黃力營,林清群,凌雪君,李發(fā)來,王木蘭

賀州市人民醫(yī)院 1病理科,2腺體外科,3科教科(廣西賀州 542800)

甲狀腺乳頭狀微小癌(papillary thyroid micro carcinoma，PTMC)定義為10 mm以下的甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)。目前的研究證實甲狀腺良性疾病可能增加患甲狀腺癌的風(fēng)險，尤其是在甲狀腺功能亢進或減退、甲狀腺腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和甲狀腺炎[1]。鑒于在上述甲狀腺良性病變中常常觀察到伴有PTC樣細(xì)胞核改變和(或)伴有乳頭狀結(jié)構(gòu)形成的非典型濾泡上皮增生(atypical follicular epithelial proliferation，AFEP)改變[1-2]，且在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和橋本甲狀腺炎(hashimotos thyroiditis，HT)中的AFEP顯示出具有腫瘤性質(zhì)的單克隆性增生[2-3]，這意味著形態(tài)學(xué)上有時很難區(qū)分出非典型增生和惡性病變。在日常甲狀腺病變診斷工作中，我們經(jīng)常見到PTMC與濾泡上皮非典型增生的診斷和鑒別診斷，一個是惡性，一個是惡性潛能，治療上有很大差異。因此我們采用免疫組化技術(shù)聯(lián)合檢測PTMC和良性甲狀腺病變局灶伴非典型濾泡上皮增生病變中CD56、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、細(xì)胞角蛋白19(Cytokeratin 19，CK19)和人骨髓內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物(HBME-1)蛋白的表達，探討它們在PTMC與甲狀腺良性病變伴非典型濾泡上皮增生診斷和鑒別診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取賀州市人民醫(yī)院病理科2016年4月至2019年2月期間收到手術(shù)切除甲狀腺病變標(biāo)本經(jīng)確診的PTMC材料共45例(其中34例合并結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，5例合并甲狀腺腺瘤，6例合并橋本甲狀腺炎)，腫瘤最大徑0.5～9 mm，平均(2.89±2.461)mm。45例中40例為常規(guī)送檢標(biāo)本，5例為術(shù)中冰凍切片送檢標(biāo)本。男8例，女37例，年齡22～67歲，平均(48.24±11.70)歲。取同期手術(shù)切除診斷甲狀腺良性病變伴局灶非典型濾泡上皮增生病例共30例(其中伴發(fā)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫25例，甲狀腺腺瘤3例，橋本甲狀腺炎 2 例)，男5例，女25例，年齡19～65歲，平均(45.27±13.76)歲。PTMC組與非典型濾泡上皮增生組之間患者年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 免疫組化試劑和方法 標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋，切片厚5 μm，行HE染色和免疫組化染色。免疫組化采用EnVision法，一抗CD56(MX039)、Galectin-3(9c4)、CK19(A53-B/A2.26)、HBME-1和EnVision(Kit-9922)檢測試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，實驗操作嚴(yán)格按說明書進行。用已知甲狀腺乳頭狀癌Galectin-3、CK19和HBME-1陽性和小細(xì)胞肺癌CD56陽性切片作陽性對照，以PBS液取代一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 以下染色模式被認(rèn)為是陽性的：CD56以細(xì)胞膜的染色、Galectin-3細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核、CK19和HBME-1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染色，結(jié)果判讀采用人工計數(shù)方法進行陽性細(xì)胞百分比和染色強度的計分。陽性細(xì)胞百分比按視野內(nèi)陽性細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)的比例計分：無著色細(xì)胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分、51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度按陽性細(xì)胞著色特征記分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色強度與著色細(xì)胞比例兩組分值相加，0分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，兩組間染色強度表達差異比較采用Mann-WhitneyU檢驗，率等計數(shù)資料的組間比較采用2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD56在PTMC與良性甲狀腺病變局灶上皮非典型增生中的表達 CD56表達細(xì)胞膜，在PTMC中的陽性表達率為6.6%(3/45)，其表達強度3例均為弱陽性，無中至強陽性表達模式，而PTMC旁周圍良性病變甲狀腺濾泡上皮中常呈中度而完整的細(xì)胞膜表達(圖1)；在良性甲狀腺病變伴濾泡上皮非典型增生病變中的陽性率高達100.0%(30/30)，其中中等陽性表達為23例，強陽性表達5例，無陰性表達病例(表1)。濾泡上皮非典型增生組中CD56的陽性表達率和染色強度均顯著高于PTMC組(P<0.001)。見表1。

