郭晨明 李慧芳 歐提庫爾·艾尼 羅志文 熱艷娜·莫合塔爾 地力木拉提·艾斯木吐拉

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化血管外科中心乳腺外科，新疆烏魯木齊市 830054

乳腺癌主要指乳腺上皮組織在癌基因與抑癌基因分泌功能紊亂條件下，在促癌因子的作用下，呈惡性增生成腫瘤。三陰性乳腺癌具有發(fā)病年齡小，組織學(xué)分級高，細(xì)胞增殖比例較高，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率高(尤以內(nèi)臟轉(zhuǎn)移顯著)等特點(diǎn)，因此預(yù)后較差，生存期較短[1]。miRNA屬于非編碼RNA,通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對，促進(jìn)靶mRNA的降解或抑制蛋白質(zhì)降解[2]，參與細(xì)胞的代謝、增殖、分化和凋亡等生理過程，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，對于診斷惡性腫瘤、評估療效及預(yù)后均具有積極作用[3]。miR-10b作為miRNA家族中的一員，miR-10b由堿基組成的單鏈小分子RNA，主要位于宿主基因的內(nèi)含子中，有多項試驗證明，miR-10b與宿主基因的mRNA表達(dá)一致，大量研究表明，miR-10b在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤組織中表達(dá)異常[4-6]。miR-10b在不同分子亞型的乳腺癌組織中表達(dá)水平亦有所差異，在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)水平最高[7]?；熢谌橄侔┚C合治療中不可或缺，而如何提高乳腺癌化療致敏性成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。對此，本研究旨在研究miR-10b對三陰性乳腺癌化療致敏性的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及細(xì)胞株 本研究所用組織標(biāo)本均來自我院2012年8月—2015年8月收治的34例采取化療的三陰性乳腺癌患者，其中化療敏感18例、化療耐受16例，病情完全緩解12例、部分緩解22例，均為女性患者，單側(cè)惡性腫瘤，年齡范圍31～57歲，中位年齡46歲；經(jīng)粗針穿刺活檢，病理診斷為三陰性乳腺癌；本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書；另外，三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231來源于上海研域生物科技有限公司。

1.2 主要試劑和設(shè)備 本研究使用胎牛血清由江蘇寶萊生物科技有限公司提供，RPMI1640培養(yǎng)基和TRIzol試劑由上海昱都生物科技有限公司提供，LipofectamineTM2000由蘇州拜吉氏生物科技有限公司提供，實時熒光定量PCR試劑由北京索萊寶科技有限公司提供；將miR-10b模擬物、miR-10b抑制物分別簡稱為A、B，并分別設(shè)立陰性對照(A-NC)組和(B-NC)組，A-NC、B-NC均由百奧邁科生物技術(shù)有限公司提供；紫杉醇由哈藥集團(tuán)生物工程有限公司提供，順鉑由上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供，阿霉素由浙江海正藥業(yè)有限公司提供；使用ABI7700熒光定量PCR儀和FACS流式細(xì)胞儀。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231系用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，室溫下培養(yǎng)，每隔48～72h更換培養(yǎng)液，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗研究。

1.3.2 應(yīng)用實時定量RT-PCR檢測miR-10b的表達(dá)水平：按照TRIzol試劑的說明書，提取三陰性乳腺癌細(xì)胞株和冷凍組織標(biāo)本中的總RNA，使用TaqManmiRNA試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR，循環(huán)條件：在95℃環(huán)境下，預(yù)變性10min，在95℃、60℃環(huán)境下，分別循環(huán)15s、60s，40個循環(huán)；U6 snRNA作為內(nèi)參；使用ABI7700熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-PCR；記錄熒光信號到達(dá)閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值；通過設(shè)置復(fù)孔取平均值，即目的基因擴(kuò)增的Ct值；miR-10b相對定量采用2-△△Ct法，△Ct值=目的基因Ct值-參照基因Ct值，△△Ct值=處理組目的基因△Ct值-對照組目的基因△Ct值。

