陳紅，謝靜，成鈺瑩，于鑫，陳善平，薛罡，王美琳，羅意，賀向宇

（1東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620；2上海環(huán)境衛(wèi)生工程設(shè)計(jì)院有限公司，上海 200232）

引 言

隨著科技的發(fā)展，新型藥劑與材料的開發(fā)使用極大提高了人民生活水平，但同時(shí)也增加了新型污染物暴露的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。三氯生（TCS），化學(xué)名稱為“5-氯-2-（2，4-二氯苯氧基）苯酚”，由于具有廣譜抗菌性[1]，被作為消毒劑或者防腐劑，廣泛應(yīng)用于臨床和各類消費(fèi)品中。但是，TCS也被證明具有生態(tài)毒性，還會(huì)影響生物體內(nèi)酶的活力，甚至可以直接損害DNA造成基因毒性[2]。納米顆粒（NPs）由于具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，被應(yīng)用于社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和工業(yè)各領(lǐng)域，隨著NPs使用量大幅增長，釋放到環(huán)境中的NPs也隨之增加，并且在環(huán)境中不斷積累[3]。在水生介質(zhì)中，NPs會(huì)生成活性氧（ROS），或溶出金屬離子，從而對(duì)生物造成毒害影響[3]。

脫氮是污水處理過程中的一項(xiàng)重要環(huán)節(jié)，目前污水處理廠仍普遍采用硝化反硝化生物脫氮工藝。其中，將氨氮氧化為硝氮的硝化作用作為脫氮過程的第一步，對(duì)總氮的去除具有重要作用[4]，然而主要負(fù)責(zé)硝化過程的自養(yǎng)型硝化菌容易受到有毒有害物質(zhì)的干擾[4]。由于TCS和NPs在人類生產(chǎn)生活的廣泛使用，伴隨使用過程的物質(zhì)釋放，使其不可避免地進(jìn)入到污水處理系統(tǒng)中[5-6]，從而影響脫氮處理效果。已有研究發(fā)現(xiàn)，在SBR系統(tǒng)中，1 mg·L-1的TCS能夠抑制硝化作用[7]；1 mg·L-1的CuNPs的長期暴露會(huì)大幅降低亞硝化階段的氨氮去除率[6]。此外，由于多種新型污染物可能同時(shí)存在于污水管道系統(tǒng)中并且發(fā)生交互作用[8]，其對(duì)污水生物處理效能的復(fù)合影響有別于單獨(dú)影響，研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mg·L-1的TCS、10 mg·L-1的CuNPs分別導(dǎo)致硝化效率下降8.7%、34%，而其復(fù)合影響使硝化效率下降31.7%[4]。因此，有必要探究如何改善或強(qiáng)化受抑制的生物硝化效果。

零價(jià)鐵具有廉價(jià)、低毒且不產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)，越來越廣泛地應(yīng)用于水污染處理中。添加適量的鐵可以增強(qiáng)酶的活性，提高生物處理效率[9]，可通過投加零價(jià)鐵提高脫氮除磷效率[10]。此外，鐵的還原作用能夠?qū)⒍喾N有毒難降解物質(zhì)，如偶氮類、硝基苯類、氯代物以及高價(jià)金屬陽離子等，轉(zhuǎn)化為低毒性、易降解的物質(zhì)[11]，從而減輕對(duì)微生物的抑制作用。再者，鐵元素是某些硝化酶（如亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR））的活性中心并且鐵屑釋放出來的Fe3+能夠顯著促進(jìn)硝化酶(氨單加氧酶（AMO）、NXR)的活性[12]，基于此，鐵屑可以提高好氧階段的硝化效率[12-13]。因此，當(dāng)生物硝化受到抑制時(shí)，通過零價(jià)鐵強(qiáng)化具有理論可行性。

另一方面，TCS和銅制劑都具有類似抗生素的作用[1,14]。然而在污水生物處理過程中，若污泥微生物長期暴露在含有TCS、CuNPs的環(huán)境中，可能會(huì)導(dǎo)致耐藥細(xì)菌的增加和抗性基因的富集。研究發(fā)現(xiàn)零價(jià)鐵或亞鐵離子可以增強(qiáng)微生物活性，并且改變微生物群落的組成[10,12,15]，而抗性基因的富集主要與微生物種類有關(guān)[16]。因此，鐵的投加可能會(huì)改變抗性基因的富集規(guī)律。

本研究以TCS和廣泛使用的納米銅顆粒（CuNPs）作為目標(biāo)新型污染物，考察投加零價(jià)鐵對(duì)TCS、CuNPs單獨(dú)暴露及復(fù)合暴露下受抑制的硝化作用的強(qiáng)化效果，并通過污染物濃度、硝化關(guān)鍵酶活力、硝化基因豐度和微生物群落結(jié)構(gòu)探究強(qiáng)化機(jī)理。此外，以TCS耐藥性mexB基因，CuNPs抗性基因copA為研究對(duì)象，考察零價(jià)鐵投加后對(duì)抗性基因富集規(guī)律的影響。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與器材

