徐偉偉，陳良標(biāo)

(1．中國科學(xué)技術(shù)部 海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心(上海海洋大學(xué))，上海 201306;2．水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海海洋大學(xué))，上海 201306;3．水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海 201306)

胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白3(IGF2BP3)是胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白家族成員之一，之所以被稱為IGF2BP是因?yàn)樗鼈兤鸪醣徽J(rèn)為是胎兒生長因子IGF2的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子[1]。IGF2BP3通過結(jié)合目標(biāo)mRNA編碼區(qū)調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，在細(xì)胞極化、運(yùn)動(dòng)、形態(tài)發(fā)生、新陳代謝、增殖及分化等過程中發(fā)揮重要作用。IGF2BP3由2個(gè)N端RNA識(shí)別基序(RRM)和4個(gè)C端K同源(KH)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[2]。

IGF2BP3也稱為IMP3，1997年在篩選人胰腺癌組織和細(xì)胞系的差異表達(dá)基因時(shí)，因大量表達(dá)被發(fā)現(xiàn)，并命名為koc；但14周胎兒胰腺組織中koc卻呈現(xiàn)低表達(dá)量[3]。IMP3在小鼠胚胎發(fā)育中存在明顯的時(shí)間表達(dá)差異，胚胎早期發(fā)育階段該基因均有表達(dá)；在妊娠晚期，該基因最高表達(dá)出現(xiàn)在腸、胸腺、胰腺、腎臟和發(fā)育中的大腦；在妊娠后期，表達(dá)僅限于腸和胸腺深部；在出生后第2天，腸上皮細(xì)胞中不再檢測(cè)到該基因的表達(dá)[4]。這些結(jié)果暗示IGF2BP3可能和胚胎發(fā)育有關(guān)，但是仍無法證明。非洲爪蟾vg1 RBP是人IGF2BP3的直系同源物，vg1 mRNA存在于卵母細(xì)胞植物極皮質(zhì)區(qū)域[5]，該蛋白介導(dǎo)vg1 RNA和微管的結(jié)合[6-7]。同時(shí)非洲爪蟾vg1 RBP和人的IGF2BP3氨基酸序列相似性可達(dá)84%[8]?，F(xiàn)有研究表明，vg1 RBP在非洲爪蟾中可以調(diào)控器官發(fā)生、神經(jīng)發(fā)育、IGF2 mRNA翻譯以及卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程。IGF2BP3在人類和小鼠的胎盤和生殖器官中高表達(dá)，意味著IGF2BP3可能和生物體早期發(fā)育和性腺發(fā)育有關(guān)。

2011年CRISPR/Cas9技術(shù)被發(fā)明[9]，即核酸酶在RNA的引導(dǎo)下在設(shè)定的目標(biāo)位置進(jìn)行DNA的修飾。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)主要由3部分組成：crispr RNA、tracr RNA和一個(gè)核酸酶Cas。Cas9蛋白可以用來切割DNA，crispr RNA和tracr RNA組成的一個(gè)復(fù)合體向?qū)NA(guide RNA)含有與目的位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的RNA序列，可以用來確定切割修飾的位置。同時(shí)該DNA序列打開需要一個(gè)PAM(protospacer adjacent motif)序列[10]，一般為NGG。由于可以設(shè)計(jì)guide RNA識(shí)別PAM序列之前的序列，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是易于設(shè)計(jì)的基因組編輯工具。

斑馬魚igf2bp3基因在物種間高度保守，在小鼠組織中缺乏可用的敲除模型，該基因在組織中的功能仍然未知。因此，以斑馬魚為研究對(duì)象，通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建igf2bp3基因缺失的斑馬魚突變體模型，以期為研究igf2bp3基因的功能提供基礎(chǔ)，同時(shí)為決定斑馬魚性腺發(fā)育相關(guān)基因提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 斑馬魚品系及飼養(yǎng)

AB系野生型斑馬魚購自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，igf2bp3-/-突變體在此品系下構(gòu)建。循環(huán)系統(tǒng)水溫28.5 ℃，pH 7.0～8.0，光周期14 h(8∶30—21∶30)光照和10 h(21∶30—8∶30)黑暗。每日投喂2次活體豐年蝦。

