岳鵬鵬,楊光宇,王添賢,付 燦,肖義然,于鴻浩

(1.桂林醫(yī)學(xué)院 生物技術(shù)學(xué)院，桂林 541199;2.桂林醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，桂林 541199;3.北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)揮基因打靶功能時(shí)，Cas9核酸內(nèi)切酶在向?qū)NA(small guide RNA,sgRNA)的介導(dǎo)下結(jié)合到基因組目標(biāo)靶點(diǎn)位置，切割DNA，最終達(dá)到基因編輯的目的[1]。Cas9核酸內(nèi)切酶結(jié)合靶點(diǎn)的關(guān)鍵是sgRNA。因此，能夠設(shè)計(jì)高效靶向目標(biāo)基因的sgRNA是CRISPR-Cas9系統(tǒng)能否特異性編輯目標(biāo)基因的先決條件。在基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除基因、探討基因功能的研究中，sgRNA通常選擇目標(biāo)基因前1/2外顯子作為設(shè)計(jì)區(qū)域；涉及多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的基因時(shí)選擇保守的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)靶點(diǎn)；同時(shí)利用在線軟件評(píng)估其脫靶效應(yīng)，選擇低脫靶效應(yīng)的位點(diǎn)作為靶點(diǎn)。其目的是在靶點(diǎn)位置形成移碼突變，導(dǎo)致基因功能失活，進(jìn)而研究基因功能[2]。然而，在一些特殊目的的研究中，sgRNA的設(shè)計(jì)具有其特殊性。如農(nóng)業(yè)研究中，F(xiàn)ecB基因的p.Q249R突變被證明是與羊的多胎性狀有關(guān)，為了制備該基因突變的綿羊，則必須在p.Q249R位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)sgRNA[3]。同樣，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中，通常根據(jù)發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)創(chuàng)新性設(shè)計(jì)sgRNA，以研究基因變異的致病機(jī)制或探討治療手段等[4]。

人類白化病是以黑色素缺乏或缺失為主要臨床表現(xiàn)的疾病。根據(jù)色素缺失的受累部位可將其分為兩類，即眼皮膚白化病(oculocutaneous albinism,OCA)(色素減少或缺失涉及皮膚、毛發(fā)、眼睛)和僅限于眼睛的眼白化病(ocular albinism,OA)[5]。我國(guó)白化病平均發(fā)病率為1∶17 000[6]，至少存在OCA1(I型)、OCA2和OCA4共3種類型[7]，其中I型最為普遍[8]，也是臨床表現(xiàn)及危害最為嚴(yán)重的類型[9]。酪氨酸酶 (tyrosinase,TYR)基因突變是引起I型白化病的主要病因[10]。但TYR基因突變具有多種類型，包括點(diǎn)突變、無(wú)義突變以及錯(cuò)義突變等，不同的突變可能引起的臨床癥狀不同，患病程度亦不相同。因此，有必要篩查明確的、典型的TYR致病突變位點(diǎn)，并將其定位于小鼠基因組上，然后通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行打靶，建立高效編輯系統(tǒng)，從而為建立可模擬人類白化病的小鼠動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)所用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括兩種質(zhì)粒，分別為sgRNA表達(dá)質(zhì)粒pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin(addgene #51133)和Cas9表達(dá)質(zhì)粒pST1374-NLS-flag-linker-Cas9(addgene #44758)，均由上?？萍即髮W(xué)黃行許教授惠贈(zèng)。小鼠N2a細(xì)胞由廣州大學(xué)周建奎博士惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑與儀器

大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α和pMDTM19-T Vector Cloning Kit購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；BsaI購(gòu)自NEB公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent(InvitrogenTM)試劑盒、殺稻瘟霉素、嘌呤霉素均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；TransDirect?Mouse Genotyping Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Solution I、dNTP Mixture、TaKaRa ExTaq和10×ExTaqBuffer、PremixTaq酶均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；引物由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成；測(cè)序由廣州生工生物工程股份有限公司完成。實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器包括超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)、PCR儀、核酸濃度測(cè)定儀、低溫冷凍離心機(jī)、搖床和超低溫冰箱等。