納米銅（CuNPs），分析純，購于阿法埃莎（中國）化學(xué)有限公司；三氯生（TCS），分析純，購于Dr.Ehrenstorfer公司。

磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司84-1A；高效液相色譜儀：Thermo公司U3000；電感耦合等離子光譜發(fā)生儀：Agilent公司720ES；冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司LGJ-10E；固相萃取小柱：Supelco公司ENVI-18；氮吹儀：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司HSC-12A。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

活性污泥來源于上海松江污水廠的二沉池回流污泥，取回的新鮮污泥靜置24 h，排出上清液，濃縮污泥與實(shí)驗(yàn)配水混合，使泥水混合液的MLSS=2500~3000 mg·L-1。配水組成參考文獻(xiàn)[4]，使配水中的COD、NH4+-N和溶解性正磷酸鹽（SOP）的濃度分別為350 mg·L-1、30 mg·L-1和2 mg·L-1，控制配水pH在7.5左右。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)兩組反應(yīng)器，反應(yīng)器設(shè)置及運(yùn)行參數(shù)參考文獻(xiàn)[4]，第一組反應(yīng)器為不添加零價(jià)鐵的Sludge組，包含4個(gè)反應(yīng)器，分別是只加入活性污泥和實(shí)驗(yàn)配水的Control組，在空白對(duì)照的基礎(chǔ)上添加0.5 mg·L-1TCS的TCS組，另 添 加 了10 mg·L-1CuNPs的CuNPs組，以及同時(shí)添加了0.5 mg·L-1TCS和10 mg·L-1CuNPs的TCS+CuNPs組。第二組反應(yīng)器在第一組的基礎(chǔ)上添加30 g·L-1的零價(jià)鐵，其他的反應(yīng)條件均保持一致，并記為Sludge-Fe組，亦包括4個(gè)反應(yīng)器，分別記為Control+Fe組、TCS+Fe組、CuNPs+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組。本實(shí)驗(yàn)中使用的零價(jià)鐵為鐵刨花。

新鮮污泥經(jīng)馴化脫氮效率穩(wěn)定在90%以上，再進(jìn)行后續(xù)污染物暴露及零價(jià)鐵強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)。

1.3 TCS的測(cè)定

泥相中TCS測(cè)定需要將污泥先冷凍干燥，研磨過篩，然后稱取0.1 g污泥于20 ml乙酸乙酯中進(jìn)行超聲萃取，超聲參數(shù)為：功率100%，水溫50℃，時(shí)間20 min。超聲完畢后，在8000 r·min-1下離心5 min，取上層有機(jī)溶液，剩下的混合液繼續(xù)超聲，如此重復(fù)3次。收集到的有機(jī)溶液經(jīng)氮吹至5 ml左右，用蒸餾水定容至100 ml，并調(diào)節(jié)pH在2~3，經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后，利用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行測(cè)量，色譜條件參考文獻(xiàn)[7]。測(cè)量水相中的TCS時(shí)，先利用固相萃取裝置對(duì)水樣進(jìn)行富集，水樣以5 ml·min-1的流速緩慢流經(jīng)小柱，用6 ml的5%的甲醇水溶液（5∶95，體積比）淋洗，真空干燥20 min，最后用3 ml乙酸乙酯洗脫3次。收集洗脫液于玻璃容器中，氮吹近干后，用乙腈定容至1 ml。經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后，利用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行測(cè)量。

1.4 酶活力的測(cè)定

取50 ml泥水混合液，在4℃條件下，5000 r·min-1離心5 min后去掉上清液，用磷酸緩沖溶液（0.1 mol·L-1PBS，pH=7.4）清洗污泥，再離心去除上清液，重復(fù)清洗3次。將清洗完的污泥重懸于30 ml的磷酸緩沖溶液中，在冰水浴的條件下超聲破碎（20 kHz，5 min），然后在4℃條件下，12000 r·min-1離心15 min，上清液為粗酶提取液。

氨單加氧酶（AMO酶)的測(cè)定方法：在0.1 ml的粗酶提取液中，加入1.9 ml含2 mmol·L-1(NH4)2SO4的0.01 mol·L-1PBS，30℃振 蕩30 min，然 后 測(cè) 量-N的濃度。

亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR酶）的測(cè)定方法：在0.1 ml的粗酶提取液中，加入1.9 ml含1 mmol·L-1NaNO2的0.01 mol·L-1PBS，30℃振蕩30 min，然后測(cè)量-N的濃度。測(cè)定中需設(shè)置空白對(duì)照，即用蒸餾水代替粗酶，其他操作相同，然后測(cè)量-N的濃度。最后，空白中的-N濃度減去樣品中的-N濃度，即為酶催化過程中消耗的-N濃度。

