侯亞威 李亞蒙 徐玉坤 肖振衛(wèi)

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，山東濟(jì)南 250000；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科，山東濟(jì)南 250000

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabeticperipheralneuropathy，DPN）是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，主要以手腳或腿疼痛、感覺(jué)異常為特征，并伴有周圍神經(jīng)病變[1]。炎癥介質(zhì)、代謝異常及神經(jīng)元活性與DPN 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，DPN 的治療可能涉及到多種聯(lián)合治療，其中包括控制血糖水平和疼痛，研究者們一直尋求治療DPN 最有效的手段[2]。

DPN 在中醫(yī)屬消渴病中“痹癥”范疇，認(rèn)為此病病機(jī)多為“氣虛血瘀”，同時(shí)，多年臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)雞血藤-寄生在改善DPN 患者的疼痛狀態(tài)及感覺(jué)異常方面效果顯著，查閱資料發(fā)現(xiàn)，桑寄生-雞血藤亦是祝諶予老師之經(jīng)驗(yàn)伍用，其與降糖藥參合，屢見(jiàn)奇效[3]。雞血藤，味苦微甘，性溫，歸肝經(jīng)，能夠補(bǔ)血活血、舒筋絡(luò)；桑寄生，味苦甘，性平，可補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨；二者伍用，補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、通絡(luò)之力加強(qiáng)[4-5]。

中藥方劑治療疾病在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，現(xiàn)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探索雞血藤-桑寄生治療DPN 的分子機(jī)制，并通過(guò)分子對(duì)接進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 藥物相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）尋找2 味中藥化學(xué)組成成分，并進(jìn)行ADME 篩選，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 兩個(gè)閾值初步獲得藥物的有效活性成分及靶點(diǎn)，并通過(guò)TCMID 及中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方搜集2017 年2 月至2020 年12 月的文獻(xiàn)補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)，刪除未預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)成分，并在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范化合物作用的靶點(diǎn)[6-8]。

1.2 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將藥物活性成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 中，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并獲取藥物主要成分。

1.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

在GeneCards 中挖掘DPN 的潛在靶點(diǎn)，根據(jù)學(xué)者經(jīng)驗(yàn)，設(shè)Score 值≥2 倍中位數(shù)的靶點(diǎn)為DPN 的潛在靶點(diǎn)[9]，并在TTD、DRUGBANK 中尋找DPN 靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)。

1.4 藥物疾病交集靶點(diǎn)獲取及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明確藥物-疾病靶點(diǎn)間的相互作用，利用R 語(yǔ)言繪制維恩圖，獲取交集靶點(diǎn)，通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI 分析，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，借助Cytoscape 3.7.2，對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治黾翱梢暬?，并獲取核心靶點(diǎn)[10]。

1.5 GO 與KEGG 分析及其可視化

將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 平臺(tái)，完成GO 及KEGG 分析，通過(guò)生物信息平臺(tái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析[11]。

1.6 “藥物-成分-通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

通過(guò)Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建“藥物-成分-通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)度值獲取雞血藤-桑寄生治療DPN發(fā)揮作用的核心成分及通路。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證“1.6”中核心成分及其靶點(diǎn)在能量和結(jié)構(gòu)上匹配程度，依據(jù)TCMSP 獲取化合物小分子2D 結(jié)構(gòu)，采用ChemDraw、Chem3D 獲得化合物小分子的3D 結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Pymol，對(duì)其進(jìn)行去水、移除靶蛋白中的配體。從RCSBPDB 中獲取靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)。采用AutoDockTools，設(shè)置其活性口袋，運(yùn)行Autodockvina 進(jìn)行分子對(duì)接，并采用PyMol 進(jìn)行結(jié)構(gòu)匹配及可視化分析[12]。

2 結(jié)果

2.1 藥物靶點(diǎn)的獲取

初步獲得化學(xué)成分：雞血藤68 種、桑寄生46 種，經(jīng)ADME 篩選后共獲得活性成分：雞血藤23 種、桑寄生2 種，見(jiàn)表1。雞血藤靶點(diǎn)426 個(gè)、桑寄生靶點(diǎn)157 個(gè)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)共得到178 個(gè)靶點(diǎn)。

表1 藥物主要成分

2.2 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，共得到203 個(gè)節(jié)點(diǎn)，456 條邊，橢圓形代表靶點(diǎn)，菱形代表活性成分，三角形代表藥物。見(jiàn)圖1。

圖1 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 疾病靶點(diǎn)的獲取

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得疾病靶點(diǎn)4778 個(gè)。該靶點(diǎn)Score 中位數(shù)為5.54，故設(shè)定Score 值≥11.8 的靶點(diǎn)為DPN 的潛在靶點(diǎn)。結(jié)合TTD、OMIM、DRUGBANK補(bǔ)充靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值，得到1199 個(gè)靶點(diǎn)。

2.4 維恩圖及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

藥物靶點(diǎn)及DPN 靶點(diǎn)篩選后取交集，繪制緯恩圖，得到78 個(gè)交集靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。PPI 網(wǎng)絡(luò)共有1413 條邊，見(jiàn)圖3。對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，得?4 個(gè)核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖4。

