盧俊蓉 王惠文 何東風(fēng)

食管癌(Esophageal cancer，EC)是全球排名第七的常見癌癥，也是第六大癌癥死亡原因，每年約有57.2萬的新發(fā)病例以及50.9萬的癌癥死亡。食管癌的病理類型主要包括鱗癌(Squamous cell carcinoma)和腺癌(Adenocarcinoma)，在我國，食管癌的發(fā)病率居于所有惡性腫瘤的第四位，也是癌癥死亡的主要原因之一[1-2]，診治時(shí)的患者多數(shù)為中晚期病人，預(yù)后較差，5年生存率不足10%[3]。雖然食管癌的流行病學(xué)危險(xiǎn)因素我們已經(jīng)熟知，但是其發(fā)生的分子機(jī)制尚不清楚，闡明這些機(jī)制可能有助于識(shí)別新的治療靶點(diǎn)。婆羅雙樹樣基因4(Sal-like 4，SALL4)，編碼一個(gè)C2H2鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子，是果蠅同源異形基因spalt(sal)的哺乳動(dòng)物同源體[4]，是維持胚胎干細(xì)胞多能性和自我更新的關(guān)鍵因素之一[5-6]。SALL4作為一個(gè)原癌基因，首次在白血病中被報(bào)道具有促癌作用，在人類急性髓系白血病中發(fā)現(xiàn)了SALL4的組成性表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因SALL4B小鼠中發(fā)現(xiàn)了急性髓系白血病。隨后，SALL4的表達(dá)在各種類型的癌癥中被報(bào)道，并被證實(shí)具有診斷價(jià)值[7-8]。以往國內(nèi)外鮮有關(guān)于SALL4與食管癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的報(bào)道，本研究旨在探討SALL4在食管鱗癌中的表達(dá)及其預(yù)后判定意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年7月—2011年11月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的食管癌患者90例進(jìn)行回顧性分析，中位年齡52歲，年齡31～78歲。食管癌組織和相應(yīng)的癌旁組織(指距病灶2 cm的切緣陰性的非腫瘤組織)[9-10]標(biāo)本被納入本研究中。所有的病例均經(jīng)過病理學(xué)檢查確診為食管癌，病理類型為食管鱗癌，組織病理診斷以及評(píng)估系統(tǒng)為AJCC第八版分級(jí)系統(tǒng)。所有患者在術(shù)前均未接受過化療和放療。在2010年7月—2011年11月期間，所有患者均接受了手術(shù)治療，將圍手術(shù)期死亡的患者從本研究中剔除。本研究經(jīng)過哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

兔抗人SALL4抗體(ab29112)和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔抗體(ab205718)購自Abcam公司，IHC的S-P試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒均購自上海芯超生物科技有限公司。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用S-P法進(jìn)行免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry，IHC)染色，詳盡的實(shí)驗(yàn)流程遵從試劑說明書。

1.3 IHC測(cè)定食管鱗癌組織和癌旁組織中SALL4表達(dá)

將食管鱗癌組織和癌旁組織石蠟切片烤片2 h，經(jīng)脫蠟水化，加入過氧化氫去離子水孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入枸櫞酸鈉修復(fù)抗原，加入10%山羊血清孵育10 min封閉，加入一抗：兔抗人SALL4多克隆抗體(1∶200)過夜孵育，加入二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體孵育1 h，加入DAB顯色液顯色1 min，蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化，脫水、透明、封片，顯微鏡下拍照觀察。以已知正常食管鱗癌組織陽性切片作為陽性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對(duì)照。結(jié)果判定，陰性(0分)，臨界(1分)，輕度染色(2分)，中度(3分)，重度染色(4分)。免疫組化染色范圍的評(píng)估方法如下：0～25%(1分)，26%～50%(2分)，51%～75%(3分)，76%～100%(4分)。將染色強(qiáng)度和染色范圍的得分相乘得到的分?jǐn)?shù)作為該張病理切片的免疫組化染色得分。關(guān)于染色結(jié)果的判定，在結(jié)果中會(huì)有詳盡說明。

1.4 隨訪

術(shù)后采用電話或門診進(jìn)行隨訪，隨訪開始時(shí)間為手術(shù)開始時(shí)間，隨訪結(jié)束時(shí)間為術(shù)后死亡時(shí)間或隨訪截止時(shí)間，即2019年2月1日，隨訪期限為8年，共計(jì)45例死亡。總生存時(shí)間(Overall survival，OS)定義為手術(shù)開始至首次發(fā)現(xiàn)全因死亡或末次隨訪時(shí)間。無進(jìn)展生存時(shí)間(Progression free survival time，PFS)定義為手術(shù)開始至首次發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時(shí)間或末次隨訪時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(百分率)表示，癌組織與癌旁組織間SALL4高表達(dá)率的比較使用配對(duì)卡方檢驗(yàn)，SALL4表達(dá)水平與臨床特征間的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)或者連續(xù)性校正卡方檢驗(yàn)分析。繪制ROC曲線確定SALL4表達(dá)預(yù)測(cè)總生存結(jié)局的最佳診斷分界點(diǎn)。通過Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)比較組間生存曲線差異，OS及PFS影響因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SALL4在食管鱗癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