測(cè)定粗酶提取液中的蛋白質(zhì)濃度，測(cè)定方法采用福林-酚試劑法[17]。AMO酶及NXR酶活力的計(jì)算公式為，其中，為反應(yīng)體系中-N的物質(zhì)的量的變化,μmol,測(cè)定AMO酶時(shí)為-N的增加量，測(cè)定NXR酶為NO-2-N的下降量；t為反應(yīng)時(shí)間，min；mp為反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，mg。

1.5 其他指標(biāo)的測(cè)定

2 結(jié)果與討論

2.1 鐵促進(jìn)污泥硝化作用

圖1(a)表示一個(gè)反應(yīng)周期內(nèi)的氨氮濃度隨時(shí)間的變化情況?？瞻捉M的硝化速率在前2 h內(nèi)最大，然后緩慢降低，最后在6~10 h內(nèi)氨氮濃度趨于穩(wěn)定，并且最終的硝化效率達(dá)到96.4%。相比于空白組，TCS組、CuNPs組以及復(fù)合組的硝化作用均受到不同程度的抑制。TCS組、CuNPs組以及復(fù)合組在2 h時(shí)的硝化效率相近，均在35%左右，且明顯低于空白組的，但是，2~10 h內(nèi)，CuNPs組的硝化效率明顯高于TCS組和復(fù)合組，而后兩組的硝化效率近乎一致。一個(gè)周期反應(yīng)結(jié)束后，TCS組、CuNPs組以及復(fù)合組的硝化效率分別為75.2%、85.6%和74.9%，明顯低于空白組的96.4%。

有文獻(xiàn)報(bào)道，零價(jià)鐵能夠促進(jìn)生物脫氮作用[10-11]，所以在以上4組反應(yīng)的基礎(chǔ)上引入零價(jià)鐵，在TCS、CuNPs單獨(dú)作用及復(fù)合作用的短期暴露下，研究零價(jià)鐵對(duì)污泥硝化作用的影響。在圖1(a)中，加鐵組均用虛線表示。在引入零價(jià)鐵之后，4組反應(yīng)器中的硝化效率表現(xiàn)為：Control+Fe組>CuNPs+Fe組>TCS+CuNPs+Fe組>TCS+Fe組，這表明，即便有零價(jià)鐵的加入，TCS、CuNPs以及二者的復(fù)合還是會(huì)抑制污泥的硝化作用，且抑制程度與之前相似。但是，零價(jià)鐵的加入會(huì)改善污泥的硝化作用，10 h時(shí)，Control+Fe組、TCS+Fe組、CuNPs+Fe組 和TCS+CuNPs+Fe組的硝化效率分別為96.9%、78.8%、88.9%和81.6%，與未加入零價(jià)鐵時(shí)相比，系統(tǒng)中的硝化效率分別提高了0.5%、3.6%、3.3%和6.7%。因此，在TCS、CuNPs短期暴露的條件下，加入零價(jià)鐵能夠小幅度地改善污泥的硝化效果，并且對(duì)于TCS+CuNPs組的改善程度最高。

圖1 污染物短期暴露時(shí)(a)、長期暴露時(shí)(b)的氨氮濃度以及長期暴露時(shí)硝態(tài)氮濃度(c)隨時(shí)間的變化（長期暴露中無鐵投加組的數(shù)據(jù)引自文獻(xiàn)[4]）Fig.1 The change of ammonia nitrogen concentration with time when short-term exposure(a)and long-term exposure(b)to pollutants and changes of nitrate nitrogen concentration with time under long-term exposure of pollutants(c)(The data in Fig.(b)when long-term exposure without adding iron were quoted from Ref.[4])

短期暴露條件下引入零價(jià)鐵，可以輕微改善污泥的硝化效果，然而在污染物的長期暴露下，引入零價(jià)鐵會(huì)對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)生怎樣的影響？因此，在連續(xù)運(yùn)行的反應(yīng)器中，從第1天起每隔3天取樣，測(cè)定反應(yīng)結(jié)束時(shí)的出水氨氮濃度，結(jié)果如圖1(b)所示。根據(jù)成鈺瑩等[4]的研究可知，在TCS、CuNPs的長期暴露過程中，初期會(huì)對(duì)活性污泥的硝化效果產(chǎn)生不同程度的抑制作用，但隨著時(shí)間的推遲，抑制作用會(huì)緩慢減弱，同時(shí)系統(tǒng)的硝化作用會(huì)逐漸恢復(fù)至正常。

