譚 娟，遲靜薇，車 奎，王顏剛*

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，山東 青島 266000；2青島大學(xué)附屬醫(yī)院)

腦、心臟、腎臟等大血管病變是2型糖尿病患者的重要并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制存在多種學(xué)說(shuō)，得到公認(rèn)的主要為糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)和氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)等。研究證實(shí)，糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)展中最為重要的是AGEs/RAGE途徑。目前，臨床對(duì)此病變尚無(wú)有效的防治方法。異葒草素(ISO)是一種存在于多種藥用植物中的木犀草素糖苷類黃酮化合物。研究顯示，其有著減輕胰島素抵抗、抗氧化應(yīng)激及抑制炎癥等多種藥理活性[1-5]。本研究將其應(yīng)用于2型糖尿病小鼠模型，探討對(duì)其血糖、大血管的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 選取C57BL雄性小鼠70只，均為健康、清潔級(jí)，6～8周齡，體重(20±2)g。于室溫25℃、濕度60%，5～6只/籠，飼養(yǎng)。SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)維持期鼠糧，以高壓蒸汽滅菌法滅菌，小鼠自由飲食。異葒草素(北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司)，鏈脲佐菌素(美國(guó)Medche-mExpress公司)，檢測(cè)AGEs的ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1造模 將小鼠分為正常對(duì)照組(NC，飼養(yǎng)8周未發(fā)病的小鼠，共7只)和模型組(DM，飼養(yǎng)后糖尿病發(fā)病的小鼠，共46只)。基礎(chǔ)飼料飼喂NC組4周。以高脂飼料飼喂DM組4周，連續(xù)5 d腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素30 mg/(kg·d)，每周在固定的時(shí)間稱重，1周后自尾部針刺取血測(cè)隨機(jī)血糖，連續(xù)2次隨機(jī)血糖大于16.6 mmol/L者為造模成功。

1.2.2分組及處理 將46只成功造模的糖尿病小鼠隨機(jī)分為5組：糖尿病模型組(BC)，共10只，發(fā)病后不采取任何干預(yù)措施；ISO低劑量組，共9只，10 mg/(kg·d)；ISO中劑量組，共9只，20 mg/(kg·d)；ISO高劑量組，共9只，40 mg/(kg·d)；胰島素組(INS)，共9只，根據(jù)血糖情況給予適量的甘精胰島素腹腔注射。8周后取各組小鼠胸主動(dòng)脈，以4%多聚甲醛溶液固定部分組織做病理檢測(cè)用，剩余的放入去RNA酶的EP管中，-80℃保存待用。光學(xué)顯微鏡觀察血管內(nèi)膜及血管結(jié)構(gòu)的變化情況；BCA法對(duì)胸主動(dòng)脈組織中蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)；ELISA法檢測(cè)樣本中AGEs濃度。

2 結(jié)果

2.1一般狀況 NC組小鼠較好，皮毛豐富有光澤，活躍敏捷；另外5組逐漸出現(xiàn)懶動(dòng)、多食、消瘦、脫毛等情況，其中以BC組消瘦、脫毛更明顯。

2.2組織病理學(xué)情況 鏡下觀察，NC組動(dòng)脈結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜光滑，中膜無(wú)增厚，平滑肌細(xì)胞排列較為整齊；BC組主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，局部可見(jiàn)內(nèi)皮及沉積物向管腔內(nèi)突出，內(nèi)皮細(xì)胞破損，與內(nèi)皮下層分界不清；ISO低劑量組主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)膜粗糙，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，中膜增厚；ISO中劑量組主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，中膜結(jié)構(gòu)較松散，內(nèi)膜下層可見(jiàn)增厚；INS組主動(dòng)脈內(nèi)膜表面不光滑，偶見(jiàn)黏附，內(nèi)膜下層偶見(jiàn)增厚；ISO高劑量組血管內(nèi)皮大致正常，中膜、平滑肌、外膜結(jié)構(gòu)均未見(jiàn)明顯異常。見(jiàn)封三圖1。

2.3各組隨機(jī)血糖及組織中AGEs水平情況 隨機(jī)血糖：除BC組與ISO低劑量組、INS組與ISO高劑量組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(q=2.43，0.38；P>0.05)，其他各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.41～27.76，P<0.05)；主動(dòng)脈中AGEs水平：除INS組與ISO中劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(q=1.81，P>0.05)，其他各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.66～29.92，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組隨機(jī)血糖及大血管AGEs水平比較

3 討論

流行病學(xué)研究表明，糖尿病患者易并發(fā)多種血管、神經(jīng)等慢性并發(fā)癥，其中大血管病變是導(dǎo)致其死亡的主要原因。在糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，高血糖對(duì)于血管內(nèi)皮等所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用尤為重要[6]。持續(xù)高血糖，非酶促反應(yīng)條件下，核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的游離氨基與還原糖的醛基經(jīng)過(guò)縮合、重排、裂解、氧化修飾從而產(chǎn)生穩(wěn)定的AGEs。已有研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，RAGE是糖基化終末產(chǎn)物受體中研究最多的，其廣泛存在于機(jī)體的各個(gè)組織器官中。多項(xiàng)研究表明[9-10]，AGEs/RAGE通路是糖尿病所致各種并發(fā)癥的主要原因之一。

ISO具有多種藥理作用。本研究通過(guò)不同劑量的ISO對(duì)糖尿病小鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，BC組隨機(jī)血糖及AGEs水平最高，NC組最低；隨著ISO劑量的升高，隨機(jī)血糖及AGEs水平呈遞降趨勢(shì)。說(shuō)明ISO可使糖尿病小鼠大血管組織AGEs的蓄積減少，進(jìn)而使糖尿病大血管微環(huán)境得到改善，且高劑量ISO干預(yù)的作用與單純應(yīng)用胰島素干預(yù)的作用相比更強(qiáng)，所以ISO有望作為治療糖尿病大血管并發(fā)癥的新方法應(yīng)用于臨床。

但是，目前仍有許多問(wèn)題尚待解決，如ISO對(duì)于AGEs/RAGE通路是否有抑制作用，尚需進(jìn)一步論證。另外持續(xù)高血糖血管壁脆弱，且小鼠體型較小，取材過(guò)程中的組織損傷、血管與周邊組織分離不徹底等問(wèn)題對(duì)于實(shí)驗(yàn)的效果均會(huì)產(chǎn)生影響，后續(xù)將繼續(xù)改進(jìn)。