1.3.3 應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)miR-10b轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株：檢測MDA-MB-231細(xì)胞株中miR-10b表達(dá)水平后，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將三陰性乳腺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-10b模擬物(A)和miR-10b抑制物(B)，并分別設(shè)立陰性對照(A-NC)組和(B-NC)組。轉(zhuǎn)染前24h應(yīng)用不含抗生素的培養(yǎng)液傳代，嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6h后，用含血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)并用于后續(xù)實驗。

1.3.4 應(yīng)用CCK-8方法檢測腫瘤細(xì)胞增殖：細(xì)胞轉(zhuǎn)染換液后、繼續(xù)培養(yǎng)24h后消化，將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔8×103個細(xì)胞，每組設(shè)3個復(fù)孔，在細(xì)胞貼壁后加化療藥，分別加入2μmol/L紫杉醇、2μmol/L順鉑及4μmol/L阿霉素；在加完化療藥物后，繼續(xù)培養(yǎng)48h，應(yīng)用CCK8法檢測；將每孔原培養(yǎng)基棄掉，加入100μl的DMEM培養(yǎng)基，加入10μl的CCK8檢測液，將待測板放置在培養(yǎng)箱后，使用酶標(biāo)儀OD 450nm波長檢測吸光度值。

1.3.5 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測乳腺癌細(xì)胞的凋亡：收集各組不同化療藥物處理過的細(xì)胞，經(jīng)消化后用1 000r/min離心8min，PBS洗滌2次，用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI染色，避光孵育10min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞中的DNA含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)，計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較使用t檢驗，計數(shù)資料使用χ2檢驗；多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，采用雙側(cè)檢驗；以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-10b在三陰性乳腺癌組織中的表達(dá) 病情完全緩解組miR-10b表達(dá)水平為1.321±0.421，顯著高于部分緩解組的0.863±0.354，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；化療敏感組腫瘤組織miR-10b表達(dá)水平為1.187±0.365，顯著高于化療耐受組的0.786±0.349，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；腫瘤組織的miR-10b表達(dá)水平為0.998±0.276，顯著高于癌旁組織的0.312±0.122，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Kaplan-Meier生存曲線顯示，三陰性乳腺癌的生存率與miR-10b的表達(dá)有關(guān)，miR-10b表達(dá)陰性的乳腺癌患者的生存率高于miR-10b表達(dá)陽性的乳腺癌患者，兩者之間的比較有顯著性差異(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-10b表達(dá)對三陰性乳腺癌患者生存率的影響

2.2 轉(zhuǎn)染后各組miR-10b的表達(dá)水平 比較A組與A-NC組、B組與B-NC組細(xì)胞株的miR-10b表達(dá)水平，其中A組細(xì)胞株的miR-10b表達(dá)水平較A-NC組明顯提高，相對倍數(shù)達(dá)1.21×104；B組細(xì)胞株miR-10b表達(dá)水平較B-NC組明顯提高，相對倍數(shù)達(dá)9.79×10-3；可見，轉(zhuǎn)染效果明顯。見表1。

表1 各組miR-10b的表達(dá)水平比較

2.3 各組無藥物干預(yù)后的腫瘤細(xì)胞增殖率 細(xì)胞株培養(yǎng)48h后，A組、A-NC組、B組、B-NC組腫瘤細(xì)胞增殖率分別為(1.79±0.07)%、(1.76±0.05)%、(1.89±0.10)%、(1.83±0.14)%；A組與A-NC組、B組與B-NC組間的腫瘤細(xì)胞增殖率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組化療藥物干預(yù)后細(xì)胞增殖和凋亡的變化 比較A組與A-NC組、B組與B-NC組細(xì)胞株分別在紫杉醇、順鉑、阿霉素培養(yǎng)48h后的細(xì)胞增殖率、細(xì)胞凋亡率；A組細(xì)胞株在紫杉醇、順鉑進(jìn)行培養(yǎng)48h后腫瘤細(xì)胞增殖率顯著低于A-NC組，腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著高于A-NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；B組細(xì)胞株在紫杉醇、順鉑進(jìn)行培養(yǎng)48h后腫瘤細(xì)胞增殖率顯著高于B-NC組，腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著低于B-NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但A組與A-NC組、B組與B-NC組細(xì)胞株在阿霉素進(jìn)行培養(yǎng)48h后腫瘤細(xì)胞增殖率、腫瘤細(xì)胞凋亡率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；可見，紫杉醇、順鉑對三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖率、凋亡率影響顯著，阿霉素對三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖率、凋亡率影響較??；見圖2、3。