在投加了零價(jià)鐵的4組反應(yīng)器中，TCS、CuNPs對(duì)污泥硝化作用的抑制依然存在，但是，在反應(yīng)器運(yùn)行的初期，零價(jià)鐵的投加減輕了目標(biāo)污染物的抑制作用，例如，在第4天，TCS+Fe組、CuNPs+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組的硝化效率分別達(dá)到99.8%、76.8%和85.6%，相比于未投加零價(jià)鐵時(shí)的95.8%、73.9%和81.1%，三組的硝化效果均有一定程度的改善；此外，污染物長期暴露下，投加零價(jià)鐵可在更短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)硝化效果，如TCS組的硝化效率需在反應(yīng)第13天時(shí)方可達(dá)到Control組的硝化效果，而TCS+Fe組在第4天即可恢復(fù)硝化效能至空白反應(yīng)器水平。因此，在污染物長期暴露下，投加零價(jià)鐵有利于硝化效率的提高與恢復(fù)。

2.2 零價(jià)鐵對(duì)污染物濃度的影響

經(jīng)長期運(yùn)行，系統(tǒng)穩(wěn)定之后，在投加零價(jià)鐵和不加零價(jià)鐵的兩種情況下，分別測(cè)定CuNPs組和復(fù)合組中的Cu2+的賦存情況，結(jié)果如圖2(a)所示。相比于泥相中的銅離子含量，水相中的含量可以忽略不計(jì)，說明進(jìn)入系統(tǒng)中的銅離子被污泥吸附并在泥相中累積。在不含零價(jià)鐵的CuNPs組和TCS+CuNPs組分別測(cè)定出115.5 mg·L-1和106.5 mg·L-1的銅離子，當(dāng)投加零價(jià)鐵之后，CuNPs+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組 的 銅 離 子 含 量 分 別 為80.6 mg·L-1和69.8 mg·L-1，分別減少了34.9 mg·L-1和36.7 mg·L-1的銅離子。這可能是由于零價(jià)鐵的強(qiáng)還原性導(dǎo)致CuNPs溶出的銅離子與零價(jià)鐵發(fā)生了置換反應(yīng)[11]：，降低了系統(tǒng)中的銅離子濃度，削減了CuNPs的毒性，同時(shí)該反應(yīng)還可促進(jìn)零價(jià)鐵向亞鐵離子和鐵離子的轉(zhuǎn)化，有利于改善污泥性能，從而提高污泥的硝化能力。此外，無論是否加入零價(jià)鐵，TCS的存在使系統(tǒng)中的銅離子含量略有降低。

圖2 Cu2+(a)、TCS(b)在泥相和水相中濃度Fig.2 Concentrations of Cu2+(a)and TCS(b)in sludge and liquid phases

在研究銅離子賦存情況的同時(shí)，也研究了TCS在系統(tǒng)中的含量以及分布情況。經(jīng)長期運(yùn)行后，各反應(yīng)器中泥相和水相中TCS的含量如圖2(b)所示。在長期運(yùn)行過程中，部分TCS無法被降解，會(huì)在系統(tǒng)中積累。在投加零價(jià)鐵之后，TCS+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組 中的TCS濃度 分別為147.4μg·L-1和166.4μg·L-1，相比于未投加零價(jià)鐵的TCS組（151.2 μg·L-1）和TCS+CuNPs組（189.8μg·L-1），分別減少了3.8μg·L-1和23.4μg·L-1，說明零價(jià)鐵的引入可以提高TCS的降解率，削弱毒性，進(jìn)而改善污泥的硝化作用。系統(tǒng)中TCS在泥相中的含量是107.5~119.2 μg·L-1，在水相中的含量是39.9~72.8μg·L-1，泥相中的TCS含量遠(yuǎn)高于水相。與TCS組相比，TCS+CuNPs組中的TCS濃度明顯增多，在泥相和水相中分別增加了5.8%和79.2%，說明CuNPs的存在會(huì)降低微生物對(duì)TCS的降解能力，促進(jìn)TCS的富集，并且大幅提高TCS在水相中的含量。與TCS+CuNPs組相比，TCS+CuNPs+Fe組中TCS濃度明顯下降，此外，水相中的TCS濃度下降了34.0%，而泥相中無顯著差別，表明零價(jià)鐵能夠在促進(jìn)TCS降解的同時(shí)，削弱CuNPs的影響，明顯降低TCS在水相中的含量。

2.3 反應(yīng)器中鐵的存在形態(tài)

為了分析污泥中鐵的形態(tài)，從Control組和Control+Fe組的反應(yīng)器中取出活性污泥進(jìn)行XPS檢測(cè)，結(jié)果如圖3(a)、(b)所示。相比于空白組，加入零價(jià)鐵的反應(yīng)器中出現(xiàn)了FePO4的峰(712.8 eV)，此外，F(xiàn)e2O3(710.8 eV)和Fe(OH)O(711.8 eV)的射線強(qiáng)度也顯著增加，這表明零價(jià)鐵的引入增加了Fe3+的含量。在反應(yīng)器內(nèi)加入鐵刨花會(huì)產(chǎn)生生物腐蝕，并且處在曝氣狀態(tài)下，因此會(huì)不斷產(chǎn)生Fe3+，并最終沉積于污泥中。

