張 沖，王 濤,2，吳 昊,2，曾 曉，孫玲玲，劉 彭

(1 徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 徐州 221000；2 徐州市生化資源高效綜合利用工程研究中心，江蘇 徐州 221000；3 青島市即墨區(qū)綜合檢驗檢測公司，山東 青島 266200；4 濰坊市食品藥品檢驗局，山東 濰坊 261100)

槲皮素是一種天然黃酮類物質(zhì)，具有多種生物活性，但是其在水中分散性差的特性限制了在生物醫(yī)藥領域的應用。目前，國內(nèi)外研究中一般采用有機溶劑對槲皮素進行溶解，應用在藥物開發(fā)領域，但是有機溶劑成本高，且大部分具有毒性，不適合在藥物開發(fā)過程中使用。近年來，許多專家學者采用親水性載體對槲皮素進行包埋的方式改善槲皮素的應用效果，這種方法對槲皮素在水中的分散性改善效果顯著，且能起到延長槲皮素氧化變質(zhì)周期，控制相關(guān)藥物在動物體內(nèi)的釋放速度等多種效果，受到廣大學者的追捧。本研究主要是選用一種雙親性的高分子聚合物嵌段式聚醚(F127)，對槲皮素進行裝載，設計制備納米級別的槲皮素/F127藥物裝載體系，研究其制備工藝參數(shù)，嘗試改善槲皮素在水中的分散效果。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

HJ-6A多頭磁力加熱攪拌器，常州國華電器有限公司；Allegra X-15R離心機，美國貝克曼庫爾特公司；XO-5200DTSN(25-45KHZ)超聲波清洗機，南京先歐儀器制造有限公司；JA5003B電子天平，上海精科天美科學儀器有限公司；TEM-H7600透射電鏡，日本日立株式會社；BT-90納米激光粒度儀，丹東百特儀器有限公司；1-2LD/PLUS真空冷凍干燥機，德國Christ公司；WFZ UV-2000紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司。

嵌段式聚醚F-127(分子式:C7H16O4，S30692-500g)上海希格瑪高技術(shù)有限公司；槲皮素,上海阿拉丁生化科技有限公司；無水乙醇(AR)，廣東光華科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 槲皮素/F127納米裝載體系的制備

用超純水配制一定濃度的F127溶液備用。準確稱取2.5 mg，5 mg，7.5 mg，10 mg槲皮素分別分散在5 mL濃度為0.1% F127分散液中，制備得到槲皮素濃度為0.5 mg/mL,1 mg/mL,1.5 mg/mL,2 mg/mL的槲皮素/F127混合溶液，將上述混合溶液在水浴超聲處理器中處理20分鐘，然后混合液在100 psi壓力下利用高壓均質(zhì)機處理多次，在超速離心機(3000 rpm，5 min)中離心，收集沉淀，冷凍干燥機中冷凍干燥24小時，得到樣品。

1.2.2 槲皮素含量測定

取一支干燥的試管加入10 mL蒸餾水，再加入10 mg槲皮素，混合均勻，取一滴稀釋到0.125 mg/mL，用紫外分光光度計測其吸光度，測完再將比色皿中的溶液取出，將其稀釋一倍在測其測其吸光度，如此這樣共測6次，記錄數(shù)據(jù)且繪制其標準曲線見圖1。

圖1 槲皮素含量標準曲線Fig.1 Standard curve of quercetin content

1.2.3 槲皮素/F127納米裝載體系理化性質(zhì)的測定

槲皮素/F127納米裝載體系粒徑的大小分布和 Zeta 電位由 激光粒度測試儀測定，該系列配備的 He+Ne 激光束波長為 633 nm，固定散射角為90°。稱取0.5 mg樣品分散在蒸餾水中，裝入比色皿，并在25 ℃下進行實驗測定。

1.2.4 槲皮素/F127納米裝載體系藥物裝載率的測定

在超聲處理和高壓均質(zhì)的過程中，槲皮素被裝載到 F127 上，收集離心上清液。具體而言，將冷凍干燥后得到的樣品用蒸餾水洗滌 3 次，以去除表面上未結(jié)合的，弱結(jié)合的和弱吸附的槲皮素。將所有上清液混合在一起，用紫外可見分光光度計測定吸光度，波長為 240 nm。然后使用從構(gòu)建的校準曲線獲得的回歸方程式計算槲皮素的含量。通過從槲皮素總數(shù)中減去上清液中槲皮素的含量來定量已裝載的槲皮素的量。

