集實(shí)驗(yàn)斑馬魚的肝臟樣品，迅速放入液氮，置于-80℃保存。由北京諾禾致源公司負(fù)責(zé)cDNA文庫(kù)構(gòu)建、Illumina高通量平臺(tái)測(cè)序和比對(duì)工作。根據(jù)提供的數(shù)據(jù)和比對(duì)結(jié)果，對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)絕對(duì)值(︱log2FoldChange︱≥1)為閾值，篩選差異表達(dá)基因(DEGs)后，分析氧化應(yīng)激相關(guān)的DEGs，并對(duì)DEGs 進(jìn)行GO 富集分析，用超幾何分布檢驗(yàn)方法計(jì)算每個(gè)GO 條目富集的顯著性，P≤0.05 時(shí)，表明DEGs 顯著富集。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除SOCS1a導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體功能異常

取90 dpf的SOCS1a突變系斑馬魚和野生型斑馬魚肝臟組織進(jìn)行電鏡(TEM)實(shí)驗(yàn)，TEM研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，SOCS1a突變系肝臟線粒體出現(xiàn)數(shù)量減少、異常的膨脹等現(xiàn)象，且線粒體脊密度明顯減少(圖1)，此外，還觀察到突變系肝細(xì)胞中有明顯的脂滴積累[11]。

(a)和(b)野生型斑馬魚肝臟線粒體形態(tài)[(a)3 000×;(b)25 000×，圖中箭頭表示脂滴]。(c)和(d)SOCS1a突變系異常肝臟線粒體形態(tài)[(c)3 000×，bars=2 μm；(d)25 000×，bar=150 nm]。高倍圖像(b)和(d)分別對(duì)應(yīng)于(a)和(c)中紅色方框部分。圖1 敲除SOCS1a導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體功能異常Figure 1 Abnormal mitochondrial pattern of hepatocytes in SOCS1a ablation zebrafish

2.2 敲除SOCS1a對(duì)肝臟抗氧化酶作用的影響

敲除SOCS1a對(duì)肝臟SOD、CAT和GR的影響如圖2(a)所示。由圖2(a)可知，普通飼料喂養(yǎng)時(shí)，CC處理組的SOD活力顯著高于MC處理組27.813 U/mg(prot)；在高脂誘導(dǎo)條件下，CH處理組顯著高于MH處理組14.015 U/mg(prot)。由圖2(b)可知，CC處理組的CAT活力顯著高于MC處理組16.254 U/mg(prot)，MH處理組顯著高于CH處理組10.415 U/mg(prot)。由圖2(c)可知，CC處理組的GR活力顯著高于MC處理組3.879 U/mg(prot)，CH處理組顯著高于MH處理組3.865 U/mg(prot)。在普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)的條件下，SOCS1a敲除系的GR活力均低于SOCS1a+/+。

MH：SOCS1a-/-高脂飼料組；MC：SOCS1a-/-普通飼料組；CH：SOCS1a+/+高脂飼料組；CC：SOCS1a+/+普通飼料組。圖2 敲除SOCS1a對(duì)肝臟抗氧化酶活力的影響Figure 2 Effects on liver antioxidant enzyme activity with knockout of SOCS1a

2.3 敲除SOCS1a對(duì)肝臟氧化應(yīng)激基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探討敲除SOCS1a對(duì)斑馬魚肝臟氧化應(yīng)激效應(yīng)引起的分子過(guò)程和信號(hào)通路的影響，對(duì)4個(gè)處理組斑馬魚肝臟mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)。以CC和CH處理組為對(duì)照，分析不同喂養(yǎng)條件下各處理組的氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果(圖3)顯示：MC處理組中顯著上調(diào)的基因有10個(gè)，分別是ndufa4、acoxl、foxred2、selenou1b、dao.1、gpx8、ccs、aoc2、dao.3和pcyox1；其中g(shù)px8和ccs屬于抗氧化類基因，其余上調(diào)基因均為氧化類基因。MH處理組中顯著上調(diào)的基因有11個(gè)，分別是dao.1、foxred2、acoxl、epx、sod3a、aoc2、pcyox1、pyroxd2、dao.3、cyp1a和foxred1(log2FC>1和log2FC<-1表示具有顯著性差異)，其中epx和sod3a屬于抗氧化基因，其余上調(diào)基因均為氧化類基因。

圖3 敲除SOCS1a對(duì)肝臟中氧化應(yīng)激基因表達(dá)的影響Figure 3 Regulation effects on oxidative stress gene expression of SOCS1a in liver tissue

在MC處理組中，顯著下調(diào)的基因有8個(gè)，其中，bco2b、epx和PPARG等3個(gè)基因的下調(diào)最大；在MH處理組中，顯著下調(diào)的基因也有8個(gè)，其中有6個(gè)抗氧化相關(guān)基因，分別是prdx1、prdx6、prdx5、mpx、gpx8和oxr1b，另外2個(gè)下調(diào)的基因分別是ndufa4和ndufs7。

2.4 敲除SOCS1a對(duì)肝臟氧化應(yīng)激信號(hào)通路的影響

分別以CC和CH處理組為對(duì)照組，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析分子功能基因本體論(Gene Ontology；GO)，結(jié)果(圖4)顯示，SOCS1a突變系中，MC和MH處理組的氧化應(yīng)激反應(yīng)通路基因差異表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。其中，在高脂誘導(dǎo)下，MH處理組參與氧化應(yīng)激的信號(hào)通路上調(diào)更為顯著，如氧化還原過(guò)程通路和氧分子結(jié)合通路。

