王 媛，程盈盈，馬夢琪，梁明星，陳華波

(湖北文理學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，襄陽 441053)

將兩個或多個基因的編碼區(qū)首尾相連，置于同一套調(diào)控序列控制之下，即為融合基因?？寺∪诤匣蚴茄芯抗ぷ髦械某Ｓ檬侄?。一則自然融合基因廣泛存在于諸多腫瘤細胞中[1-2]，它本身就是重要的研究對象；二則人工融合基因可為研究工作提供諸多便利。如在基因兩端分別連接不同生色團，輔以熒光共振能量轉(zhuǎn)移等技術(shù)可研究目標蛋白在細胞內(nèi)的動態(tài)變化[3-4]；或者將兩個功能基因融合在一起，以研究其特殊功能或調(diào)節(jié)機制[5-6]。將功能基因連接GFP、GST等標簽簡單易行，不在本文討論之列。

構(gòu)建融合基因的方法主要有基于II型限制性內(nèi)切酶的酶切-連接法，非典型酶切-連接技術(shù)，重疊延伸PCR(overlap extension PCR,OE-PCR)融合法，Gibson組裝等，這些方法各有利弊，須結(jié)合實際案例選擇具體方案。其中常規(guī)雙酶切-連接法操作簡單，技術(shù)成熟。由于體外連接的低效性，往往需要將一個基因片段連接插入載體后進行篩選，然后再進行第二次連接。每次連接反應(yīng)都需要兩個合適的內(nèi)切酶，因此兩個基因片段順序連接，依次插入載體常受制于嚴格的酶切位點要求而難以實行。我們發(fā)現(xiàn)雙片段連接法可突破上述僵化的酶切位點限制，極大拓寬酶切-連接法拼接基因片段的適用范圍。

周期蛋白E(cyclinE)是周期蛋白家族重要成員，主要通過激活周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2,CDK2)促進細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換[7]，此外還可能通過非典型方式在細胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用[8-9]。為研究cyclinE/CDK2復(fù)合物在中心體復(fù)制中的作用機制，需克隆cyclinE-CDK2融合基因及其突變體。通過PCR在CDK2 序列5′端接入連接序列(linker)，將cyclinE與linker-CDK2序列一起連接插入質(zhì)粒載體構(gòu)建融合基因；采用相似策略，以cyclinE或CDK2突變體替換融合基因中對應(yīng)野生型序列，構(gòu)建融合基因突變體。本研究對常規(guī)酶切-連接法作適當改進，以期提供一種克隆融合基因及其突變體的簡便方法。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

感受態(tài)大腸桿菌DH5α(CB101)購自天根生化科技(北京)有限公司；pEGFP_C2質(zhì)粒(V800-20)購自Thermo Fisher。

1.2 試劑

PrimeSTAR Max DNA Polymerase (R450A)，DNA Ligation Kit Ver.2.1 (6002)購自Takara；BamHⅠ(R0136V),EcoRⅠ(R0101V)，MluⅠ(R0198V)，SalⅠ(R3138V)購自NEB；DNA回收試劑盒(BSC02M1/BSC03M1)；質(zhì)粒小量抽提試劑盒(BSC01M1)購自杭州博日科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，由北京天潤奧科生物科技有限公司合成，經(jīng)PAGE純化。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 基因克隆

通過PCR將linker接入CDK2需合成一條約70 nt的引物。考慮到化學(xué)合成長引物易出錯且價格昂貴，故設(shè)計兩條略有重疊的嵌套引物。PS1匹配CDK2基因5′端；PS2匹配PS1補齊linker序列并添加SalⅠ位點。PA匹配CDK2基因3′端并添加BamHⅠ位點。PCR方案：先將常規(guī)濃度的PS1引物1∶1 000稀釋，采用PrimeSTAR Max DNA Polymerase高保真DNA聚合酶。25 μL 2×Premix，0.5 μL PS2/0.5 μL PS1/0.5 μL PA，1 ng pEGFP_C2-CDK2質(zhì)粒，補水至50 μL。運行程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。預(yù)期產(chǎn)物為SalⅠ-linker-CDK2-BamHⅠ。酶切方案：取PCR回收物17 μL(或相應(yīng)質(zhì)粒1 μg稀釋到17 μL ddH2O中)，加2 μL 10×buffer，0.5 μL酶1/0.5 μL酶2，37 ℃孵育4 h。PCR及酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后回收至50 μL ddH2O中。連接方案：采用DNA Ligation Kit Ver.2.1試劑盒。載體0.5 μL，兩片段各3.5 μL，solution I 7.5 μL；16 ℃孵育30 min。連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布于卡那霉素-LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.5 陽性克隆的篩選與鑒定