SALL4蛋白在食管鱗癌組織中存在過表達(dá)的情況(圖1A)，其在癌旁組織中表達(dá)較低(圖1B)。ROC曲線分析顯示，SALL4表達(dá)預(yù)測(cè)總生存結(jié)局的最佳臨床分界點(diǎn)為5(AUC=0.807，P<0.001)(圖2)。選取SALL4表達(dá)分?jǐn)?shù)5(>5被認(rèn)定為高表達(dá)，≤5被認(rèn)定為低表達(dá))作為唯一的表達(dá)診斷分界點(diǎn)。SALL4在食管鱗癌組織和癌旁組織中的高表達(dá)率分別為57.78%和5.56%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=56.714，P<0.001)(表1)。

表1 SALL4在食管鱗癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況[n(%)]

圖1 SALL4在食管鱗癌組織及癌旁組織中的IHC染色(100×)

圖2 全體患者的SALL4表達(dá)分界點(diǎn)評(píng)分ROC曲線分析

2.2 SALL4表達(dá)與食管鱗癌病人臨床特征的關(guān)系

SALL4高表達(dá)組主要集中在分化較差的食管鱗癌患者中(71.43%vs.49.09%，P=0.036)，進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，SALL4的高表達(dá)與食管鱗癌的AJCC分期狀況(P=0.015)、吸煙(P=0.002)及術(shù)中腫瘤部位(P=0.038)有關(guān)。SALL4高表達(dá)與性別、年齡、家族史、飲酒史、心腦血管疾病、糖尿病無關(guān)(P>0.05)(表2)。

表2 SALL4表達(dá)狀態(tài)與患者臨床特征間的關(guān)系[n(%)]

2.3 SALL4表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系

SALL4高表達(dá)組的食管鱗癌患者PFS較差(χ2= 5.874，P=0.015)(圖3)，SALL4高表達(dá)組的食管鱗癌患者OS較差(χ2= 14.369，P< 0.001)(圖4)。

圖3 SALL4表達(dá)與食管鱗癌患者PFS的Kaplan-Meier曲線

圖4 SALL4表達(dá)與食管鱗癌患者OS的Kaplan-Meier曲線

2.4 食管鱗癌患者預(yù)后影響因素分析

單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，在全體食管鱗癌病人中，SALL4(P=0.019)、吸煙(P<0.001)、G分級(jí)(P<0.001)以及AJCC分期(P<0.001)可能為PFS的影響因素(表3)。同時(shí)，SALL4(P<0.001)、吸煙(P<0.001)、飲酒(P=0.023)、術(shù)中腫瘤部位(P=0.015)、G分級(jí)(P<0.001)以及AJCC分期(P<0.001)可能為OS的影響因素(表3)。

表3 全體入組患者的單因素Cox回歸分析

將包括SALL4在內(nèi)的全部臨床變量匯總，進(jìn)行多因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示，G分期(P=0.022)為PFS的獨(dú)立影響因素。SALL4(P=0.048)、AJCC分期(P=0.014)、飲酒(P=0.005)、G分期(P=0.014)為OS的獨(dú)立影響因素(表4)。

表4 全體入組患者的多因素Cox回歸分析

3 討論

Spalt(sal)基因組負(fù)責(zé)編碼高度保守的鋅指蛋白家族，存在多種物種中，如果蠅、蠕蟲以及脊椎動(dòng)物等。Spalt(sal)基因在人類中存在四個(gè)旁源基因，即SALL1、SALL2、SALL3和SALL4。SALL4是SALL基因家族的一員，為鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在某些腫瘤中被發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)腫瘤形成的作用，并且可以判定預(yù)后。有研究證實(shí)，SALL4與正常造血功能關(guān)系密切，SALL4信號(hào)傳導(dǎo)異常與白血病的發(fā)生息息相關(guān)，在粒細(xì)胞性白血病中，SALL4呈現(xiàn)過表達(dá)，并且非?？赡芙?jīng)由Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)路徑來引發(fā)白血病。此外，SALL4與Bmi-1之間密切聯(lián)動(dòng)，對(duì)胚胎干細(xì)胞和正常干細(xì)胞的自我更新能力和多向分化潛能進(jìn)行調(diào)控。在轉(zhuǎn)移性的生殖細(xì)胞腫瘤中，SALL4可以認(rèn)定為一個(gè)兼具特異性和敏感性的生物靶標(biāo)，特別是在轉(zhuǎn)移性的卵巢內(nèi)胚層竇瘤的篩查中。在胃癌中，SALL4通過調(diào)控干細(xì)胞活性和細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤發(fā)生，并且可以被認(rèn)定為一個(gè)具有診斷和治療意義的靶點(diǎn)[11]。在肝癌中，同樣檢測(cè)到了SALL4的過表達(dá)現(xiàn)象[12]，并且被判定為一個(gè)治療性靶點(diǎn)[7]。在小兒的肝母細(xì)胞瘤亞型中，EpCAM陽性干細(xì)胞樣肝癌中，源自卵黃囊腫瘤的SALL4不同表達(dá)的肝細(xì)胞亞型中以及侵襲性肝癌中均得到了驗(yàn)證[7，12-15]。