圖2 不同化療藥物處理后各組腫瘤細(xì)胞的增殖率比較

3 討論

三陰性乳腺癌由于缺乏相應(yīng)受體不能進(jìn)行內(nèi)分泌治療及靶向治療，治療以化療為主但效果欠佳，臨床表現(xiàn)出高侵襲性、高復(fù)發(fā)率和高病死率等特征[8]。因此如何提高化療致敏性是提高三陰性乳腺癌療效的關(guān)鍵，亦是研究熱點(diǎn)。miRNA與癌癥密切相關(guān)，通過細(xì)胞周期調(diào)控、基因組完整性、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡和轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵環(huán)節(jié)發(fā)揮作用[9]。miR-10b參與了多種生命過程，負(fù)調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)節(jié)多種生物學(xué)行為，與乳腺癌的關(guān)系密切，對于診斷三陰性乳腺癌、評估療效及預(yù)后起到重要作用。國內(nèi)外有研究表明，miR-10b表達(dá)水平較低與乳腺癌的治療耐藥性相關(guān)，通過上調(diào)miR-10b表達(dá)水平，可以使化療藥物作用于抵抗的腫瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)變?yōu)閷熕幬锩舾械募?xì)胞[10-11]。應(yīng)用信號網(wǎng)絡(luò)分析系統(tǒng)(8.5版本)研究指出，miR-10b促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用非常顯著，進(jìn)一步研究證明，miR-10b促進(jìn)細(xì)胞凋亡的生理過程與miR-10b可抑制有絲分裂、影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白翻譯有關(guān)。miR-10b通過調(diào)控組蛋白的甲基化，達(dá)到影響乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性[12]。通過本研究可知，miR-10b表達(dá)水平較高的三陰性乳腺癌患者對術(shù)前化療方案的敏感度顯著高于低表達(dá)miR-10b的三陰性乳腺癌，前者的臨床療效亦優(yōu)于后者。在本研究后續(xù)的細(xì)胞學(xué)研究中，通過三陰性乳腺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染為miR-10b的模擬物和抑制物，分別顯著提高和降低miR-10b表達(dá)水平。同時，分別加入紫杉醇、順鉑和阿霉素進(jìn)行培養(yǎng)，在紫杉醇、順鉑進(jìn)行培養(yǎng)48h后，miR-10b高表達(dá)水平組的細(xì)胞增殖率低于陰性對照組，腫瘤細(xì)胞凋亡率大于陰性對照組，miR-10b低表達(dá)水平組的細(xì)胞增殖率高于陰性對照組，腫瘤細(xì)胞凋亡率小于陰性對照組，而加入阿霉素的miR-10b高表達(dá)水平組的細(xì)胞增殖率、腫瘤細(xì)胞凋亡率與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；說明提高miR-10b表達(dá)水平，有利于提高三陰性乳腺癌細(xì)胞株對紫杉醇和順鉑的敏感度，但對阿霉素的敏感度無顯著影響，進(jìn)一步說明miR-10b在調(diào)控三陰性乳腺癌化療致敏性方面是有選擇性的，可能與化療藥物的作用機(jī)制有關(guān)。

