張明龍 王秀華 呂 瑩 李鵬輝 劉 丹 梅慶步 劉萬(wàn)全 鄭立紅▲

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)中心，黑龍江齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006

乳腺癌是常見(jiàn)的多基因遺傳的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的健康?；谌蚪M關(guān)聯(lián)分析（genome wide association study，GWAS）的研究，乳腺癌易感基因譜正不斷完善。目前已經(jīng)確定了150 多個(gè)與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的基因位點(diǎn)[1]。然而，乳腺癌發(fā)病的靶基因和具體機(jī)制仍然不明確。因此，對(duì)不同群體的乳腺癌易感基因的篩查對(duì)乳腺癌患者的早期診斷和個(gè)體化治療至關(guān)重要。B 細(xì)胞特異性白血病病毒插入位點(diǎn)-1（Bcell-specific moloney leukemia virus insection site 1，BMI-1）基因作為原癌基因，可以通過(guò)編碼多梳蛋白抑制抑癌基因的活性，在腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展和腫瘤干細(xì)胞的維持上起到關(guān)鍵作用[2]，BMI-1 基因可以通過(guò)核轉(zhuǎn)汞因大（nudear factor κB，NF-κB）/金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）通路增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[3]?；|(zhì)MMP-3 基因可編碼基質(zhì)溶解酶，與腫瘤的血管侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[4]。本研究選取BMI-1 基因rs1042059、rs201024480以及MMP-3 基因rs3025058 位點(diǎn)，對(duì)黑龍江地區(qū)漢族女性乳腺癌患者進(jìn)行易感基因篩查，評(píng)估上述基因與乳腺癌易感性的關(guān)聯(lián)，以期為乳腺癌患者的診治提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2018年7月黑龍江省齊齊哈爾市和大慶市（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二、三醫(yī)院、齊齊哈爾建華醫(yī)院和大慶油田總醫(yī)院）524 例漢族女性乳腺癌患者作為病例組。乳腺癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)過(guò)病理診斷確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他癌癥和接受過(guò)放療或化療，患者彼此之間無(wú)親屬關(guān)系。選取同期進(jìn)行健康體檢的518 例健康體檢者作為對(duì)照組。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：健康個(gè)體。排除標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤家族史、腫瘤家族史和癌前病變者，如宮頸炎、疣和癌前病變。本研究通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，并遵循知情同意原則。

1.2 方法

1.2.1 樣本信息和臨床資料

本研究所有樣本基本信息和臨床資料信息均同步獲取于各醫(yī)院。乳腺癌樣本的基本信息包括年齡和月經(jīng)初潮年齡，臨床資料包括絕經(jīng)年齡、腫瘤家族史、腫瘤分期（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期）、腫瘤大小（T1～T4）[3]和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。對(duì)照組只收集基本信息（年齡和月經(jīng)初潮年齡）。

1.2.2 DNA 提取與基因分型

采用人類基因組DNA 提取試劑盒（北京艾德萊）對(duì)上述樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取，所得DNA于-80℃保存。采用微量分光光度計(jì)（北京奧盛）對(duì)DNA樣本進(jìn)行定量。采用PCR-LDR 技術(shù)（華大蛋白）對(duì)BMI-1 基因外顯子區(qū)域的2 個(gè)功能性單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)：包括rs1042059（18Cys＞Tyr）、rs201024480（310Ser＞Asn）和MMP-3 基因啟動(dòng)區(qū)域的rs3025058 位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，引物及探針的合成遵循基因源序列。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 和Haploview 4.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析兩組間的計(jì)量資料信息；計(jì)數(shù)資料采用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)Hardy-Weinberg 平衡；通過(guò)對(duì)混雜因素進(jìn)行校正以后，采用非條件性logistic 回歸分析法評(píng)估乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，風(fēng)險(xiǎn)值 （OR）和95%置信區(qū)間（CI）表示患病風(fēng)險(xiǎn)。采用HaploView 4.2進(jìn)行連鎖分析和單倍型分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本基本特征和比較分析

病例組和對(duì)照組的基本信息和臨床資料信息見(jiàn)表1。通過(guò)進(jìn)行組間比較，兩組的年齡、月經(jīng)初潮年齡和腫瘤家族史比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，在后續(xù)的logistic 回歸和單倍型分析中，需要進(jìn)行校正。病例組中，5.95%有腫瘤家族史，且絕經(jīng)年齡平均在50 歲左右。腫瘤大小T1、T2、T3和T4分別占49.69%，42.77%，3.77%和3.77%；腫瘤分期Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期分別占4.63%、49.27%和46.10%；淋巴結(jié)呈陽(yáng)性者占42.47%。

表1 樣本基本特征和比較分析

2.2 平衡性檢驗(yàn)和連鎖分析

Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)結(jié)果顯示，3 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在兩組間的基因型分布觀察值與期望值無(wú)顯著性差異（P＞0.05），提示該研究群體具有良好的遺傳代表性。連鎖分析結(jié)果顯示，BMI-1 基因rs201024480、rs1042059 位點(diǎn)之間不存在連鎖遺傳，可構(gòu)成單倍型進(jìn)行后續(xù)分析。