1.2 方法

1.2.1 人TYR基因致病突變位點(diǎn)的篩查

OMIM，即“在線人類孟德爾遺傳”數(shù)據(jù)庫(kù)，收錄了遺傳病、性狀和基因的相關(guān)信息。登錄該數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索導(dǎo)致白化病的TYR致病突變。鑒于OMIM收錄的突變位點(diǎn)有限，本研究亦在ExAC(外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(kù))檢索TYR基因的變異情況，并進(jìn)行變異頻率排序分析，為sgRNA的設(shè)計(jì)作為參考。最后，為了確定TYR基因變異位點(diǎn)的致病性，本研究繼續(xù)在ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)篩查TYR突變的致病情況，排除非致病性、可能致病性的變異位點(diǎn)。綜合分析以上3個(gè)數(shù)據(jù)的結(jié)果，從而找到明確的、典型的強(qiáng)致病位點(diǎn)。

1.2.2 sgRNA的設(shè)計(jì)及表達(dá)載體的構(gòu)建

由于人和小鼠的物種差異，利用Clustal Omega軟件比對(duì)了人TYR和小鼠TYR蛋白序列，以找到與人致病位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的氨基酸定位，即小鼠擬突變位點(diǎn)。然后從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)出小鼠Tyr基因序列，找到擬突變位點(diǎn)的編碼序列。利用Vector NTI軟件的“Find Motifs”功能在擬突變位點(diǎn)編碼序列附近搜索具有5′-N(21)GG特征的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了3個(gè)sgRNA，分別為Tyr-M-sg1、Tyr-M-sg2和Tyr-M-sg3。

在3個(gè)sgRNA序列的5′端加上“accg”、互補(bǔ)鏈5′端加上“aaac”合成得到正反向寡核苷酸，經(jīng)TouchDown程序退火，形成具有黏性末端的雙鏈DNA片段。

利用BsaI限制性內(nèi)切酶酶切pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒，得到酶切產(chǎn)物pGL3-U6-sgRNA-BsaI。然后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果并回收，得到pGL3-U6-sgRNA-BsaI質(zhì)粒用于后續(xù)連接實(shí)驗(yàn)。

將具有黏性末端的雙鏈DNA片段和酶切產(chǎn)物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)20 h后，挑取單克隆并用通用引物U6測(cè)序，鑒定出陽(yáng)性克隆，于37 ℃、220 r/min對(duì)陽(yáng)性克隆搖菌，去內(nèi)毒素中提試劑盒提取質(zhì)粒，分別得到pGL3-U6-Tyr-sgRNA1、pGL3-U6-Tyr-sgRNA2和pGL3-U6-Tyr-sgRNA3質(zhì)粒。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及藥物篩選

將小鼠N2a細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%后，以0.25%胰蛋白酶消化，傳代接種至6孔板中，16～18 h后，待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染采用LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent(InvitrogenTM)試劑盒分別將pGL3-U6-Tyr-sgRNA1質(zhì)粒、pGL3-U6-Tyr-sgRNA2質(zhì)粒、pGL3-U6-Tyr-sgRNA3質(zhì)粒，以及pST1374-NLS-flag-linker-Cas9質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染小鼠N2a細(xì)胞，然后利用嘌呤霉素和殺稻瘟菌素進(jìn)行藥物篩選，以獲得陽(yáng)性共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞裂解及PCR擴(kuò)增

根據(jù)TransDirect?Mouse Genotyping Kit的操作說(shuō)明，對(duì)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行了少許調(diào)整。將收集的3組陽(yáng)性共轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入8 μL的AD1懸浮細(xì)胞沉淀，然后取8 μL液體至PCR管，加入2 μL的AD2，55 ℃孵育10 min，95 ℃ 3 min；加入8 μL的AD3混勻，分別得到3組細(xì)胞的細(xì)胞裂解液，作為后續(xù)打靶位點(diǎn)DNA的PCR擴(kuò)增的模板，-20 ℃保存。

分別以上述3組細(xì)胞的細(xì)胞裂解液為模板，進(jìn)行打靶位點(diǎn)DNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物序列見表1。3組打靶位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：細(xì)胞裂解液2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，dNTP Mixture 2 μL，TaKaRa ExTaq1 μL，10×ExTaqBuffer 2.5 μL，滅菌水補(bǔ)充至25 μL。反應(yīng)的程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，72 ℃退火20 s，-1 ℃/循環(huán)(即每循環(huán)1次降低1 ℃)，72 ℃延伸25 s，共10個(gè)循環(huán)。95 ℃變性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min，16 ℃∞。將上述3組PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序。如果PCR產(chǎn)物打靶位點(diǎn)出現(xiàn)套峰，則初步確認(rèn)發(fā)生了基因編輯。剩余PCR產(chǎn)物-20 ℃保存，用于后續(xù)的TA克隆實(shí)驗(yàn)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 TA克隆測(cè)序分析