1.1.2 試劑及儀器

主要試劑包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑PremixTaqTMVersion 2.0 plus dye (TaKaRa,RR901A)，基因組編輯試劑GenCrispr NLS-Cas9-NLS (金斯瑞,Z03389-25)；熒光定量反應(yīng)試劑SYBR Green (Roche,04887352001)。主要試劑盒包括海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN,DP324-03)；普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN,DP204-02)；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒MAXIscriptt?T7invitroTranscription Kit(Thermo Fisher Scientific,AM1314)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,RR047A)。主要儀器包括PCR核酸擴(kuò)增儀(BIO-RAD公司)；InjectMan NI2顯微注射儀(Eppendorf公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶點(diǎn)和引物設(shè)計(jì)

通過斑馬魚基因組網(wǎng)站Ensembl (https:∥asia.ensembl.org/index.html)查找斑馬魚igf2bp3基因(ENSDARG00000010266)序列。使用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站ZiFiT (http:∥zifit.partners.org/ZiFiT/)獲得兩個(gè)gRNA靶點(diǎn)序列，Target 6序列為5′-GGGCTGCCTCTCTGCAACA-3′，Target 8序列為5′-GGGTTTTTGTAATACATCTG-3′。兩個(gè)靶點(diǎn)通過BLAST比對(duì)均在斑馬魚基因組中特異。在NCBI上設(shè)計(jì)靶點(diǎn)6和靶點(diǎn)8檢測(cè)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，檢測(cè)引物和靶點(diǎn)合成序列如表1所示。

表1 靶點(diǎn)和引物序列Table 1 Sequences of target and primer

1.2.2 gRNA合成與純化

通過PCR擴(kuò)增技術(shù)，以pMD19-gRNA scaffold質(zhì)粒為模板，含有T7啟動(dòng)子、靶點(diǎn)、骨架的序列為上游引物T7-target-sfd，固定序列為下游引物tracr rev (表1)，按照PCR反應(yīng)程序94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，擴(kuò)增用于gRNA轉(zhuǎn)錄的DNA模板。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小約100 bp，回收純化，使用MAXIscriptt?T7invitroTranscription Kit進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。利用3 mol/L醋酸鈉沉淀純化gRNA。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶大小。制備好的gRNA保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 胚胎顯微注射

于注射前一晚將野生型成年斑馬魚按雌、雄比例為1∶1或1∶2放置在配魚缸中，隔板分開，暗處理10 h注射當(dāng)天早晨，抽去隔板，雌雄魚開始交配，一般10 min左右親魚即可產(chǎn)生受精卵。按照cas9蛋白質(zhì)濃度為800 ng/μL，gRNA濃度為100 ng/μL配制注射體系，顯微注射至野生型斑馬魚一細(xì)胞期的胚胎，每枚胚胎注射體積為1 nL。并留有同期未注射胚胎為對(duì)照。

1.2.4 突變體篩選

注射后胚胎置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱，隨機(jī)挑選注射組和對(duì)照組各20枚發(fā)育48 h的胚胎放于2個(gè)PCR管中，加入50 μL 50 mmol/L的NaOH，95 ℃裂解10 min，渦旋振蕩1 min，重復(fù)裂解振蕩，加入5 μL 1 mol/L Tris-HCl溶液(pH 8.0)，振蕩混勻，12 000 r/min離心5 min，上清液為基因組DNA。以靶點(diǎn)6的上游檢測(cè)引物igf2bp3-6C-F和靶點(diǎn)8的下游檢測(cè)引物igf2bp3-8C-R (表1)，擴(kuò)增該區(qū)域DNA序列，通過瓊脂糖凝膠電泳判斷靶點(diǎn)敲除是否有效。若靶點(diǎn)敲除有效，剩下的胚胎飼養(yǎng)至性成熟即F0，與野生型斑馬魚交配得到F1，剪取F1代尾鰭使用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取基因組，PCR擴(kuò)增、Sanger測(cè)序篩選有效突變；選取突變類型一致的F1個(gè)體內(nèi)交獲得F2，通過PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序篩選F2純合突變體。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)igf2bp3表達(dá)量