圖2 “藥物-疾病”維恩圖

圖3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

圖4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用拓?fù)浞治?/p>

2.5 GO 與KEGG 分析

通過(guò)Metascape 平臺(tái)對(duì)“2.4”中核心靶點(diǎn)進(jìn)行通路信號(hào)分析，以富集分析的中位數(shù)為依據(jù)，GO 中生物過(guò)程（biological process，BP）選取25 個(gè)、GO 的細(xì)胞成分（cell componcnt，CC）選取10 個(gè)、GO 的分子功能（molecular furction，MF）選取9 個(gè)進(jìn)行富集三合分析，見(jiàn)圖5。KEGG 選取22 條通路進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖6（封四）。

圖5 核心靶點(diǎn)GO 分析

圖6 KEGG信號(hào)通路氣泡圖

2.6 “藥物-成分-通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

借助Cytoscape 3.7.2 繪制“藥物-成分-通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，對(duì)“2.5”中KEGG通路進(jìn)一步分析，該網(wǎng)絡(luò)有66 個(gè)節(jié)點(diǎn)，118 條邊，方形代表靶點(diǎn)，菱形代表成分，橢圓形代表通路，三角形代表藥物，并根據(jù)度值發(fā)現(xiàn)TP53、EGFR、ESR1（度值分別為12、10、4）為主要核心靶點(diǎn)及其成分、通路。見(jiàn)圖7。

圖7 “藥物-成分-通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

“2.6”中主要核心靶點(diǎn)與其成分對(duì)接結(jié)果所示，槲皮素、木犀草素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮與相應(yīng)靶點(diǎn)都具有較好的親和力，具體見(jiàn)表2，對(duì)接模式見(jiàn)圖8。

圖8 分子對(duì)接模式圖

表2 分子對(duì)接結(jié)合能

3 討論

雞血藤作為常用的活血通絡(luò)藥，亦為“血分圣藥”，具有抗炎、抗氧化等功效；桑寄生具有神經(jīng)保護(hù)、降血糖等作用；DPN 的發(fā)生發(fā)展是氧化應(yīng)激、糖脂類代謝異常、JAK-STAT 信號(hào)通路維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定失調(diào)及雪旺細(xì)胞的病變等綜合作用的結(jié)果[13-17]。

雞血藤、桑寄生主要活性成分為槲皮素、木犀草素、芒柄花黃素；王保江等[18]進(jìn)行大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠改善四氧嘧啶所致的DPN；施建豐等[19]發(fā)現(xiàn)木犀草素可能通過(guò)改變巨噬細(xì)胞的極性從而調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的表達(dá)；木犀草素能夠在各種神經(jīng)退行性變中降低氧化應(yīng)激[20]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲫U釋蛋白互作關(guān)系，并篩選出64 個(gè)核心靶點(diǎn)，結(jié)合GO 分析，其中EGFR 屬于酪氨酸激酶受體，EGFR 二聚自磷酸化后主要引導(dǎo)下游MAPK、JAK-STAT 及PI3K-Akt通路磷酸化，調(diào)控脂多糖引起的炎癥、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激反應(yīng)；PARP1 上調(diào)則細(xì)胞存活，抑制PARP1 則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；ESR1調(diào)控內(nèi)分泌系統(tǒng)、甲狀腺激素的分泌；TP53通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)其活性，通過(guò)調(diào)控下游MAPK、PI3K-Akt、Wnt 等通路參與調(diào)控細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)上游代謝基因表達(dá)、促進(jìn)DNA 修復(fù)基因轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)過(guò)程[21-23]。

KEGG中選取MAPK、JAK-STAT、PI3K-Akt 等22 條信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)木犀草素與槲皮素通過(guò)MAPK信號(hào)通路調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng);木犀草素、槲皮素干預(yù)的PI3K-Akt 信號(hào)通路參與葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)、增殖、凋亡和分化等多種細(xì)胞功能；芒柄花黃素、毛蕊異黃酮通過(guò)內(nèi)分泌抵抗、甲狀腺激素信號(hào)通路調(diào)控糖脂代謝，促進(jìn)新血管生成的生物過(guò)程[24-26]。分析對(duì)接驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)，活性成分與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)均<-5 kcal/mol，研究者認(rèn)為結(jié)合能<-5 kcal/mol 是分子對(duì)接時(shí)受體與配體穩(wěn)定結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)，且結(jié)合能越低分子對(duì)接結(jié)合穩(wěn)定性越高[27]；故活性成分與對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)有較好的對(duì)接活性。

本研究探討雞血藤-桑寄生治療DPN 的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)雞血藤-桑寄生主要通過(guò)EGFR、ESR1、PARP1等64 個(gè)與DPN 相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，改善糖脂類代謝、保護(hù)神經(jīng)元、調(diào)控細(xì)胞凋亡，且分子對(duì)接驗(yàn)證了這一結(jié)果的可靠性，為臨床治療及研發(fā)新的藥物提供思路。