陳麒安,劉超群,陳怡,趙亮△

南方醫(yī)科大學(xué) 1第二臨床醫(yī)學(xué)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，3第一臨床醫(yī)學(xué)院(廣東廣州 510515)

鐵死亡由Stockwell等學(xué)者于2012年提出。這是一種鐵依賴性的、由脂質(zhì)活性氧(reactive oxygen species,ROS)驅(qū)動的程序性死亡形式，它在細(xì)胞形態(tài)、生化、遺傳特征方面顯著不同于凋亡、壞死和自噬等死亡形式。鐵死亡的發(fā)生機制為：膜磷脂在非酶或脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)等途徑及鐵的催化下形成脂質(zhì)ROS，脂質(zhì)ROS持續(xù)累積最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞對鐵死亡的敏感性主要由谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)調(diào)節(jié)。GPX4是一種硒代半胱氨酸酶，它能在還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)存在的條件下將毒性脂質(zhì)ROS還原為無毒的脂質(zhì)醇，從而阻止鐵死亡的發(fā)生。GSH的合成原料由胱氨酸-谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體(System Xc-)供應(yīng)。System Xc-可在將谷氨酸輸出至細(xì)胞外的同時，將細(xì)胞外的胱氨酸轉(zhuǎn)運入細(xì)胞內(nèi)，從而促進(jìn)GSH的合成，維持GPX4的活性。小分子erastin可以通過抑制System Xc-對胱氨酸的轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致GSH耗竭和GPX4失活，從而誘導(dǎo)鐵死亡，而RSL3則通過抑制GPX4的活性直接誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。研究發(fā)現(xiàn)，GSH-GPX4對于維持細(xì)胞活性尤為重要，在免疫細(xì)胞中亦然。此外，GSH耗竭和(或)GPX4失活的腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，釋放細(xì)胞內(nèi)源性分子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，同時，免疫系統(tǒng)釋放的細(xì)胞因子也可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH-GPX4水平，影響細(xì)胞對鐵死亡的敏感性(圖1)。

1 GSH-GPX4軸對免疫細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用

GPX4作為脂質(zhì)ROS清除的關(guān)鍵酶，對維持細(xì)胞活性至關(guān)重要。事實上，氧化應(yīng)激在細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)中起著雙重作用，它一方面幫助細(xì)胞在細(xì)胞外環(huán)境或細(xì)胞內(nèi)刺激下生存或分化，另一方面卻會引起膜破裂、蛋白質(zhì)降解、脂質(zhì)過氧化、DNA損傷、細(xì)胞死亡等。在T細(xì)胞活化過程中，線粒體ROS對于活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)、核因子-κB(neclear factor-κB,NF-κB)和激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的激活至關(guān)重要[1]。研究表明，GSH可以通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞中ROS依賴的信號通路參與代謝重編程，協(xié)調(diào)T細(xì)胞亞群的分化和能量代謝需求[2]，進(jìn)而影響腫瘤微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)。此外，鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化可通過抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的表達(dá)，促進(jìn)人外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)向B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的增殖和分化[3]。然而，有研究表明，髓系細(xì)胞中GPX4的消耗增加了敗血癥的致死性[4]。GPX4敲除的髓系細(xì)胞無法有效清除活性氧，這將增加腸上皮的遺傳不穩(wěn)定性，進(jìn)而刺激腸腫瘤的發(fā)生及侵襲性生長[5]。另外，GPX4缺失的小鼠T細(xì)胞將迅速聚集脂質(zhì)過氧化物并發(fā)生鐵死亡，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)無法保護機體免受感染的侵害[6]，這提示GPX4在介導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。

注：(1)鐵死亡發(fā)生過程；(2)GSH耗竭和(或)GPX4失活的免疫細(xì)胞發(fā)生鐵死亡；(3)T細(xì)胞釋放IFN-γ、TNF-α調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)GSH-GPX4，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞對鐵死亡的敏感性；(4)腫瘤細(xì)胞鐵死亡誘發(fā)的損傷信號參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性與功能。DAMPs：損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns)；oxPC：氧化磷脂酰膽堿(oxidized phosphatidylcholine)；PGE2：前列腺素E2(prostaglandin E2)；樹突狀細(xì)胞(dendritic cell);MDSC：髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell)圖1 鐵死亡與腫瘤免疫調(diào)節(jié)

