陳櫟遙,楊文秀,施珺菁,楊嘉麗,傅淑平,于美玲,盧圣鋒

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)針?biāo)幗Y(jié)合教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院,江蘇 張家港 215600)

膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)調(diào)控失調(diào)引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征,可導(dǎo)致危及生命的多器官功能障礙,嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。心臟是易受損的靶器官之一,心功能障礙是膿毒癥心肌損傷的主要表現(xiàn),且與患者的高死亡率密切相關(guān)[2]。臨床研究[3-4]和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[5-6]表明,針刺對(duì)膿毒癥有良好的治療效應(yīng):既能提高存活率[7],也可改善膿毒癥引起的臟器損傷[8-11];并初步發(fā)現(xiàn),針刺足三里能夠改善血流動(dòng)力學(xué)和心功能[12],實(shí)現(xiàn)對(duì)損傷心肌的保護(hù)[13],但具體機(jī)制尚未完全闡明。膿毒癥期間炎癥水平的升高是先天免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)激活后引起細(xì)胞因子釋放導(dǎo)致的,炎性反應(yīng)是誘發(fā)心肌損傷的主要因素。最近的研究提示[14],巨噬細(xì)胞存在M1型和M2型2種表型,M1型巨噬細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子發(fā)揮促炎作用,M2型巨噬細(xì)胞釋放抗炎性細(xì)胞因子起抗炎作用,巨噬細(xì)胞極化平衡是有效清除毒素和組織修復(fù)的關(guān)鍵。因此,調(diào)控巨噬細(xì)胞極化在改善膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷中具有重要的意義。多項(xiàng)研究顯示,電針可調(diào)控心肌損傷局部炎性反應(yīng)[15-18],并有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化[19-20]。電針預(yù)處理能否通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化、抑制炎性反應(yīng)減輕膿毒癥心肌損傷?目前未見有研究報(bào)道。因此,本研究用脂多糖誘導(dǎo)建立膿毒癥模型小鼠,以炎癥為切入點(diǎn),觀察電針預(yù)處理對(duì)全身及局部炎癥水平、心功能及心肌巨噬細(xì)胞表型的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

6～8周SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠24只,體質(zhì)量20～25 g,購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(浙)2019-0001。將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,室溫(22±1)℃,濕度為50%～60%,12 h明/暗光照周期,自由進(jìn)食和飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對(duì)照組、模型組和電針預(yù)處理組,每組8只。所有實(shí)驗(yàn)操作符合科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》,并獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào):202101A041)。具體實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程示意圖

1.2 主要試劑與儀器

小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)(意大利Esaote公司),流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司,CytoFLEX),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Agilent公司,Mx3000P),多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司),電泳儀及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司),化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海歐翔公司),韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(HANS-200A，南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司),無(wú)菌針灸針(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)。

脂多糖(美國(guó)Sigma公司,O111: B4),F4/80抗體、CD11b抗體、CD206抗體(美國(guó)eBioscience公司),IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α抗體(英國(guó)Abcam公司),GAPDH抗體(美國(guó)CST公司),ECL超敏發(fā)光液(南京基易生物科技有限公司),TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒(南京金益柏生物科技有限公司)。

1.3 干預(yù)方法

參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[21]進(jìn)行穴位定位,電針預(yù)處理組于造模前取雙側(cè)足三里穴進(jìn)行電針治療。足三里穴:膝關(guān)節(jié)下方,腓骨頭下0.3 cm處的肌溝中。用5%異氟烷將小鼠快速誘導(dǎo)麻醉后,以1%～2%異氟烷維持,將自制雙極聯(lián)體針(用醫(yī)用絕緣膠帶將兩根規(guī)格為0.16 mm×7 mm的針灸針針柄各自纏繞至1 mm厚度后,將其并列捆在一起,露出針柄末端與針身)直刺3 mm后,連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀,疏密波,頻率2/15 Hz,強(qiáng)度2 mA,針刺15 min。對(duì)照組、模型組不予處理,僅抓取、固定。

1.4 模型制備

模型組、電針預(yù)處理組參照文獻(xiàn)[22]腹腔注射10 mg/kg LPS建立膿毒癥模型,對(duì)照組注射等體積生理鹽水。小鼠出現(xiàn)肛溫降低、活動(dòng)減少、眼瞼閉合伴黏稠分泌物、腹瀉等表現(xiàn)為模型復(fù)制成功。

1.5 經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖測(cè)量心功能

造模16 h后通過(guò)經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖測(cè)定小鼠心臟功能。用M型超聲記錄測(cè)量左室收縮期末內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張期末內(nèi)徑(LVEDD)。并通過(guò)系統(tǒng)公式計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和短軸收縮率(LVFS)。

1.6 ELISA檢測(cè)

造模6 h后用毛細(xì)管眼眶靜脈叢取血,常規(guī)離心后分離血清,采用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β水平,具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 心肌組織中炎性因子mRNA表達(dá)檢測(cè)