從過夜平板上隨機挑取數(shù)個菌落，置于4 mL卡那霉素-LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8 h。取3 mL菌液小量提取質(zhì)粒進行酶切：7.5 μL質(zhì)粒DNA，2 μL 10×buffer，0.5 μL內(nèi)切酶，補水至20 μL，37 ℃孵育3 h后電泳檢測。陽性質(zhì)粒測序由北京天潤奧科生物科技有限公司完成。采用DNAMAN 4.0軟件進行序列比對與限制性酶切分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 融合基因克隆方案

在前期工作中已構(gòu)建了pEGFP_C2-cyclinE和pEGFP_C2-CDK2質(zhì)粒(圖1)及其激酶活性缺失突變體cyclinEM(188-192A)和CDK2M(T160A)[10-11]?，F(xiàn)欲克隆cyclinE-CDK2融合基因，在兩基因之間還需插入一段編碼Gly-Gly-Thr 5次重復(fù)的連接序列(linker)以減少蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的相互影響[6]。linker為一段45 bp的重復(fù)性序列，以之為橋梁，通過OE-PCR融合cyclinE與CDK2基因易因錯配而產(chǎn)生缺失突變。

圖1 原始質(zhì)粒酶切圖譜Figure 1 Restriction map of original plasmid

設(shè)計含linker序列的引物，通過PCR將其接入CDK2序列5′端，并在兩端分別添加SalⅠ與BamHⅠ位點以便基因拼接。由于cyclinE序列內(nèi)還有另一BamHⅠ位點，linker-CDK2序列無法直接插入載體。故先用EcoRⅠ/SalⅠ將cyclinE序列酶切出來，連同linker-CDK2序列一起連接插入載體，可以繞過雙BamHⅠ位點對順序連接的限制。若克隆含cyclinEM(188-192A)突變體的融合基因，仍可按上述方案進行，且linker-CDK2序列無需再次PCR擴增，直接從經(jīng)序列鑒定的融合基因重組質(zhì)粒中酶切出來即可。

圖2 cyclin E-CDK2融合基因克隆過程示意圖Figure 2 Schematic diagram of cloning process of cyclin E-CDK2 fusion gene

2.2 融合基因的克隆與篩選

以pEGFP_C2-CDK2為模板，PCR擴增得到linker-CDK2片段[圖3(a)]，再以SalⅠ/BamHⅠ雙酶切得到一個基因片段[圖3(b)，1泳道]。pEGFP_C2-cyclinE質(zhì)粒以EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切得到cyclinE基因片段[圖3(b)，2泳道]，pEGFP_C2質(zhì)粒以EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切作為載體[圖3(b)，3泳道]。雙片段連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)篩選得到十余個菌落[圖3(c)]。任意選取8個克隆小量提取質(zhì)粒，分別以NheⅠ或BamHⅠ單酶切檢測，得到3個陽性克隆[圖3(d)和(e)]。經(jīng)序列測定與比對，3個克隆都完全符合預(yù)期融合基因序列[圖3(f)]。

(a)PCR擴增linker-CDK2序列；(b)酶切獲取基因片段及載體，箭頭指示需回收的DNA片段；(c)過夜平板上的成型菌落；(d)和(e)平板菌落酶切檢測結(jié)果；(f)3個陽性克隆與目標序列比對結(jié)果。圖3 克隆cyclin E-CDK2融合基因Figure 3 Clone cyclinE-CDK2 fusion gene

2.3 融合基因突變體克隆方案

欲克隆pEGFP_C2-cyclinE-CDK2M(T160A)突變體，用OE-PCR或滾換擴增等方法都可能會引入隨機突變。從pEGFP_C2-CDK2M質(zhì)粒中切取突變序列置換融合基因中對應(yīng)序列可避免上述風(fēng)險。由于兩種質(zhì)粒中CDK2序列3′端酶切位點不同，故利用EcoRⅠ/MluⅠ將CDK2M連同其后的一段序列(F2)一起酶切。重組質(zhì)粒中cyclinE5′端尚有另一個EcoRⅠ位點，故CDK2M--序列無法直接插入載體。利用BamHⅠ/EcoRⅠ從融合質(zhì)粒中將cyclinE大部分連同linker序列(F1)酶切，兩片段一起連接載體部分可重構(gòu)完整融合質(zhì)粒。此融合質(zhì)粒CDK2末端為SalⅠ位點，不同于原融合質(zhì)粒，但CDK2末尾含TGA終止密碼，不會改變?nèi)诤系鞍椎腃端序列。