在食管癌中，對(duì)50例食管鱗癌患者腫瘤組織采用相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，SALL4在食管鱗癌中存在過表達(dá)的情況，且與食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性，只是該項(xiàng)研究并未涉及到SALL4的表達(dá)情況與食管鱗癌病人的生存期之間的關(guān)聯(lián)[16]。在另一項(xiàng)食管癌組織芯片(Tissue microarray，TMA)的分析中，在腺癌中SALL4的表達(dá)和總生存率之間沒有明顯的相關(guān)性，由于檢測(cè)的食管腺癌組織只有57例，尚不能因此妄下定論，需要后續(xù)研究加以驗(yàn)證。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，SALL4的表達(dá)與較差的總生存率密切相關(guān)[17]。但是，鑒于該項(xiàng)研究所檢測(cè)的食管鱗癌組織只有55例，而且并未進(jìn)行其他相關(guān)臨床病理因素的綜合分析，尚需進(jìn)行更加完善的大樣本的研究對(duì)SALL4與食管鱗癌臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系加以闡述，這也正是本研究的初衷。

本研究增加了樣本量，檢測(cè)了90例食管鱗癌組織及癌旁組織中SALL4的表達(dá)狀況。與先前的研究結(jié)果相類似，SALL4的表達(dá)水平與腫瘤的分化情況密切關(guān)聯(lián)，在分化較差的食管鱗癌組織中SALL4的表達(dá)水平偏高。此外，在生存期方面，SALL4低表達(dá)組的食管鱗癌患者PFS和OS都要明顯優(yōu)于高表達(dá)組，SALL4被認(rèn)定為一個(gè)具有判定預(yù)后價(jià)值的獨(dú)立的生物標(biāo)志物，這表明對(duì)于SALL4表達(dá)狀態(tài)的檢測(cè)可以被認(rèn)定為一個(gè)新的有效的方法，可以篩選出那些極具高復(fù)發(fā)和進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的食管鱗癌患者。本研究的結(jié)果證實(shí)，SALL4表達(dá)水平的升高或許可以定義出一個(gè)食管鱗癌的亞型，其惡性程度較高且預(yù)后較差。由于本研究并沒有納入其他的食管癌組織類型，例如食管腺癌等，更大型的有關(guān)SALL4與食管癌的臨床病理特性的研究仍需開展。

SALL4掌控細(xì)胞存亡主要通過調(diào)控一系列基因來實(shí)現(xiàn)的，這些基因通常都存在一些于凋亡前和抗凋亡的信號(hào)通路之中。在食管鱗癌細(xì)胞中，SALL4的過表達(dá)可能起到了維持腫瘤細(xì)胞生存的重要作用，通過抑制凋亡前基因通路中的基因來實(shí)現(xiàn)的，例如抑制PTEN基因。巧合的是，食管鱗癌組織中PTEN存在表達(dá)偏低或者失表達(dá)的情況[18]?；诒狙芯拷Y(jié)果，我們假設(shè)，在食管鱗癌細(xì)胞中SALL4的過表達(dá)有可能會(huì)抑制PTEN，導(dǎo)致PTEN表達(dá)降低。SALL4可能通過與PTEN的緊密聯(lián)系進(jìn)而在PI3K/AKT/mTOR傳導(dǎo)路徑中有所作用。有趣的是，自噬的啟動(dòng)過程部分是通過PI3K/AKT/mTOR傳導(dǎo)路徑來完成的。因此我們猜想，SALL4或許能夠通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR傳導(dǎo)路徑來參與自噬的啟動(dòng)，當(dāng)然，這些假設(shè)和猜想仍然需要更多的進(jìn)一步的體內(nèi)和體外的研究來證實(shí)，這也正是下一步我們的工作方向。

綜上所述，SALL4是食管鱗癌的一個(gè)具有預(yù)后判定價(jià)值的、特異性的、獨(dú)立的生物標(biāo)志物，可以在臨床實(shí)踐中有效協(xié)助篩查出預(yù)后不良的食管鱗癌患者，同時(shí)，SALL4亦可作為食管鱗癌的一個(gè)治療靶點(diǎn)來進(jìn)行進(jìn)一步的研究。本研究結(jié)果揭示了SALL4與腫瘤細(xì)胞分化、腫瘤進(jìn)展之間的微妙關(guān)系，也為食管鱗癌的病理生理學(xué)研究提供了新的思路。