槲皮素的裝載率用如下公式計算:

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 槲皮素/F127納米裝載體系理化性質(zhì)

對制備得到的納米裝載體系相關(guān)性質(zhì)如粒徑平均值、載藥率、多分散系數(shù)和 Zeta 電位進行了測試和評估。每個條件重復三次，標準誤差被繪制為誤差線。最終正交試驗以藥物粒徑的大小為響應值，選出最優(yōu)試驗工藝。

2.1.1 料液比對槲皮素/F127納米裝載體系特性的影響

從圖2和圖3中我們可以看到，從1:1到1:4時，藥物的粒徑大小呈下降趨勢，比率為1:4時粒徑大小降到最小，在1:5時粒徑大小出現(xiàn)轉(zhuǎn)折性增大，數(shù)字均值反彈至457±20納米。裝載率隨著槲皮素與F127的比率的增加，也呈現(xiàn)出上升的趨勢，但無明顯差異，在比率為1:4時達到最高點。劉雅云[1]在基于茶多酚-殼聚糖納米緩釋體系的納米纖維素/淀粉活性包裝膜的研究中也提到了相似的結(jié)論得到了粒徑大小在200 nm左右的納米粒子。

圖2 料液比對槲皮素/F127納米裝載體系粒徑大小的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on particle size of quercetin/f127 nano loading system

圖3 料液比對槲皮素/F127納米裝載體系裝載率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on loading rate of quercetin/F127 nano loading system

2.1.2 超聲處理時間對槲皮素/F127納米裝載體系特性的影響

從圖4和圖5中可以看出超聲時間對粒徑大小、裝載率影響很小。粒徑大小呈緩慢減小又增大的趨勢，在超聲處理20 min時最小，數(shù)字均值在(199±20) nm。裝載率在超聲5～10 min時變化最為明顯，在超聲處理10 min時最高，隨后又呈下降趨勢逐漸降低。張玉杰[2]在超聲對淀粉結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的影響及制備辛烯基琥珀酸淀粉酯的作用機理中提到在超聲處理時間為8 min時,淀粉顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得有序化,熱穩(wěn)定性和糊化焓值有所升高,顆粒內(nèi)部聚集成球體結(jié)構(gòu),此階段與機械力化學效應的聚集階段相一致，與我們測得的在10 min時其理化性質(zhì)較好相類似。李季楠[3]在葉黃素納米乳化液的制備研究當中也得到了類似的結(jié)論。

圖4 超聲處理時間對槲皮素/F127納米裝 載體系粒徑大小的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on particle size of quercetin/F127 nano loading system

圖5 超聲處理時間對槲皮素/F127納米裝 載體系裝載率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on loading rate of quercetin/f127 nano loading system

2.1.3 均質(zhì)壓力對槲皮素/F127納米裝載體系特性的影響

由圖6和圖7可以看出均質(zhì)的壓力對各種性質(zhì)有很明顯的影響[4-5]，隨著均質(zhì)器壓力的不斷增加，粒徑大小急劇減小，平均數(shù)從(399±20) nm減小到(88±20) nm，在壓力為110 psi時最小，壓力繼續(xù)增大至120 psi，粒徑緩慢變大。裝載率在壓力由80 psi到100 psi的增大過程中不斷提高，壓力到達100 psi時出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)折，壓力繼續(xù)增大時，裝載率逐漸降低，在壓力為100 psi時得到最高裝載率為58%，但相較于其他條件下的裝載率則略有下降。

圖6 均質(zhì)壓力對槲皮素/F127納米裝載體系粒徑的影響Fig.6 Effect of homogenizing pressure on particle size of quercetin/F127 nano loading system

圖7 均質(zhì)壓力對槲皮素/F127納米裝載體系裝載率的影響Fig.7 Effect of homogeneous pressure on loading rate of quercetin/F127 nano loading system

3 結(jié) 論

采用單因素實驗初步研究了槲皮素/F127納米裝載體系的構(gòu)建方法，通過研究發(fā)現(xiàn)在料液比為1:4，超聲處理時間為20 min，均質(zhì)壓力為100 psi時，能夠制得粒徑在200 nm左右的槲皮素/F127納米藥物裝載體系，該體系的藥物裝載率可達到58%。該研究僅為階段性研究結(jié)果，后續(xù)工作應設計正交實驗，進一步確認實驗參數(shù)，并對樣品的理化性質(zhì)進行表征。