2.2 Galectin-3、CK19和HBME在PTMC與良性甲狀腺病變伴微小上皮非典型增生中表達 Galectin-3、CK19主要在細(xì)胞質(zhì)中表達，Galectin-3伴有核表達。HBME-1主要表達在細(xì)胞膜，包括細(xì)胞腺腔面、乳頭或側(cè)膜部位的細(xì)胞膜表面，伴或不伴有胞質(zhì)著色(圖1)。免疫組化結(jié)果顯示，Galectin-3、CK19和HBME-1蛋白在PTMC中的陽性表達率分別為100.0%(45/45)、100.0%(45/45)和88.8%(40/45)，陽性表達模式均以中至強陽性表達為主，其中中至強陽性表達率分別為95.6%(43/45)、100.0%(45/45)和60.0%(27/45)；而在濾泡上皮非典型增生病變中均無強陽性表達，中度陽性表達則僅分別為3.3%(1/30)和26.7%(8/30)，且HBME-1無中度陽性表達病例。值得注意的是，Galectin-3 在良性病變、PTMC及非典型增生周圍的正常甲狀腺組織均呈陰性。而CD19在PTMC中77.7%(35/45)染色模式以強而彌漫的陽性表達為主，在非典型增生中呈中度陽性表達占26.6%(8/30)，但其陽性染色呈局灶斑駁狀缺乏彌漫性，在良性病變、PTMC及非典型增生周圍正常甲狀腺組織中可見散在不規(guī)分布灶性濾泡上皮胞質(zhì)中弱陽性表達。HBME-l在PTMC中表達的特征是彌漫中至強陽性信號連接成線狀，而非典型增生病變中為局灶狀弱陽性表達，在良性病變及周圍正常甲狀腺組織均為陰性表達。PTMC中Galectin-3、CK19和HBME-1蛋白的陽性表達率和染色強度顯著高于濾泡上皮非典型增生組(P<0.001)。見表1。

注：A：CD56在PTMC中(-)；B：Galectin-3在PTMC強(+)；C：CK19在PTMC強(+)；D：HBME-1在PTMC中等(+)(EnVision，×100)；E：CD56在AFEP中等(+)；F：Galectin-3在AFEP中(-)；G：CK19在AFEP中等(+)；H：HBME-1在AFEP中(-)(EnVision，×100)圖1 CD56、Galectin-3、CK19及HBME-1蛋白在PTMC和非典型濾泡上皮增生中的表達

表1 CD56、Galectin-3、CK19和HBME-1蛋白在PTMC組和AFEP組中的表達 例

2.3 CD56和Galectin-3、CK19、HBME-1標(biāo)記物組合在PTMC中的表達情況 PTMC組中Galectin-3、CK19、HBME-1三種標(biāo)記物同時陽性表達為88.8%(40/45)，而Galectin3/CK19、CK19/HBME-1和Galectin3/HBME-1組合雙陽性率分別為100.0%(45/45)、88.8%(40/45)和88.8%(40/45)。結(jié)果顯示CD56陰性、Galectin-3/CK19雙陽性組合的特異度為93.4%(42/45)，且以中至強陽性染色模式為主，而CD56陰性、CK19/HBME-1或Galectin3/HBME-1雙陽性組合的特異度均為82.2%(37/45)。而在良性病變伴非典型濾泡上皮增生組中CD56均為陽性表達，其中中至強陽性表達為93.3%(28/30)，但無Galectin-3、CK19、HBME-1組合中雙陽性表達的病例。

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌中是否存在癌前病變?nèi)源嬖跔幾h，有數(shù)據(jù)表明，一些良性結(jié)節(jié)可能具有惡性潛能，并可能具有從良性到惡性的多灶性進展。在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫良性背景中和PTC周圍組織中已證實有顯微鏡下小的非典型濾泡上皮增生癌前病灶的存在[4-5]。Hunt等[6]在慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎的非典型增生區(qū)域觀察到抑癌基因的雜合缺失突變，表明這些非典型區(qū)域是腫瘤性而非反應(yīng)性區(qū)域。已在一些組織病理學(xué)分類的良性結(jié)節(jié)中被證實存在有包括Gal-3、CITED1、HBME-1、Ras、RET/PTC和PAX8/PPARc等腫瘤標(biāo)志物和遺傳突變呈陽性，已有學(xué)者將其命名為非典型濾泡上皮增生/甲狀腺濾泡上皮異型增生(follicular epithelial dysplasia，F(xiàn)ED)以與反應(yīng)性增生相區(qū)分[2，7]。