進(jìn)一步測(cè)量Sludge-Fe組四個(gè)反應(yīng)器中Fe3+濃度，結(jié)果如圖3(c)所示。由圖可知，Control+Fe組、TCS+Fe組、CuNPs+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組中Fe3+濃度都很高，分別為207.0、185.6、346.4和297.1 mg·L-1。水相中Fe3+濃度極低，所有的Fe3+幾乎全部沉積在污泥中。此外，含有CuNPs的兩組反應(yīng)器中含有更高的Fe3+濃度，可能是由于Cu2+的置換，這與2.2節(jié)中的分析一致。

圖3 Control組(a)和Control+Fe組(b)活性污泥中Fe的XPS譜圖以及Sludge-Fe組四個(gè)反應(yīng)器中Fe3+濃度(c)Fig.3 XPS spectra of Fe in activated sludge in the Control group(a)and Control+Fe group(b)and the Fe3+concentration in the four reactors in the Sludge-Fe group(c)

2.4 鐵對(duì)關(guān)鍵酶活性的影響

在之前的研究中證實(shí)了零價(jià)鐵對(duì)含氮化合物的影響不是直接通過物化反應(yīng)，而是通過影響微生物從而間接影響氮素的轉(zhuǎn)化[12]。因此，接下來研究零價(jià)鐵對(duì)微生物活性與結(jié)構(gòu)的影響。氨單加氧酶（AMO酶)是在氨氧化過程中，將有機(jī)氮或者氨氮氧化成羥胺（NH2OH）的關(guān)鍵酶。在羥胺被氧化成亞硝酸鹽之后，硝化菌利用亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR酶）將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，完成硝化過程。硝化酶的活力是表征硝化能力強(qiáng)弱的一種指標(biāo)，通過測(cè)定AMO酶和NXR酶的酶活性來解釋TCS、CuNPs對(duì)污泥硝化作用的影響。

圖4(a)表示所有反應(yīng)器中AMO酶的酶活性，Sludge組代表未添加零價(jià)鐵的反應(yīng)器，而Sludge-Fe組代表投加了零價(jià)鐵的反應(yīng)器。以未添加零價(jià)鐵的Control組的酶活力為100%，則TCS組、CuNPs組和TCS+CuNPs組的酶活力分別為44.7%、11.7%和39.2%，Sludge組的酶活性強(qiáng)弱表現(xiàn)為Control組>TCS組>TCS+CuNPs組>CuNPs組。在引入零價(jià)鐵之后，4組反應(yīng)器中AMO酶的酶活性均有明顯提高，Control組、TCS組、CuNPs組和TCS+CuNPs組的酶活性分別是未添加零價(jià)鐵系統(tǒng)的1.3倍、1.5倍、2.8倍和1.4倍。

圖4 各反應(yīng)器中AMO酶活力(a)，NXR酶活力(b)和amoA基因豐度(c)Fig.4 AMO enzyme activity(a),NXR enzyme activity(b)and amoA gene abundance(c)in each reactor

圖4(b)表示各反應(yīng)器中NXR酶的酶活性。NXR酶的酶活性規(guī)律與AMO酶相似。在Sludge組的酶活性強(qiáng)弱也表現(xiàn)為Control組>TCS組>TCS+CuNPs組>CuNPs組。零價(jià)鐵的添加同樣提高了NXR酶的酶活性，Control組、TCS組、CuNPs組和TCS+CuNPs組的酶活性分別是未添加零價(jià)鐵系統(tǒng)的1.1倍、1.2倍、1.2倍和1.2倍。

相比于NXR酶，AMO酶的酶活力提高程度更顯著，因此進(jìn)一步對(duì)AMO酶的關(guān)鍵基因豐度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4(c)所示。本研究中使用2-ΔΔCt值來表達(dá)基因豐度，非絕對(duì)量。在未添加零價(jià)鐵的Control組、TCS組、CuNPs組和TCS+CuNPs組中含有的基因豐度分別為1.00、0.35、0.01和0.06，表明在TCS及CuNPs的暴露下，amoA基因的豐度明顯下降，且豐度大小表現(xiàn)為Control組>TCS組>TCS+CuNPs組>CuNPs組。在加入了零價(jià)鐵的系統(tǒng)中，Control組、TCS組、CuNPs組 和TCS+CuNPs組 的amoA基因的豐度分別是1.17、0.40、0.05和0.10，與未添加零價(jià)鐵的系統(tǒng)相比較，引入零價(jià)鐵可以提高硝化功能基因amoA的豐度，進(jìn)而提高污泥的硝化能力。

綜上可知，在投加零價(jià)鐵之后，AMO酶和NXR酶這兩種硝化關(guān)鍵酶的酶活性均顯著提高，且AMO酶關(guān)鍵基因的表達(dá)豐度在投加零價(jià)鐵后提高，從而改善了污泥的硝化能力。