圖4 cyclin E-CDK2M融合基因克隆過程示意圖Figure 4 Diagram of cloning process of cyclin E-CDK2M fusion gene

2.4 融合基因突變的克隆與篩選

將pEGFP_C2-cyclinE-CDK2質(zhì)粒以BamHⅠ/MluⅠ雙酶切得到251、2 065及4 578 bp 3個片段，其中最大的片段即所需載體部分[圖5(a),1泳道]；將pEGFP_C2-cyclinE-CDK2質(zhì)粒以BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切得到125、903、1 162 bp及4 704 bp 4個片段，其中1 162 bp即為所需的F1片段[圖5(a)，2泳道]。它與903 bp片段相距不遠，需謹慎分離回收；將pEGFP_C2-CDK2M質(zhì)粒以EcoRⅠ/MluⅠ雙酶切得到1 175 bp與4 453 bp 2個片段，其中1 175 bp即為所需的F2片段[圖5(a)，3泳道]。F1與F2片段一起連接載體部分，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，篩選得到數(shù)十個克隆[圖5(b)]。任選8個克隆，對其質(zhì)粒分別以NheⅠ或SalⅠ單酶切檢測，結(jié)果一致顯示皆為陽性[圖5(c)和(d)]。由于新、舊融合質(zhì)粒CDK2序列末端酶切位點不同，SalⅠ單酶切陽性可確保目標質(zhì)粒含CDK2M突變體。新融合質(zhì)粒中各部分都未經(jīng)PCR擴增，一般無需測序鑒定。

3 討論

采用基于Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的酶切-連接技術(shù)克隆融合基因有著天然優(yōu)勢，該方法可將基因片段視作獨立的DNA元件進行靈活替換，該方法最大的障礙是不易找到合適的酶切位點以實現(xiàn)基因片段的順序連接。我們對常規(guī)酶切-連接法作適當改進，采用了兩種不同的雙片段連接方案，成功克隆了cyclinE-CDK2融合基因及其突變體。為避免受酶切位點限制，研究者也嘗試用某些非典型酶切-連接技術(shù)拼接DNA，如依賴于同尾酶的BioBrick技術(shù)和依賴于IIs型限制性內(nèi)切酶的Golden gate克隆技術(shù)[12-14]。兩者的共同弊端是會將拼接片段“焊死”，無法進行后續(xù)DNA元件的靈活替換。OE-PCR融合法不受酶切位點限制，但在此有3點缺陷：OE-PCR受上、下游DNA片段長度等諸多因素影響，一般融合長基因片段成功率較低；涉及體外DNA擴增的PCR可能引入隨機突變，須全基因測序加以驗證；融合基因的linker序列具有重復(fù)性，以之為重疊序列的OE-PCR易產(chǎn)生缺失突變。Gibson組裝也涉及體外DNA合成[15]，遇到的問題與OE-PCR法相似。多片段順序連接對酶切位點及其順序有嚴格要求，須3個酶切位點在基因片段與載體MCS上順序一致才能保證兩個DNA片段依次連接插入載體[圖6(a)]。雙片段連接法極大拓寬了酶切-連接法的適用范圍，具體表現(xiàn)在以下兩種情況：其一是載體MCS上切點b在a、c外側(cè)或沒有b切點[圖6(b)]，如本例中克隆融合基因突變體；其二是待拼接的DNA片段上有多余酶切位點會干擾順序連接[圖6(c)]，如本例中克隆融合基因。上述兩種情況都無法順序連接，但雙片段連接法則不受影響。雙片段連接法還可用于克隆一些序列較長而不易直接獲取的基因，如多片段拼接法克隆長基因，OE-PCR法克隆長基因定點突變，序列置換法克隆系列截短基因突變體等。相對常規(guī)單片段連接，雙片段連接時得到的轉(zhuǎn)化克隆數(shù)較少，且陽性率偏低[16]。在篩選目標克隆時，可適當增加檢測菌落數(shù)，并以多種方案相互佐證檢測結(jié)果。在嘗試雙片段連接法之前應(yīng)掌握嫻熟的單片段、雙酶切連接實驗操作技巧。

(a)酶切獲取載體及基因片段(其中1泳道251 bp及2泳道125 bp條帶弱，不易見，箭頭指示需回收的DNA片段)；(b)過夜平板上的成型菌落；(c)和(d)平板菌落酶切檢測結(jié)果。圖5 克隆cyclin E-CDK2M融合基因Figure 5 Clone cyclinE-CDK2M fusion gene

圖6 雙片段連接法拓寬酶切-連接法在DNA拼接中的適用范圍Figure 6 Double fragments ligation expanded the application of enzyme cleave-ligation in DNA assembly