使用Trizol法提取RNA，以igf2bp3基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熒光定量，同時(shí)以斑馬魚β-actin為內(nèi)參，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，引物序列見表2。用2-△△ct方法計(jì)算斑馬魚不同組織中igf2bp3基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Sequences used for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 Igf2bp3蛋白序列在物種間高度保守

斑馬魚igf2bp3基因位于19號(hào)染色體，編碼582個(gè)氨基酸，包括2個(gè)N端RNA識(shí)別基序(RRM)和4個(gè)C端K同源(KH)結(jié)構(gòu)域[圖1(a)]。對(duì)斑馬魚和智人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)該蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較分析[圖1(b)]，結(jié)果表明，Igf2bp3在不同物種間保守性良好，斑馬魚序列與智人和小鼠的相似性分別為78%和77%，與兩棲類的非洲爪蟾序列相似性為79%，提示igf2bp3可能在不同物種間發(fā)揮相似的生物學(xué)功能。

圖1 不同物種的Igf2bp3功能域比較Figure 1 Comparison of Igf2bp3 functional domains among different species

2.2 igf2bp3在斑馬魚生殖腺中高表達(dá)

為了評(píng)估igf2bp3基因在斑馬魚不同組織中的表達(dá)量，使用Trizol法提取90 d野生型斑馬魚生殖腺(卵巢和精巢)、腦、鰓、眼睛、心臟、腎、脾、腸、肝臟、肌肉、等不同組織的RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量PCR。結(jié)果表明，igf2bp3基因在野生型成年斑馬魚不同組織中均有表達(dá)，在雌魚中表達(dá)量最高的組織為卵巢，在雄魚中表達(dá)量最高的組織為精巢(圖2)，暗示igf2bp3基因可能在斑馬魚性別發(fā)育中發(fā)揮作用。

2.3 利用CRISPR/Cas9構(gòu)建igf2bp3突變體

為了破壞基因結(jié)構(gòu)，抑制其功能的發(fā)揮，通過顯微注射靶點(diǎn)6和靶點(diǎn)8體外轉(zhuǎn)錄合成的gRNA以及Cas9蛋白至野生型斑馬魚一細(xì)胞期的胚胎，對(duì)斑馬魚igf2bp3基因進(jìn)行大片段敲除[圖3(a)]。胚胎發(fā)育至48 h，隨機(jī)挑選注射組和對(duì)照組各20枚通過堿裂解法提取基因組DNA，以靶點(diǎn)6的上游引物和靶點(diǎn)8的下游引物擴(kuò)增該區(qū)域的DNA序列，該引物擴(kuò)增序列全長1 949 bp，由于CRISPR/Cas9體系工作，兩靶點(diǎn)之間發(fā)生堿基缺失，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一條約460 bp的條帶，即靶點(diǎn)6至上游引物的距離加上靶點(diǎn)8至下游引物的距離[圖3(b)]。同時(shí)分別用靶點(diǎn)6和靶點(diǎn)8檢測(cè)引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；結(jié)果顯示在靶位點(diǎn)附近出現(xiàn)明顯套峰，證明基因編輯有效[圖3(c)]。胚胎飼養(yǎng)至性成熟，剪取斑馬魚尾鰭，篩選F0斑馬魚嵌合體共7尾，通過與野生型斑馬魚交配獲得F1斑馬魚雜合突變體。

* * * 為P<0.001。圖2 igf2bp3基因在野生型斑馬魚不同組織中的表達(dá)量Figure 2 The levels of igf2bp3 in different tissues of wild zebrafish

* * * 為P<0.001。圖3 利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚igf2bp3基因Figure 3 Knocking out igf2bp3 gene in zebrafish using the CRISPR/Cas9 technology