圖3 不同化療藥物處理后各組腫瘤細(xì)胞的凋亡率比較

三陰性乳腺癌組織學(xué)分級較差多伴p53突變，EGFR等表達(dá)[8]。紫杉醇可使腫瘤細(xì)胞的有絲分裂期受阻，抑制細(xì)胞分裂，還可與微管蛋白結(jié)合，抑制致癌因素對微管系統(tǒng)的影響，具有良好的抗腫瘤活性[13]。在腫瘤細(xì)胞的有絲分裂過程中，Cyclin B1發(fā)揮著關(guān)鍵作用，Cyclin B1的含量和活性與細(xì)胞分裂期有關(guān)，而有研究顯示隨著紫杉醇化療時間的延長，Cyclin B1表達(dá)水平隨之提高，使腫瘤細(xì)胞被阻滯在分裂中期[14]。另外，紫杉醇作用后，Cyclin B1表達(dá)水平有所反跳，可能是腫瘤細(xì)胞的代償性反應(yīng)，而miR-10b卻具有使腫瘤細(xì)胞Cyclin B1表達(dá)水平降低的調(diào)控作用，使更多的腫瘤細(xì)胞有絲分裂過程受阻，無法完成有絲分裂，促使細(xì)胞凋亡。眾所周知，順鉑作為具有細(xì)胞毒性的烷化劑，通過抑制腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制，達(dá)到治療惡性腫瘤的效果。針對順鉑治療三陰性乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌對順鉑的化療致敏性與p53基因是否突變有關(guān)。p53基因突變作為三陰性乳腺癌病情惡化的重要指標(biāo)，使三陰性乳腺癌對順鉑的化療致敏性降低。Margaret SE等[15]研究指出，p53基因突變后腫瘤細(xì)胞凋亡受阻，作為化療致敏性降低的重要表現(xiàn)，可能與DNA損傷修復(fù)增加有關(guān)。此外，三陰性乳腺癌組織的miR-10b表達(dá)水平與p53呈負(fù)相關(guān)，亦進(jìn)一步提示miR-10b可能影響p53表達(dá)，達(dá)到影響三陰性乳腺癌對順鉑的化療致敏性。此外，阿霉素作為一種糖甙抗生素，具有廣泛的抗腫瘤活性，可同時抑制DNA、RNA合成，具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用，對于細(xì)胞周期各階段均具有抑制作用。藥理研究表明，阿霉素還可促進(jìn)自由基生成，且細(xì)胞學(xué)研究顯示，阿霉素主要定位于細(xì)胞漿內(nèi)，提示三陰性乳腺癌對阿霉素的化療致敏性與藥物進(jìn)入細(xì)胞核的效率有關(guān)[16]。由于miR-10b主要調(diào)控腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，影響細(xì)胞分裂關(guān)鍵階段的檢查點(diǎn)，促使腫瘤細(xì)胞凋亡，而阿霉素殺滅腫瘤細(xì)胞的過程與細(xì)胞毒性密切相關(guān)，殺滅腫瘤細(xì)胞的效果與進(jìn)入細(xì)胞核的效率有關(guān)；這可能就是上調(diào)三陰性乳腺癌組織的miR-10b表達(dá)水平，并不能影響細(xì)胞株MDA-MB-231對阿霉素敏感性的原因。

眾所周知，在不同分子亞型的乳腺癌中，三陰性乳腺癌的預(yù)后最差，治療較為困難，但通過本研究可知，通過化療治療三陰性乳腺癌患者，在達(dá)到有效或控制病情的情況下，可進(jìn)一步延長患者的壽命，改善預(yù)后。同時，高水平miR-10b的三陰性乳腺癌患者的化療致敏性更好，可能與miR-10b能提高細(xì)胞株MDA-MB-231對紫杉醇、順鉑的敏感性，但不影響對阿霉素的敏感性。對此，miR-10b可能成為三陰性乳腺癌診治的新靶點(diǎn)，為研究乳腺癌耐藥性問題而提供新的方向。