2 免疫細(xì)胞因子對腫瘤細(xì)胞GSH-GPX4軸的調(diào)節(jié)作用

研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞可通過釋放IFN-γ下調(diào)System Xc-的關(guān)鍵組成亞單位SLC7A11和SLC3A2的表達(dá)，抑制谷氨酸轉(zhuǎn)運及GSH合成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。聯(lián)合cysteinase(一種可降解胱氨酸和半胱氨酸的工程酶)與免疫檢查點阻滯可能協(xié)同地增強T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫及誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的作用[7]。

在黑色素瘤中，免疫活性升高引起的炎癥性微環(huán)境可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的去分化，這種去分化狀態(tài)是黑色素瘤細(xì)胞對靶向治療和免疫治療交叉耐藥的根源。實驗證實，用TNF-α和IFN-γ刺激黑色素瘤細(xì)胞可分別導(dǎo)致NF-κB或STAT1信號通路的激活，誘導(dǎo)細(xì)胞去分化，提高其對erastin和RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡的敏感性。其機制可能與去分化黑色素瘤細(xì)胞中GSH的水平相關(guān)[8]。因此，免疫細(xì)胞因子通過誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞對鐵死亡的敏感性，可以清除去分化狀態(tài)的細(xì)胞群，進(jìn)一步阻止具有免疫抑制能力的黑色素瘤細(xì)胞累積?？梢?，這種聯(lián)合治療可以在有效殺死腫瘤細(xì)胞的同時避免了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。

3 腫瘤細(xì)胞鐵死亡誘發(fā)的損傷信號參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性與功能

研究表明，凋亡細(xì)胞可以通過釋放“找我(find me)”信號吸引巨噬細(xì)胞，同時，凋亡細(xì)胞表面暴露的“吃我(eat me)”信號則誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞將其吞噬[9]?？梢韵胂螅l(fā)生鐵死亡的腫瘤細(xì)胞，也釋放類似的信號發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在體外，巨噬細(xì)胞有效吞噬了發(fā)生鐵死亡的腫瘤細(xì)胞，支持了此類信號的存在[10]。

3.1 腫瘤細(xì)胞鐵死亡釋放損傷相關(guān)分子模式 通過壞死性途徑死亡的細(xì)胞(如壞死、焦亡)，其特征是細(xì)胞膜破裂并釋放細(xì)胞內(nèi)成分，如損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，以吸引巨噬細(xì)胞，提高抗原提呈效率。DAMPs包含“find me”和“eat me”信號，如鈣網(wǎng)蛋白、ATP、HMGB1等[11]。實驗證明，發(fā)生鐵死亡的腫瘤細(xì)胞可通過自噬依賴性方式釋放高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)[12]。HMGB1是一種細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白，它被釋放到胞外后，作為DAMPs，通過與RAGE、TLR2、TLR4等受體結(jié)合，激活相關(guān)信號通路，從而誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的活化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生[13]。在心臟缺血/再灌注損傷模型中，鐵死亡細(xì)胞通過釋放DAMPs，激活固有免疫，募集嗜中性粒細(xì)胞[14]。在胰腺導(dǎo)管腺癌中，發(fā)生自噬依賴性鐵死亡的腫瘤細(xì)胞可以釋放Kras作為一種DAMPs，通過RAGE途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂肪酸氧化，進(jìn)而向M2型極化，誘導(dǎo)免疫抑制[15]。