2.5 鐵對(duì)抗性基因的影響

TCS作為一種廣譜殺菌劑被廣泛利用，其對(duì)細(xì)菌的暴露可能導(dǎo)致對(duì)TCS的抗藥性。本文選擇了涉及TCS耐藥性的mexB基因進(jìn)行研究，圖5(a)表示各反應(yīng)器中mexB基因的豐度變化（使用2-ΔΔCt值來表達(dá)基因豐度，非絕對(duì)量）。在未添加零價(jià)鐵的Sludge組中，TCS組和TCS+CuNPs組中的mexB基因的豐度均大于Control組，這說明TCS的暴露增加了mexB基因的豐度，另外，TCS+CuNPs組中的mexB基因的豐度大于TCS組，這可能是由于CuNPs的存在給細(xì)菌帶來了選擇性壓力并且促進(jìn)了mexB基因的傳播[18]。引入零價(jià)鐵之后，Control組和TCS+CuNPs組的mexB基因的豐度增大，而TCS組的基因豐度卻明顯下降，這可能與mexB基因的宿主細(xì)菌的豐度變化有關(guān)。

過量的銅會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害，細(xì)菌為維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)進(jìn)化形成了抗銅機(jī)制，其中copA基因便是一種典型的銅抗性基因[14]。圖5(b)表示各反應(yīng)器中copA基因的豐度變化（使用2-ΔΔCt值來表達(dá)基因豐度，非絕對(duì)量）。在未添加零價(jià)鐵的Sludge組中，Control組、CuNPs組和TCS+CuNPs組中copA基因的豐度分別為1、1.04和1.03，沒有產(chǎn)生明顯差別。但是，在投加了零價(jià)鐵的系統(tǒng)中，除了Control組，CuNPs組和TCS+CuNPs組的copA基因的豐度均顯著提高，分別為1.34和1.77，這可能是由于置換反應(yīng)促進(jìn)了更多鐵離子的生成，使得系統(tǒng)中微生物胞外電子傳遞活動(dòng)更加頻繁[10]，從而促進(jìn)了基因的水平轉(zhuǎn)移。

圖5 各反應(yīng)器中相關(guān)抗性基因的豐度Fig.5 Abundance of related resistance genes in each reactor

綜上所述，TCS和CuNPs這兩種污染物同時(shí)存在時(shí)會(huì)提高相關(guān)抗性基因的豐度，而在此基礎(chǔ)上引入零價(jià)鐵會(huì)進(jìn)一步提升基因豐度，增加抗性基因的潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

2.6 零價(jià)鐵對(duì)微生物結(jié)構(gòu)的影響

2.6.1 零價(jià)鐵對(duì)門水平微生物結(jié)構(gòu)的影響 污泥硝化作用的核心理論是不同功能的菌種逐步完成相關(guān)反應(yīng)使得水中的氨氮得以去除，所以微生物的群落結(jié)構(gòu)對(duì)污泥的硝化功能起著決定性作用。圖6表示在門水平上，各反應(yīng)器的群落結(jié)構(gòu)組成。在未添加零價(jià)鐵的Sludge組[圖6(a)]中，Control組中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的是Proteobacteria，在很多污水處理工藝中，Proteobacteria都占主導(dǎo)地位[18]，它們可以負(fù)責(zé)氨氮的去除和亞硝態(tài)氮的積累[18]，還包含了很多好氧反硝化菌。除了Proteobacteria，另外三種優(yōu)勢(shì)菌是Planctomycetes、Bacteroidetes和Nitrospirae，分 別 占有12.6%、9.8%和3.7%。Bacteroidetes能夠進(jìn)行反硝化作用[19]，而Nitrospirae具有將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽的功能[18]，因此，Control組中具有優(yōu)良的氨氮去除能力。TCS組與Control組沒有較大的差異。在CuNPs組中，除了Proteobacteria和Bacteroidetes，優(yōu)勢(shì)菌群還有Gemmatimonadetes，豐度分別為53.5%、13.7%和19.2%。在TCS+CuNPs組中，優(yōu)勢(shì)菌依次為Proteobacteria、Bacteroidetes和Gemmatimonadetes，分別占有86.6%、7%和5.9%。由于Planctomycetes和Nitrospirae豐度的明顯減少，所以CuNPs組和TCS+CuNPs組中的硝化效果不夠理想。

相較于Sludge組，在添加了零價(jià)鐵的Sludge-Fe組[圖6(b)]中，多出了Actinobacteria和Acidobacteria兩種優(yōu)勢(shì)菌門。Acidobacteria被證明在鐵的氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，且被檢測(cè)到在富含鐵礦的環(huán)境中占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)[20]；Actinobacteria能夠產(chǎn)生鐵載體，促進(jìn)微生物對(duì)鐵的吸收[21]，因此零價(jià)鐵的加入引起這兩種菌門的微生物豐度大幅增加。此外，鐵刨花中含有零價(jià)鐵、碳以及其他金屬，可以在廢水中形成微尺度原電池，因此會(huì)促進(jìn)電化學(xué)活性微生物（如Proteobacteria、Actinobacteria和Acidobacteria）的電子傳遞。和Sludge組相比，零價(jià)鐵的引入增加了Control組和TCS組中Nitrospirae的相對(duì)豐度，也明顯增加了Sludge-Fe組中Bacteroidetes的占比，特別 在CuNPs組和TCS+CuNPs組 中，Bacteroidetes的占比由原先的13.7%、7%分別增長到22.6%、20.7%，這說明了零價(jià)鐵的添加不僅可促進(jìn)硝化作用，還可能促進(jìn)反硝化作用，具有脫氮功能，與Chen等[12,15]研究結(jié)果一致。