將3組PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，利用Solution I 將純化后的DNA與pMDTM19-T載體進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中，涂布LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 h后，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)挑選陽(yáng)性克隆。其菌落PCR反應(yīng)體系：菌落水溶液1 μL，PremixTaq5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，滅菌水補(bǔ)充至10 μL。上下游引物分別為通用引物M13F和M13R。菌落PCR的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，26個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后電泳鑒定。將篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與野生型序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人TYR致病位點(diǎn)篩查結(jié)果

利用OMIM在線數(shù)據(jù)庫(kù)篩查到I型白化病是由TYR基因突變引起的，包括38種致病突變(表2)；ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)共篩查到283個(gè)突變位點(diǎn)(表3)；利用ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)檢索TYR致病位點(diǎn)的突變情況，共檢索到65個(gè)突變位點(diǎn)(表4)。根據(jù)3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的綜合結(jié)果最終確定人TYR基因第81號(hào)位的脯氨酸(簡(jiǎn)稱Pro)位點(diǎn)為擬突變位點(diǎn)。

表2 OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中人TYR基因的致病突變情況Table 2 Pathogenic mutation of human TYR gene in OMIM database

表3 ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)中人TYR基因突變情況Table 3 Human TYR gene mutation in ExAC database

表4 ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)中人TYR基因致病突變位點(diǎn)情況Table 4 Pathogenic mutation sites of human TYR gene in ClinVar database

2.2 sgRNA設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建結(jié)果

蛋白序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)人TYR基因第81號(hào)位的Pro與小鼠Tyr基因第81號(hào)位的Pro相對(duì)應(yīng)(圖1)，即小鼠Tyr第81號(hào)位的Pro編碼序列為擬突變位點(diǎn)。根據(jù)小鼠編碼序列設(shè)計(jì)了3個(gè)打靶位點(diǎn)(圖2)。通過(guò)DNA合成(表5)、退火、連接轉(zhuǎn)化以及測(cè)序等步驟，成功構(gòu)建了3個(gè)位點(diǎn)的sgRNA表達(dá)載體。

黑色箭頭為人和小鼠81號(hào)位Pro氨基酸。圖1 人TYR和小鼠Tyr的蛋白序列Figure 1 Human TYR and mouse Tyr protein sequences

圖2 小鼠Tyr基因打靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)圖Figure 2 Design map of mouse Tyr gene target site

表5 化學(xué)合成的sgRNA序列Table 5 Chemically synthesized sgRNA sequences

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及藥物篩選結(jié)果

轉(zhuǎn)染時(shí)六孔板的每個(gè)孔轉(zhuǎn)染sgRNA表達(dá)質(zhì)粒和Cas9表達(dá)質(zhì)粒均為2.5 μg。轉(zhuǎn)染24 h后，用濃度為50 μg/mL嘌呤霉素和濃度為100 μg/mL的殺稻瘟菌素進(jìn)行藥物篩選48～62 h，得到陽(yáng)性的共轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖3)。然后，將陽(yáng)性共轉(zhuǎn)染細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，用0.25%的胰蛋白酶消化，并離心收集，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(a)對(duì)照組細(xì)胞;(b)pGL3-U6-Tyr-sgRNA2和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9共轉(zhuǎn)染藥篩陽(yáng)性細(xì)胞。圖3 陽(yáng)性共轉(zhuǎn)染細(xì)胞Figure 3 Positive co-transfected cells

2.4 打靶區(qū)域PCR產(chǎn)物測(cè)序及TA克隆測(cè)序結(jié)果

收集的陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)過(guò)裂解和PCR擴(kuò)增，得到了包含打靶區(qū)域的DNA片段，電泳檢測(cè)后，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3個(gè)靶點(diǎn)位置均有套峰出現(xiàn)，表明發(fā)生了DNA序列的改變，基因打靶成功(圖4)。

2.5 TA克隆測(cè)序結(jié)果

打靶成功的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)膠回收、連接轉(zhuǎn)化、菌液PCR鑒定以及陽(yáng)性克隆測(cè)序等步驟，得到了基因編輯后的具體序列。測(cè)序結(jié)果與野生型序列比對(duì)分析表明，在sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3靶點(diǎn)位置發(fā)生了堿基的隨機(jī)插入和缺失(圖5)，編輯效率均為100%。