3.2 腫瘤細(xì)胞鐵死亡釋放脂質(zhì)介質(zhì) 對發(fā)生鐵死亡的細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)有大量雙氧合和三氧合的含磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)積累，這可能是由15-LOX催化產(chǎn)生的[16]。雖然細(xì)胞膜外氧化的PE及其氧化分解產(chǎn)物、水解產(chǎn)物的生物學(xué)作用尚未可知，但已證實在凋亡細(xì)胞中，溶血磷脂可作為免疫調(diào)節(jié)信號吸引抗原提呈細(xì)胞[17]。另外，有實驗發(fā)現(xiàn)，15-LOX產(chǎn)生的脂質(zhì)介質(zhì)可調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的成熟并調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，如氧化磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)可通過激活轉(zhuǎn)錄因子NRF2抑制DC成熟，并抑制輔助性T細(xì)胞17(helper T cell，Th17)細(xì)胞的分化[18]。然而，在鐵死亡環(huán)境中釋放的脂質(zhì)介質(zhì)是否也發(fā)揮著同樣的作用還有待進(jìn)一步的研究證實。

研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生鐵死亡的腫瘤細(xì)胞中，除了LOX產(chǎn)物增加外，還有PGE2的大量釋放，這可能與前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)的表達(dá)顯著上調(diào)有關(guān)[19]。目前已經(jīng)證實，PGE2作為促炎因子發(fā)揮作用的同時，也具有免疫抑制活性。PGE2誘導(dǎo)的免疫抑制作用如下：(1)抑制NK細(xì)胞的活性及其分泌CCL5和XCL1的能力，從而抑制腫瘤微環(huán)境中DC的招募[20]；(2)促進(jìn)DC分泌的細(xì)胞因子從Th1 型向 Th2 型轉(zhuǎn)換，從而降低CD8+T細(xì)胞的活性[21]；(3)誘導(dǎo)髓樣祖細(xì)胞分化為髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)，增強MDSC介導(dǎo)的免疫抑制及其誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg細(xì)胞的能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[22]。

綜上所述，鐵死亡細(xì)胞釋放的脂質(zhì)介質(zhì)可能在免疫系統(tǒng)激活的多個步驟中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，包括抗原加工、提呈、免疫細(xì)胞的成熟、遷移。但在不同條件下，鐵死亡釋放的不同信號有可能發(fā)揮著促進(jìn)免疫或抑制免疫兩種截然相反的作用。

3.3 GPX4在鐵死亡與免疫調(diào)節(jié)中的作用 細(xì)胞內(nèi)促炎脂質(zhì)介質(zhì)的生物合成多由LOX和PTGS催化而來，這些酶的活性則受GSH-GPX4的調(diào)控[23]。因此，GSH耗竭和(或)GPX4失活的腫瘤細(xì)胞內(nèi)LOX的酶活性升高，脂質(zhì)ROS及促炎性細(xì)胞因子的合成增多。這些細(xì)胞在發(fā)生鐵死亡的同時，可以釋放大量細(xì)胞內(nèi)源性分子(包括DAMPs、脂質(zhì)介質(zhì)等)激活免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌促炎因子，如TNF-α、IL-1β等[24]。TNF-α和IL-1β可以誘導(dǎo)PTGS2活化，此外TNF-α還可使GPX4持續(xù)下調(diào)[25]，這些效應(yīng)最終都導(dǎo)致LOX、PTGS2的酶活性升高，進(jìn)一步促進(jìn)了鐵死亡及免疫炎癥反應(yīng)。研究表明，固有免疫系統(tǒng)的細(xì)胞通過分泌白三烯、hepoxilins等，與PTGS和LOX酶聯(lián)合維持炎癥狀態(tài)，并且最終通過分泌resolvins和lipoxin使炎癥消退[24]。這種自發(fā)放大循環(huán)(auto-amplification loop)也發(fā)生在其他非凋亡性細(xì)胞死亡形式中，并且最終可導(dǎo)致組織損傷和器官衰竭[26]。可以想象，如果GPX4水平持續(xù)下降，固有免疫系統(tǒng)沒有及時釋放消除炎癥的信號，可能會導(dǎo)致持續(xù)的慢性炎癥，引起腫瘤環(huán)境中的免疫抑制以及免疫炎癥性的病理損傷(如缺血/再灌注損傷)等。

4 腫瘤治療中的鐵死亡與免疫調(diào)節(jié)