超聲檢查結(jié)束后取心臟組織,采用qPCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。Trizol法提取總RNA,核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度。通過(guò)熱循環(huán)儀,25 ℃ 5 min,55 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以GAPDH作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 5 min;變性95 ℃ 10 s;退火55 ℃ 20 s;延伸72 ℃ 20 s。使用2-ΔΔCt方法處理數(shù)據(jù)。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)與合成,見表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot法檢測(cè)心肌組織中炎性因子蛋白含量

將各組小鼠心肌組織液氮研磨并加入RIPA蛋白裂解液后,12 000 r/min,4 ℃,離心15 min,取上清,用BCA法測(cè)定蛋白濃度后加入蛋白上樣緩沖液,100 ℃加熱變性,-80 ℃?zhèn)溆谩?2% SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,5%BSA封閉1 h,加入有IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、β-actin(均為1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000)抗體稀釋液的抗體盒中,4 ℃孵育過(guò)夜,次日TBST洗3次后,二抗(1∶3 000)中室溫孵育1 h,TBST洗3次,ECL顯色曝光。以GAPDH和β-actin作為內(nèi)參,采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)分選巨噬細(xì)胞

心肌單細(xì)胞懸液制備方法參考文獻(xiàn)[23]進(jìn)行,取心臟組織用冷的PBS沖洗去除組織中的血液,將組織剪碎成小塊,每個(gè)心臟用5 mL消化液消化,消化液按每1 mL RPMI-1640培養(yǎng)基溶液加入1.6 mg Collagenase Ⅰ及0.2 mg Dnase Ⅰ配置而成,在37 ℃溫育混勻1 h后用40 μm的過(guò)濾器過(guò)濾組織,并在4 ℃以1 500 r/min離心5 min,去上清,將沉淀重懸在1 mL PBS中。加入3 mL紅細(xì)胞裂解液冰上裂解3 min,離心后去上清,再使用PBS洗1次,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×106mL-1。用CD16/32抗體進(jìn)行Fc受體阻斷后,從小鼠心臟收集的巨噬細(xì)胞用CD11b、CD206、F4/80標(biāo)記抗體進(jìn)行表面染色,4 ℃避光孵育30 min。通過(guò)CytExpert軟件分析結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠LVEF和LVFS的比較

與對(duì)照組相比,模型組LVEF及LVFS顯著降低(P<0.01);與模型組相比,電針預(yù)處理組LVEF及LVFS明顯增高(P<0.01)。見圖2。

注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,圖2 電針預(yù)處理對(duì)小鼠LVEF及LVFS的影響

2.2 各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β含量的比較

與對(duì)照組相比,模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平均顯著升高(P<0.01);與模型組相比,電針預(yù)處理組TNF-α、IL-1β含量下降(P<0.05,P<0.01)。見圖3。

注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,圖3 電針預(yù)處理對(duì)小鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影響

2.3 各組小鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 mRNA表達(dá)量的比較

與對(duì)照組相比,模型組小鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 mRNA水平均升高(P<0.05，P<0.01);與模型組相比,電針預(yù)處理組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平下降(P<0.01),IL-10 mRNA水平明顯上升(P<0.01)。見圖4。

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01; 與模型組比較,圖4 各組小鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、 IL-10 mRNA表達(dá)量的比較

2.4 各組小鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10蛋白水平的比較

與對(duì)照組相比,模型組小鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10蛋白含量均上調(diào)(P<0.05,P<0.01);與模型組相比,電針預(yù)處理組TNF-α、IL-1β、IL-6含量下調(diào)(P<0.05,P<0.01),IL-10含量上調(diào)(P<0.05)。見圖5。

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01; 與模型組比較,圖5 各組小鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、 IL-6、IL-10蛋白表達(dá)量的比較

2.5 各組小鼠心臟巨噬細(xì)胞數(shù)量及表型的比較

與對(duì)照組相比,模型組心肌組織中F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞在總細(xì)胞數(shù)中的含量明顯升高(P<0.01),表達(dá)F4/80+CD11b+CD206low的M1型巨噬細(xì)胞比例上調(diào)(P<0.01),表達(dá)F4/80+CD11b+CD206high的M2型巨噬細(xì)胞比例下降(P<0.01);與模型組相比,電針預(yù)處理組巨噬細(xì)胞含量及F4/80+CD11b+CD206lowM1型巨噬細(xì)胞的比例下降(P<0.01),F4/80+CD11b+CD206highM2型巨噬細(xì)胞比例上升(P<0.01)。見圖6。

注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,圖6 電針預(yù)處理對(duì)巨噬細(xì)胞總數(shù)及表型的影響