2.3 BMI-1 基因多態(tài)性與乳腺癌易感性的關(guān)聯(lián)分析

BMI-1 基因rs201024480 和rs1042059 屬于低外顯率突變位點(diǎn)，突變型等位基因A 和G 在群體里頻率極低，雜合子基因型GA 和AG 基因型頻率同樣很低，且等位基因和基因型頻率分布在兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。鑒于兩位點(diǎn)的突變純合子較少，本研究在顯性模型（AA/AG+GG）和加性遺傳模型（AA/AG/GG）下對(duì)乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。在校正年齡、月經(jīng)初潮年齡和腫瘤家族史因素后，rs201024480、rs1042059 的多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性（OR=0.94，1.03；95%CI=0.36～2.42，0.27～3.97；P=0.892，0.965）。同樣，由兩位點(diǎn)組成的單倍型G-A 和A-A 與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性（OR=1.08，95%CI=0.49～2.39，P=0.842）。BMI-1 基因多態(tài)性與乳腺癌易感性的關(guān)聯(lián)分析見(jiàn)表2。

表2 BMI-1 基因兩個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性在與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析

2.4 MMP-3 基因多態(tài)性與乳腺癌易感性的關(guān)聯(lián)分析

兩組間MMP-3 基因rs3025058 位點(diǎn)多態(tài)性的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），突變純合型5A5A攜帶者患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)較對(duì)照組高約1.51 倍。在校正年齡、月經(jīng)初潮年齡和腫瘤家族史因素后，顯性模型（AA/AG+GG）下，兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，OR=1.51，95%CI=1.17～1.94，P=0.001）。加性模型（AA/AG/GG）下，兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pchi＜0.05，OR=1.48，95%CI=1.16～1.91，Plog=0.002）。MMP-3 基因多態(tài)性與乳腺癌易感性的關(guān)聯(lián)分析見(jiàn)表3。

表3 MMP-3 基因多態(tài)性在與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

BMI-1 基因作為編碼多梳蛋白抑制復(fù)合體的一部分，參與維持復(fù)合體的完整性，在組蛋白H2A 的泛素化修飾中起關(guān)鍵作用，參與并影響細(xì)胞增殖、DNA修復(fù)、凋亡和衰老等多個(gè)過(guò)程[5]。其過(guò)表達(dá)與腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移性以及放化療敏感性和預(yù)后密切相關(guān)[6]，在乳腺癌、原發(fā)性肝細(xì)胞癌、胃癌、卵巢癌、頭頸部癌、胰腺癌和肺癌等多種癌癥中均可見(jiàn)過(guò)表達(dá)。本研究選取位于BMI-1 基因外顯子區(qū)域的2 個(gè)SNP 位點(diǎn)：rs1042059（18Cys＞Tyr）和rs201024480（310Ser＞Asn），其中rs1042059 位置的多態(tài)性影響了組蛋白的泛素化修飾[7]。許多研究[8-10]表明，BMI-1 可以通過(guò)調(diào)控NF-κB/MMP 和PTEN/P13K/Akt 通路增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，BMI-1 基因rs1042059、rs201024480 位點(diǎn)與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不具有相關(guān)性。其原因可能是本研究選取的基因位點(diǎn)數(shù)量有限。因此，并不能從總體的累加效應(yīng)水平或者基因間的交互效應(yīng)的角度去確定該基因是否可以被排除做為乳腺癌的候選易感基因。BMI-1 基因多態(tài)性與漢族女性乳腺癌易感性的關(guān)系尚需進(jìn)一步驗(yàn)證，需要更多基因位點(diǎn)、更大樣本和精心設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)研究。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族是一類分泌型鋅依賴型內(nèi)肽酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解、腫瘤的增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程[11-12]。MMP-3 基因可通過(guò)降解纖連蛋白和膠原纖維參與細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)，其過(guò)表達(dá)與包括乳腺癌在內(nèi)的各種腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)有關(guān)[13]。有關(guān)MMP 的基因多態(tài)性與乳腺癌的關(guān)聯(lián)分析研究較多[14-16]，其中MMP-3 基因中研究較多的是位于啟動(dòng)子區(qū)域-1171的6A/5A 位點(diǎn)，即rs3025058。該位點(diǎn)在不同族群中的多態(tài)性差異較明顯，其多態(tài)性與乳腺癌易感性的關(guān)聯(lián)也在不同族群中存在明顯差異[13，17-18]。鑒于此，本研究對(duì)黑龍江地區(qū)漢族女性乳腺癌患者與MMP-3 基因的易感性進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估。本研究結(jié)果顯示，MMP-3 rs3025058 基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性（P＞0.05），攜帶5A 等位基因和5A5A 基因型群體患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)比對(duì)照組提高約1.5 倍。并且，已有研究[19]證明5A 等位基因比野生型6A 具有更高的轉(zhuǎn)錄活性，由此可見(jiàn)，5A 等位基因更有利于乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

基于以上研究結(jié)果和討論，本研究仍存在一些局限性。第一，單純的病例-對(duì)照研究并不能從生物學(xué)上完全證明乳腺癌發(fā)病和多基因遺傳的具體關(guān)系，仍然依靠于功能學(xué)的相關(guān)深入研究；第二，明確靶基因是否可作為乳腺癌易感基因，單一SNP 位點(diǎn)的檢測(cè)是不足以證明的，后續(xù)將進(jìn)一步篩選更多位點(diǎn)，從多個(gè)位點(diǎn)所構(gòu)成的單倍型、累加效應(yīng)和交互作用等角度分析關(guān)聯(lián)性；第三，本研究群體較為局限，只限于黑龍江省地區(qū)漢族女性群體，并不能代表中華地區(qū)漢族群體總體關(guān)聯(lián)水平，后續(xù)應(yīng)對(duì)不同群體的關(guān)聯(lián)研究進(jìn)行匯總和meta 分析，以排除多群體混淆的干擾。

綜上所述，MMP-3 基因rs3025058 位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性；可為本地區(qū)乳腺癌患者的早期篩查、診斷及個(gè)體化治療提供參考依據(jù)。