圖6 Sludge組(a)和Sludge-Fe組(b)微生物群落結(jié)構(gòu)的差異（門水平）Fig.6 Differences in microbial community structure between Sludge group(a)and Sludge-Fe group(b)(phylum level)

微生物種群結(jié)構(gòu)除了影響生物脫氮，還與系統(tǒng)中抗性基因的富集有關(guān)。研究表明，Proteobacteria是TCS抗性基因mexB的微生物載體[22]，在未添加零價(jià)鐵的Sludge組中，Proteobacteria的相對(duì)豐度表現(xiàn)為TCS+CuNPs組（86.6%）>TCS組（66.4%）>Control組（63.7%），這與mexB基因的豐度變化規(guī)律一致。在加入零價(jià)鐵后，各組中Proteobacteria的相對(duì)豐度均有明顯下降，宿主細(xì)菌豐度的下降導(dǎo)致了TCS+Fe組中mexB基因豐度明顯小于TCS組。然而，在潛在宿主細(xì)菌豐度下降時(shí)，TCS+CuNPs+Fe組和Control+Fe組中mexB基因豐度明顯增加，這可能是由于Proteobacteria中mexB某些宿主微生物豐度增加導(dǎo)致。

在圖6的幾種優(yōu)勢(shì)菌門中，銅抗性基因copA的微生物宿主主要有Proteobacteria和Actinobacteria[23-24]。在未添加零價(jià)鐵的系統(tǒng)中，Proteobacteria的相對(duì)豐度表現(xiàn)為TCS+CuNPs組（86.6%）>Control組（63.7%）>CuNPs組（53.5%），然而copA基因豐度在三組中沒有明顯差別，表明Proteobacteria中涉及豐富的菌屬，不能對(duì)copA基因豐度起決定性作用。添加零價(jià)鐵之后，Control+Fe組中Proteobacteria的相對(duì)豐度明顯降低，從63.7%減小到58%，但是零價(jià)鐵的引入增加了新的優(yōu)勢(shì)菌門——Actinobacteria，Proteobacteria的 降 低 與Actinobacteria的增加，最終導(dǎo)致Control組中copA基因豐度的改變不顯著。在CuNPs組中，零價(jià)鐵的添加使得Proteobacteria的相對(duì)豐度明顯提高，同時(shí)還引入了新的copA基因宿主Actinobacteria，copA基因豐度因此明顯提高。在復(fù)合組中，零價(jià)鐵使得copA基因豐度顯著提升，但是copA基因宿主Proteobacteria的占比從86.6%減小到76.8%，這可能是由于零價(jià)鐵促進(jìn)了copA基因的水平傳播[25]。綜上，宿主細(xì)菌的豐度能夠在一定程度上引起兩種抗性基因豐度的變化。

2.6.2 零價(jià)鐵對(duì)屬水平微生物結(jié)構(gòu)的影響 圖7(a)表示在不添加零價(jià)鐵時(shí)，各反應(yīng)器微生物群落在屬水平上的差異。TCS組的群落結(jié)構(gòu)與Control組相差不大，在Control組和TCS組中占比最大的是UnclassifiedMethylophilaceae，分 別 占 有28.1%和28.6%，然 而 在CuNPs組 和TCS+CuNPs組 中，UnclassifiedMethylophilaceae的占比減少至2.9%和2.3%。據(jù)報(bào)道，Methylophilaceae具有反硝化功能[26]。在Control組中，Rhodobacter的占比近乎為0，然而在CuNPs組和TCS+CuNPs組中，Rhodobacter的占比最大，分別為24.3%和29.1%，Rhodobacter也是一種反硝 化 菌[27]。CuNPs的 存 在 促 進(jìn) 了Gemmatimonas，Methylotenera和Dechloromonas的增長，這三種菌屬都具有反硝化功能[27]。

圖7 Sludge組(a)和Sludge-Fe組(b)微生物群落結(jié)構(gòu)的差異（屬水平）Fig.7 Differences in microbial community structure between Sludge group(a)and Sludge-Fe group(b)(genus level)

Nitrospira是一種硝化細(xì)菌屬，甚至具有完全硝化的能力[28]，在Control組、TCS組、CuNPs組和TCS+CuNPs組中的相對(duì)豐度分別為3.7%、2.3%、0.6%和0.2%，TCS、CuNPs的暴露減少了硝化菌的相對(duì)豐度，導(dǎo)致污泥硝化能力被抑制。