3 討論

膿毒癥是危重癥患者的首要死因,心功能障礙是膿毒癥預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因素之一。膿毒癥模型的制備方式主要包括外源性毒素(如LPS)的直接注射和內(nèi)源性保護(hù)屏障的破壞(如盲腸結(jié)扎穿孔法)[24]。腹腔注射LPS構(gòu)建的動(dòng)物模型能模擬人類膿毒癥的血流動(dòng)力學(xué)及代謝紊亂改變,且反應(yīng)時(shí)間和嚴(yán)重程度更加可控,故選擇此法。本研究中,LPS注射2 h后小鼠出現(xiàn)了肛溫降低、活動(dòng)減少、眼瞼閉合伴黏稠分泌物、腹瀉等表現(xiàn),符合膿毒癥模型一般表現(xiàn)。且造模16 h后,超聲心動(dòng)圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn):模型組動(dòng)物發(fā)生左心室收縮功能障礙改變——LVEF和LVFS值降低,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22],提示本實(shí)驗(yàn)?zāi)摱景Y伴心功能損傷模型建立成功。同時(shí)發(fā)現(xiàn),電針預(yù)處理可以有效改善上述異常變化,并降低血清TNF-α、IL-1β水平,表明電針預(yù)處理在防治膿毒癥及其誘發(fā)的心肌損傷中具有價(jià)值。

炎性反應(yīng)是膿毒癥心肌損傷的病理基礎(chǔ)。細(xì)胞表面的Toll樣受體識(shí)別病原體相關(guān)分子模式,激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等先天免疫細(xì)胞,啟動(dòng)炎性通路進(jìn)而導(dǎo)致下游炎性因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放,直接引起心肌細(xì)胞損傷,使心肌收縮力下降[25-26]。此外,TNF-α、IL-1β誘導(dǎo)一氧化氮(NO)的產(chǎn)生,引起心臟產(chǎn)生負(fù)性變力,導(dǎo)致心肌組織病變[27-28]。多項(xiàng)研究提示[29-31],干預(yù)炎性反應(yīng)能改善膿毒癥心功能障礙,減輕心肌損傷。在本研究中,小鼠心肌損傷后,心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達(dá)水平明顯上調(diào),而電針預(yù)處理后TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)下降并促進(jìn)IL-10的進(jìn)一步增加,提示電針預(yù)處理可能通過(guò)抑制炎癥發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

巨噬細(xì)胞在周圍微環(huán)境的作用下,可以極化為M1型和M2型巨噬細(xì)胞表型并發(fā)揮不同的作用。通過(guò)不同的特異性生物標(biāo)記物,可鑒別不同巨噬細(xì)胞亞型,其中F4/80、CD11b雙陽(yáng)標(biāo)記巨噬細(xì)胞;CD206是典型的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物。M1型巨噬細(xì)胞主要呈遞抗原和分泌促炎因子如TNF-α、IL-1β和IL-6;而M2型巨噬細(xì)胞與組織修復(fù)相關(guān),其分泌抑炎因子IL-10。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型心肌組織中巨噬細(xì)胞檢測(cè)。結(jié)果顯示,在LPS刺激下,心臟中F4/80+CD11b+總巨噬細(xì)胞含量增加,且F4/80+CD11b+CD206lowM1型巨噬細(xì)胞占比增加,表明LPS促進(jìn)巨噬細(xì)胞總量增加,并向M1極化。但電針干預(yù)后,F4/80+CD11b+總巨噬細(xì)胞含量下降,且F4/80+CD11b+CD206highM2型巨噬細(xì)胞占比顯著增加,提示電針預(yù)處理能抑制LPS對(duì)巨噬細(xì)胞向M1極化的誘導(dǎo)作用,促進(jìn)其向M2型巨噬細(xì)胞極化,結(jié)合M1、M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)炎性因子表達(dá)情況,與心肌組織流式結(jié)果一致,提示電針預(yù)處理通過(guò)促進(jìn)促炎M1型向抗炎M2型巨噬細(xì)胞極化減輕炎癥發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上,電針預(yù)處理可通過(guò)減少心肌巨噬細(xì)胞的募集,并促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化,減輕全身和局部炎性反應(yīng),改善心功能,實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)。研究表明[6]電針足三里通過(guò)迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)多巴胺抑制LPS誘發(fā)的全身性炎癥,那么電針預(yù)處理是否通過(guò)此途徑實(shí)現(xiàn)促巨噬細(xì)胞向M2型極化,減輕炎性反應(yīng)，改善LPS誘發(fā)的心肌損傷呢?此外,內(nèi)關(guān)穴是心血管疾病的首選腧穴,針刺內(nèi)關(guān)能減輕心肌局部炎癥,同時(shí)也能有效調(diào)控巨噬細(xì)極化[19]，那么刺激該穴,是否也能在此模型中發(fā)揮心肌保護(hù)作用呢?預(yù)處理產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng),在膿毒癥發(fā)生之后用電針干預(yù)是否也同樣有效?都需要我們進(jìn)一步探索和明確。