腫瘤免疫治療是一種通過調(diào)節(jié)人體的免疫防御機制殺傷腫瘤細(xì)胞的治療方法，因其不良反應(yīng)小、特異性強等優(yōu)點而備受關(guān)注。近年來，不斷有用于免疫治療的新靶點和新技術(shù)出現(xiàn)。其中，重組腺病毒P53注射液作為世界上第1個基因治療產(chǎn)品，已被應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療。野生型p53是一種抑癌基因，它除了能夠?qū)е录?xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以外，還與抗腫瘤免疫密切相關(guān)[27]。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中，P53蛋白大量積聚，并作為腫瘤相關(guān)抗原誘發(fā)機體免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗瘤效應(yīng)[28]。目前已有許多研究表明，P53在腫瘤細(xì)胞鐵死亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。在人骨肉瘤與人乳腺腺癌細(xì)胞中，P53可以通過與SLC7A11基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制SLC7A11的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GSH合成減少，對erastin誘導(dǎo)的鐵死亡敏感性增加[29]。因此，我們設(shè)想P53誘導(dǎo)的免疫治療是否可以與鐵死亡誘導(dǎo)劑相結(jié)合，提高抗腫瘤治療的療效。

如何有效地將免疫檢查點療法與傳統(tǒng)的腫瘤治療方案相結(jié)合是目前腫瘤治療面臨的一個巨大挑戰(zhàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，放射治療誘導(dǎo)的共濟失調(diào)毛細(xì)血管擴張突變基因(ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM)可以協(xié)同免疫治療活化的CD8+T細(xì)胞，抑制GSH的合成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物積累，誘導(dǎo)鐵死亡[30]。該研究提示鐵死亡激動劑可以作為一種放射治療及免疫治療的增敏劑，在兩者聯(lián)合治療中起橋梁作用。光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種新型的腫瘤治療方法，目前已有許多研究發(fā)現(xiàn)PDT對于腫瘤微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)有重要作用，PDT與免疫的聯(lián)合治療也備受關(guān)注。據(jù)報道，復(fù)合納米藥物SRF@Hb-Ce6[由鐵死亡誘導(dǎo)劑索拉菲尼(sorafenib，SRF)與血紅蛋白(hemoglobin，Hb)、光敏劑chlorin e6(Ce6)組成的復(fù)合納米藥物)]，可以將鐵死亡與PDT相結(jié)合，具有良好的協(xié)同抗腫瘤活性。實驗證明，SRF@Hb-Ce6通過募集腫瘤組織中的CD8+T細(xì)胞，增加IFN-γ分泌，協(xié)同SRF促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[31]。由此可見，明確免疫與鐵死亡的相互調(diào)節(jié)機制，對于將鐵死亡與免疫治療及其他抗腫瘤治療方法聯(lián)合，以提高抗腫瘤療效具有重要意義。

5 展望

鐵死亡的發(fā)現(xiàn)，為許多疾病的發(fā)生機制闡明提供依據(jù)，也為腫瘤治療開辟了新途徑。鐵死亡的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)鐵、脂質(zhì)ROS、谷胱甘肽的代謝密切相關(guān)，許多分子(如ACSL4、LOX、NADPH、CoQ10)則可通過調(diào)節(jié)以上三要素調(diào)控細(xì)胞對鐵死亡的敏感性。目前不斷有研究發(fā)現(xiàn)新的鐵死亡調(diào)控分子機制及可能的抗腫瘤靶點，然而，關(guān)于鐵死亡背景下的壞死性炎癥及免疫調(diào)節(jié)仍存在一些問題：(1)除了GSH-GPX4軸以外，參與鐵死亡的鐵離子是否也受到免疫因子的調(diào)控；(2)LOX、PTGS等不同酶的催化產(chǎn)物是否會引起不同的免疫應(yīng)答；(3)腫瘤細(xì)胞發(fā)生的鐵死亡除了殺傷腫瘤細(xì)胞外，是否誘導(dǎo)抗腫瘤免疫或者抑制免疫應(yīng)答。進(jìn)一步明確這些問題，對于闡明疾病的發(fā)生機制，指導(dǎo)如何聯(lián)合鐵死亡與免疫用于腫瘤等疾病的治療具有重要臨床意義。