3 討論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)被稱為第三代基因編輯系統(tǒng)，與應(yīng)用較早的基因編輯技術(shù)如鋅指蛋白核酸酶(ZFN)[11]或轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)[12]相比，具有設(shè)計(jì)靈活、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高、成本較低、可同時(shí)多位點(diǎn)打靶等優(yōu)勢(shì)。本研究構(gòu)建了靶向小鼠Tyr基因的高效CRISPR/Cas9系統(tǒng)，TA克隆測(cè)序分析表明所設(shè)計(jì)的3個(gè)靶點(diǎn)均達(dá)到了100%的打靶效率。如此高的打靶效率首先取決于sgRNA的設(shè)計(jì)，同時(shí)還與轉(zhuǎn)染效率等試驗(yàn)細(xì)節(jié)密切相關(guān)。如本研究中使用了Lipofectamine TM 3000 Transfection Reagent (InvitrogenTM)試劑盒，轉(zhuǎn)染效率明顯好于Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑；實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格控制細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞接種密度、轉(zhuǎn)染時(shí)間以及藥物篩選時(shí)間等實(shí)驗(yàn)要素；使用全式金TransDirect? Mouse Genotyping Kit，其獨(dú)特裂解液裂解細(xì)胞后無(wú)需純化，裂解物可直接作為模板進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增，提高了實(shí)驗(yàn)效率。當(dāng)然100%的編輯效率是采用TA克隆方法得到的結(jié)果，由于受到測(cè)序樣本量的限制其結(jié)果的精準(zhǔn)程度不如高通量測(cè)序高。

(a)打靶位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳圖[M：DNA ladder(DL2000)；1、2和3分別代表包含sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3打靶位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物；WT為野生型PCR產(chǎn)物]。(b)野生型sgRNA1打靶位點(diǎn)測(cè)序峰圖(深色背景部分為sgRNA1序列)。(c)基因編輯sgRNA1打靶位點(diǎn)測(cè)序套峰圖(深色背景部分為DNA序列發(fā)生改變的sgRNA1序列)。圖4 PCR產(chǎn)物電泳及測(cè)序圖Figure 4 PCR product electrophoresis and sequencing diagram

加粗字體為打靶序列；斜體字體為PAM結(jié)構(gòu)；“-”代表缺失堿基；小寫字母代表插入堿基；“……”代表未列出序列；“-N”代表缺失堿基數(shù)量；“+N”代表插入堿基數(shù)量；“N/N”代表基因型數(shù)量及陽(yáng)性克隆測(cè)序總數(shù)。圖5 TA克隆測(cè)序結(jié)果Figure 5 TA clone sequencing results

TYR基因由5個(gè)外顯子組成，其基因組DNA約為65 kb，編碼由529個(gè)氨基酸組成的TYR。TYR是一種含銅的酶，催化黑色素生物合成途徑的前兩個(gè)步驟，將酪氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-二羥基苯丙氨酸(DOPA)，然后轉(zhuǎn)化為DOPA多巴醌[13]。該蛋白是催化黑色素生成的關(guān)鍵酶類之一，若其發(fā)生突變將導(dǎo)致不同程度的皮膚、頭發(fā)和眼睛的色素沉著減少，從而引起人類白化病[14-15]。鄭輝等[16]利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了11種TYR基因變異后的蛋白構(gòu)象變化，發(fā)現(xiàn)11種變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化各不相同，揭示了突變的致病性與蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變相關(guān)。推測(cè)TYR突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的差異可能是白化病臨床癥狀異質(zhì)性的主要原因。目前，研究者以Tyr基因?yàn)榘悬c(diǎn)，基于CRISPR/Cas9以及堿基編輯器等工具制備了Tyr基因編輯小鼠[17-19]、兔子[20]、斑馬魚[21]和豬[22]等，以上基因工程動(dòng)物均檢測(cè)到白化表型，表明以通過(guò)TYR基因工程動(dòng)物模擬人類的白化病是可行的。本文與上述研究相比最大的特點(diǎn)是通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，仔細(xì)分析明確的、典型的TYR強(qiáng)致病突變位點(diǎn)，并將其定位于小鼠基因組上，為后續(xù)建立Tyr基因編輯小鼠提供了準(zhǔn)確的靶位點(diǎn)信息?？傊?，我們?cè)O(shè)計(jì)并驗(yàn)證了行之有效的靶向小鼠Tyr基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，滿足TYR基因編輯小鼠制備的需要。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)篩查白化病致病基因TYR的變異情況，明確了高致病性的突變位點(diǎn)，并將其定位于小鼠基因組上。然后基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)設(shè)計(jì)了3個(gè)靶點(diǎn)，并在小鼠N2a細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)了100%效率的基因打靶，成功構(gòu)建了模擬人高致病突變位點(diǎn)的靶向小鼠的基因編輯系統(tǒng)，為后續(xù)建立基因工程動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。