2.4 igf2bp3影響斑馬魚性別發(fā)育

對(duì)F1雜合子斑馬魚通過剪尾篩選，將突變類型一致的,即缺失1 513個(gè)堿基的雜合子斑馬魚內(nèi)交[圖4(a)]，獲得F2斑馬魚。對(duì)F2通過Sanger測(cè)序法進(jìn)行鑒定，序列比對(duì)結(jié)果表明，成功構(gòu)建igf2bp3(Δ1 513)突變體。F2斑馬魚包括突變純合子(homozygote)、雜合子(heterozygote)和野生型(wild type)3種類型。為了對(duì)F2突變體快速篩選，以靶點(diǎn)6上游引物和靶點(diǎn)8下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果無條帶對(duì)應(yīng)的個(gè)體即為野生型；若擴(kuò)增得到461 bp條帶，則進(jìn)一步以靶點(diǎn)6和靶點(diǎn)8兩對(duì)檢測(cè)引物擴(kuò)增該基因組，無條帶對(duì)應(yīng)的個(gè)體即為突變純合子；若有467 bp和458 bp的電泳條帶產(chǎn)生，對(duì)應(yīng)的個(gè)體即為雜合子[圖4(b)]。

圖4 F2代斑馬魚基因型鑒定Figure 4 Genotype identification of zebrafish F2 generation

對(duì)F2斑馬魚純合子、雜合子、野生型數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，比例約為1∶2∶1，符合孟德爾單基因隱形遺傳定律。斑馬魚純合突變體胚胎發(fā)育無異常且可正常生長，但對(duì)F2成年斑馬魚性別比例進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，野生型斑馬魚雌雄魚比例約為27∶20，接近1.4，而純合子突變體中雌雄魚比例約為2∶21，甚至低于0.1(圖5)。

* * * 為P<0.001。圖5 斑馬魚的性別比例Figure 5 Sex ratio of zebrafish

3 討論與結(jié)論

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，是由向?qū)NA引導(dǎo)Cas核酸酶至DNA特定位點(diǎn)上產(chǎn)生雙鏈斷裂，進(jìn)而通過NHEJ或HDR[11-12]來修復(fù)，而單個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)致的脫靶突變?nèi)匀皇荂RIPSR /Cas9系統(tǒng)在基因組編輯中所面臨的一個(gè)重大問題。因此實(shí)驗(yàn)通過使用兩個(gè)特異性強(qiáng)的向?qū)NA，對(duì)斑馬魚igf2bp3基因進(jìn)行編輯，提高了CRIPSR /Cas9的效率并且減少了由于脫靶引起的突變。

目前主要有3個(gè)信號(hào)通路參與斑馬魚的性別分化過程、Tp53凋亡通路、Wnt信號(hào)通路以及NF-κB通路。斑馬魚精巢的形成被認(rèn)為依賴于“類卵巢”[13-14]卵母細(xì)胞的凋亡。激活的核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子(NF-κB)維持斑馬魚卵母細(xì)胞的發(fā)育，參與斑馬魚細(xì)胞生長、分化和凋亡的調(diào)節(jié)?；罨疦F-κB通路可以促使斑馬魚雌性的比例從30%上升到85%[15]。已有研究表明p65是NF-κB異二聚體轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的成員，作為IGF2BP3的靶標(biāo)[16]。在本研究中，敲除斑馬魚敲除igf2bp3后，抑制了p65的翻譯，使NF-κB的活性受到了抑制，可能加快了“類卵巢”中卵母細(xì)胞的凋亡，最終發(fā)育形成精巢，使雄魚明顯增多。

實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)斑馬魚igf2bp3基因進(jìn)行大片段敲除，成功構(gòu)建了缺失1 513 bp且穩(wěn)定遺傳的斑馬魚突變體。野生型成年斑馬魚igf2bp3基因在不同組織中均有表達(dá)，但在生殖腺中表達(dá)量最高。通過性別比例統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)igf2bp3基因敲除的純合突變體中雌雄魚比例嚴(yán)重失調(diào)，表現(xiàn)出更多的雄性，暗示該基因在斑馬魚性別發(fā)育中發(fā)揮功能,研究結(jié)果為進(jìn)一步研究斑馬魚性別決定機(jī)制提供基礎(chǔ)。