圖4 敲除SOCS1a對(duì)肝臟中氧化應(yīng)激信號(hào)通路的影響Figure 4 Effects on oxidative stress signaling pathways on the liver with knockout of SOCS1a

3 討論

高脂飲食可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，可導(dǎo)致脂類、蛋白質(zhì)、碳水化合物和核酸的氧化損傷[12]。我們的研究從敲除SOCS1a基因的角度，證明SOCS1a對(duì)機(jī)體的重要作用。TEM實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲除SOCS1a導(dǎo)致斑馬魚肝臟線粒體出現(xiàn)了損傷(圖1)，而線粒體的氧化損傷可能進(jìn)一步促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]。

MC組斑馬魚肝臟抗氧化酶(SOD、GR)活力均比CC處理組低[圖2(a)和(c)]，這可能是敲除SOCS1a引起的氧化應(yīng)激效應(yīng)。高脂誘導(dǎo)條件下，大鼠產(chǎn)生氧化應(yīng)激，肝臟SOD活力顯著下降[14]；在高氯氰菊酯誘導(dǎo)下，斑馬魚產(chǎn)生氧化應(yīng)激，GR活力在15 dpf后也顯著下降[15]。機(jī)體被持續(xù)誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激時(shí)，SOD及GR活力下降，研究中SOD和GR活力的變化與上述結(jié)果具有相似的變化趨勢(shì)。氧化應(yīng)激產(chǎn)生初期，機(jī)體通過(guò)增加SOD和CAT活性以消除ROS的產(chǎn)生，但是，當(dāng)SOD和CAT不能清除過(guò)量產(chǎn)生的ROS時(shí)，它們的活性降低。此外，SOD活性降低，導(dǎo)致超氧陰離子積累，如果不能及時(shí)清除，就會(huì)產(chǎn)生羥基自由基，抑制CAT活性，進(jìn)一步促進(jìn)氧化應(yīng)激，此外，還說(shuō)明體內(nèi)ROS水平升高，CAT酶先被激活后逐漸降低[16]。因此，推斷在高脂誘導(dǎo)條件下，MH處理組產(chǎn)生了更為強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激效應(yīng)，機(jī)體中氧化和抗氧化平衡進(jìn)一步被打破，開始傾向于氧化而使得CAT被激活，從而導(dǎo)致MH處理組肝臟中的CAT活力較高[圖2(b)]。GR的作用是維持細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的含量，然而調(diào)控GR 活性變化的機(jī)制目前尚不明確[17]。有研究認(rèn)為，誘導(dǎo)GR 活性的關(guān)鍵因素可能是氧化態(tài)谷胱甘肽含量升高[18]，這與我們的研究結(jié)果一致，即SOCS1a敲除系的MC和MH處理組均產(chǎn)生了氧化應(yīng)激效應(yīng)。

ndufa4(NADH：ubiquinone oxidoreductase subunit A4)是線粒體細(xì)胞色素C氧化酶，其作用是把呼吸底物的電子直接傳遞給分子態(tài)氧，并傳遞到氧分子上將氧氣轉(zhuǎn)化為水分子[19]；ndufs7(NADH：ubiquinone oxidoreductase core subunit S7)是位于細(xì)胞核內(nèi)的基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合在線粒體膜上，參與構(gòu)成輔酶Q 氧化還原酶復(fù)合體Ⅰ[20]，兩種基因均屬于氧化磷酸化相關(guān)基因。在高脂誘導(dǎo)下，MH處理組中ndufa4和ndufs7基因顯著下調(diào)，其下調(diào)可能是為了減弱氧化磷酸化，來(lái)應(yīng)對(duì)高脂誘導(dǎo)所產(chǎn)生的更為激烈的氧化應(yīng)激，達(dá)到提高生物對(duì)傷害的抵抗力。敲除斑馬魚SOCS1a基因后，通過(guò)上調(diào)氧化通路相關(guān)基因，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，而在高脂誘導(dǎo)下，這種氧化應(yīng)激效應(yīng)顯得更為激烈(圖3)。

敲除SOCS1a后，MC處理組中氧化相關(guān)的信號(hào)通路上調(diào)，如氧水平反應(yīng)、降低氧水平反應(yīng)和細(xì)胞對(duì)含氧化合物的反應(yīng)等信號(hào)通路。并且高脂誘導(dǎo)之后，氧化相關(guān)的信號(hào)通路上調(diào)幅度更大，如氧化還原反應(yīng)和氧化還原酶相關(guān)的信號(hào)通路等(圖4)，提示這可能是氧化應(yīng)激反應(yīng)打破了機(jī)體的氧化平衡引起的。研究顯示，SOCS1的低水平表達(dá)增強(qiáng)了P-JAK2、P-STAT3蛋白表達(dá)，而SOCS1的過(guò)表達(dá)能夠通過(guò)抑制JAK/STAT信號(hào)通路來(lái)阻止細(xì)胞的氧化應(yīng)激[18,21]。同時(shí)，我們前期研究顯示，敲除SOCS1a后，JAK/STAT信號(hào)通路被過(guò)度激活[22]。因此推斷，敲除SOCS1a后，由于JAK/STAT信號(hào)通路被過(guò)度激活，導(dǎo)致氧化應(yīng)激效應(yīng)產(chǎn)生，并且在高脂誘導(dǎo)條件下，這種應(yīng)激效應(yīng)更為顯著。

研究初步闡明SOCS1a基因敲除的斑馬魚會(huì)導(dǎo)致脂代謝紊亂，并產(chǎn)生氧化應(yīng)激；在高脂誘導(dǎo)下，敲除系斑馬魚表現(xiàn)為更為激烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)。造成這一結(jié)果的原因，還有待進(jìn)一步研究。