圖7(b)表示投加了零價(jià)鐵之后，各反應(yīng)器中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。在TCS+CuNPs+Fe組中，由于零價(jià)鐵的添加，占比最大的菌屬從Rhodobacter變成了UnclassifiedMethylophilaceae，而其他三組的最大優(yōu)勢(shì)菌屬?zèng)]有改變。零價(jià)鐵的引入明顯增加了Nitrospira在Control+Fe組和TCS+Fe組中的相對(duì)豐度，然而在CuNPs+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組中未發(fā)現(xiàn)Nitrospira的明顯增長。在零價(jià)鐵的引入后，系統(tǒng)中出現(xiàn)了兩種新的優(yōu)勢(shì)菌屬——Lacibacter和Flavobacterium，F(xiàn)lavobacterium屬 于 反 硝 化 菌[5]，Lacibacter屬于Chitinophagaceae，此菌科為異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌[29]。此外，零價(jià)鐵的引入還帶了Dechloromonas的增長，尤其是在單獨(dú)加入CuNPs組中，由原來的7.3%變成了20.2%，Dechloromonas可以利用硝酸鹽作為電子供體實(shí)現(xiàn)Fe（Ⅱ）的氧化[30]。而對(duì)于Methylotenera，零價(jià)鐵的引入促進(jìn)了其在Control+Fe組、TCS+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組中 的增長。零價(jià)鐵的引入能夠促進(jìn)Nitrospira和Lacibacter等硝化細(xì)菌的增長，改善污泥的硝化性能。此外，零價(jià)鐵還提高了Flavobacterium，Dechloromonas和Methylotenera等反硝化細(xì)菌的豐度，提高了污泥的反硝化能力。

除了影響脫氮性能，微生物群落的演替也會(huì)改變抗性基因的豐度，因此進(jìn)一步探究本系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)微生物與抗性基因的關(guān)系。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Rhodobacter細(xì)菌是copA基因的宿主[31]。未添加零價(jià)鐵時(shí)，在Control組、CuNPs組和TCS+CuNPs組中，Rhodobacter分別占比0%、24.3%和29.1%，Control組中Rhodobacter的相對(duì)豐度遠(yuǎn)小于其他兩組中，但是三組中copA基因的豐度卻沒有明顯差別。在系統(tǒng)中引入零價(jià)鐵之后，Rhodobacter在Control+Fe組和CuNPs+Fe組中的占比均略有提高，然而，在TCS+CuNPs+Fe組中占比明顯減少，從29.1%減少到13.3%。除了空白組之外，零價(jià)鐵的添加導(dǎo)致了另外兩組中copA基因豐度的提升，特別是復(fù)合組中，從1.03增加到1.77。綜上的現(xiàn)象表明Rhodobacter的相對(duì)豐度和copA基因豐度并沒有高度相關(guān)性，這可能表明系統(tǒng)中存在著其他copA基因的宿主細(xì)菌；此外，對(duì)于mexB基因，還沒有相關(guān)文獻(xiàn)證明在圖7的優(yōu)勢(shì)屬中屬于mexB基因的宿主細(xì)菌，因此，可能存在其他mexB宿主細(xì)菌，這有待進(jìn)一步的深入研究。

3 結(jié) 論

（1）在TCS、CuNPs的短期及長期暴露下，零價(jià)鐵能夠一定程度上減輕TCS和CuNPs對(duì)污泥硝化的抑制作用。

（2）反應(yīng)器經(jīng)長期運(yùn)行后，銅離子及未被降解的TCS主要被污泥吸附并在泥相中積累，零價(jià)鐵的引入能夠明顯降低銅離子的累積，并促進(jìn)TCS的降解，從而降低對(duì)微生物的毒害作用。

（3）零價(jià)鐵可以提高兩種關(guān)鍵硝化酶——AMO酶和NXR酶的活性，并且可以提高硝化功能基因amoA的豐度，從而提高污泥的硝化能力。

（4）相比于單獨(dú)存在，TCS和CuNPs同時(shí)存在時(shí)會(huì)提高mexB基因和copA基因豐度，而零價(jià)鐵的引入也會(huì)提高相應(yīng)抗性基因的豐度。

（5）各反應(yīng)器中的優(yōu)勢(shì)菌門為Proteobacteria，優(yōu)勢(shì)菌屬為UnclassifiedMethylophilaceae和Rhodobacter。零價(jià)鐵的引入促進(jìn)了Control+Fe組和TCS+Fe組中硝化菌的增長，也明顯促進(jìn)了多種反硝化菌豐度的增加。

（6）作為宿主細(xì)菌，Proteobacteria的占比會(huì)影響mexB基因豐度，Proteobacteria和Actinobacteria的占比會(huì)影響copA基因豐度。