PTC可根據(jù)典型的核形態(tài)在細(xì)胞學(xué)和組織標(biāo)本中進行診斷。這些形態(tài)在某些PTC變型中可能并不突出，而在某些良性病變下可能會看到，本組中非典型濾泡上皮增生以伴隨在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中為主，可能與地處廣西桂東地區(qū)有關(guān)，由于地理環(huán)境因素的關(guān)系，本地區(qū)人口橋本甲狀腺炎的發(fā)病率并不高，而結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和甲狀腺腺瘤多見。由于病變微小，在甲狀腺良性病變中從形態(tài)學(xué)上，將具有PTC樣部分核特征的非典型濾泡上皮增生與PMTC鑒別開來，對病理學(xué)家是一個挑戰(zhàn)。

CD56是免疫球蛋白超家族的一員，CD56蛋白在正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞中表達，而在甲狀腺癌中則常表達下調(diào)或缺乏。以往報道其在PTMC中陽性率為0～60.0%，甲狀腺良性疾病中為91.7%～100.0%[8]。在我們的研究中，CD56在PTMC中陽性表達率僅為6.6%(3/45)且為弱陽性染色，無中至強陽性染色模式。而在非典型濾泡上皮增生病變中均為陽性表達，其中中至強陽性表達率為93.3%(28/30)。統(tǒng)計學(xué)顯示非典型濾泡上皮增生組中CD56的陽性率和染色強度均顯著高于PTMC組(P<0.001)。這些結(jié)果表明，CD56表達下調(diào)在甲狀腺良惡性腫瘤中的診斷和鑒別診斷中具有重要的價值，根據(jù)陽性表達情況和染色強度模式有助于我們將良性病變中非典型濾泡上皮增生與PTMC區(qū)分開來。

Galectin-3是β-半乳糖苷結(jié)合蛋白家族的成員，其涉及了甲狀腺上皮的惡性轉(zhuǎn)化過程，目前的研究的熱點集中于其在甲狀腺癌的血清學(xué)診斷標(biāo)記物。以往的研究表明，Galectin-3在PTMC中陽性率為45.7%～98.0%，但在良性病變和正常甲狀腺組織中不表達，這對PTMC與甲狀腺良性病變的鑒別診斷非常有價值[8-9]。我們的研究顯示，Galectin-3在PTMC均為陽性，且中至強陽性表達占95.6%(43/45)，而非典型增生6例陽性中5例為弱陽性，僅1例為中度強度的染色模式，PTMC組中Galectin-3的陽性率和染色強度均顯著高于非典型增生組(P<0.001)，除作為鑒別PTMC與AFEP的有效指標(biāo)外，其在非典型增生病變中的表達提示該病變可能具有分化為惡性的潛力。

以往的報道CK19在PTMC中的陽性率為59.0%～84.0%且呈強而彌漫陽性著色模式，而在甲狀腺良性病變中缺乏或低表達[10]。本組中CK19在PTMC中均呈中至強而彌漫膜陽性表達模式，而非典型增生組中陽性著色模式呈局灶斑駁狀，即使在經(jīng)冰凍切片處理后的微小癌組織病灶中也是如此。我們認(rèn)為在鑒別PTMC與非典型增生時結(jié)合細(xì)胞學(xué)形態(tài)特征以及CK19染色強度和模式對區(qū)分兩者十分重要，當(dāng)CK19呈強而彌漫染色模式時，對PTMC的診斷有提示作用。同時，盡管CK19在PTMC中的陽性率和染色強度均顯著高于非典型增生組(P<0.001)，但后者陽性表達亦達46.6%(14/30)，其中26.6%(8/30)呈中度陽性染色模式，表明非典型增生中的CK19的陽性表達提示其可能是一種癌前病變，具有與PTC相似的分子病理改變[2-3]。

HBME-1是一種存在于間皮瘤和濾泡性甲狀腺腫瘤細(xì)胞微絨毛中的膜蛋白。以往的研究證實在PTC患者中的表達明顯高于良性甲狀腺病變患者[11]。本研究顯示PTMC組中HBME-1陽性率和陽性表達強度均顯著高于非典型增生組(P<0.001)。我們體會到在惡性病變中，HBME-1在膜(腔內(nèi))線性染色更常見，其以彌漫性、線性和腺腔面、側(cè)膜、乳頭頂端強膜性染色是PTMC與非典型增生鑒別有效的標(biāo)記物之一。

由于PTMC本身病灶微小，形態(tài)學(xué)鑒別PTMC與非典型增生存在困難，運用該組合檢測在CD56陰性的狀態(tài)下，當(dāng)Galectin3、CK19、HBME-1這3個標(biāo)記物中同時或3個中任意2個組合同時出現(xiàn)強而彌漫陽性表達模式時，即可診斷為PTMC而不診斷非典型增生，這可有效輔助我們將PTMC與AFEP鑒別開來，并為臨床開展個性化的監(jiān)測策略和治療決策提供幫助。