陸超穎,丁夢磊,蔡淑慧,謝輝,張雯,狄留慶

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210023)

附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的子根加工品,性熱、味辛,首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有“破癥堅積聚”之功效[1]。中醫(yī)臨床廣泛運用含附子的復(fù)方治療肺癌、胃癌、肝癌等惡性腫瘤,如四逆湯、麻附益陽湯、參附注射液及復(fù)方三生注射液[2-5]?，F(xiàn)代研究表明,附子生物堿類成分具有顯著抗腫瘤藥效[6-8]。然而,附子水煎液生物堿含量研究尚不清晰,抗腫瘤機制亦不明確。

生物堿類成分既是附子中有效成分,也是其毒性成分。湯劑為中醫(yī)臨床最常用劑型,對附子水煎液中生物堿進(jìn)行定量可以更好地為附子臨床藥效與毒性評價提供參考與依據(jù)。本實驗采用UPLC-MS/MS方法測定附子中生物堿含量,明確附子發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),對進(jìn)一步揭示其抗腫瘤機制至關(guān)重要。由于附子生物堿種類眾多,目前其抗腫瘤機制尚不清晰?；谥兴幊煞值膹?fù)雜性及作用的整體性,附子生物堿可能是通過多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮抗腫瘤作用,這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)觀相吻合[9]。然而目前尚未有運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究附子抗腫瘤機制的報道。本研究擬運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測其抗腫瘤機制,為附子抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

黑順片(批號：200630、200418、190927,產(chǎn)地：四川綿陽)購自永剛中藥飲片廠,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉圣金副教授鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的子根加工品,本試驗前期已按照2020年版《中國藥典》的檢測方法和要求對飲片進(jìn)行檢驗,選出優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地的飲片。其余試藥見表1。

1.2 儀器

Thermo TSQ Quantis液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher公司);梅特勒-托利多X6百萬分之一電子天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司);液體加熱器(潮州市一壺百飲電器實業(yè)有限公司);Synergy UV系統(tǒng)超純水儀(美國Millipore公司);CL21 R型高速離心機(美國Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 UPLC-MS/MS方法分析附子水煎液中生物堿類成分

2.1.1 色譜及質(zhì)譜條件 Thermo TSQ Quantis液質(zhì)聯(lián)用儀系統(tǒng),色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～1 min,2%～20% B;1～5 min,50% B;5～10 min,50%～75% B;10～14 min,75%～100% B)流速0.3 mL·min-1,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件:采用ESI源,正離子模式檢測;脫溶劑溫度350 ℃;脫溶劑氣流N2流速50 L·min-1;離子轉(zhuǎn)移管溫度325 ℃;正離子霧化電壓3 500 V,掃描方式為MRM檢測。12個生物堿類成分測定的離子對見表2,其總離子流圖見圖1。

表2 附子生物堿類成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖1 附子總離子流圖

2.1.2 對照品溶液的配制 稱取對照品適量,精密稱定,用水配制成為濃度為1.758 8 μg·mL-1去甲豬毛菜堿、0.992 0 μg·mL-1新烏頭原堿、0.991 0 μg·mL-1多根烏頭堿、0.985 0 μg·mL-1烏頭原堿、0.979 5 μg·mL-1宋果靈、0.537 5 μg·mL-1次烏頭原堿、0.993 5 μg·mL-1附子靈、1.018 5 μg·mL-1尼奧靈、2.046 0 μg·mL-1苯甲酰新烏頭原堿、1.039 5 μg·mL-1苯甲酰烏頭原堿、0.965 0 μg·mL-1苯甲酰次烏頭原堿、1.109 0 μg·mL-1次烏頭堿的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取黑順片飲片適量,加8倍量水,武火煮沸后,文火煎煮1 h,過濾取續(xù)濾液,重復(fù)上述操作,合并濾液,減壓濃縮成含1 g·mL-1飲片量的藥液,稀釋500倍至2 mg·mL-1,為供試品母液。取供試品母液適量,加入等量甲醇,渦旋3 min后,離心15 min(14 000 r·min-1)取上清,即為供試品溶液。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)初探附子生物堿類成分抗腫瘤機制

2.2.1 附子生物堿類成分靶點預(yù)測 將12個附子生物堿成分通過PubChem網(wǎng)站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索其SMILES結(jié)構(gòu)式,并導(dǎo)入Swiss Target Prediction(http://new.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行各個成分對應(yīng)作用靶點的預(yù)測。再利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對篩選出的靶點進(jìn)行基因名稱規(guī)范。

2.2.2 腫瘤靶點基因篩選 在Gene Cards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中輸入“Cancer”作為檢索詞,查找與腫瘤疾病相關(guān)的基因。

2.2.3 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 運用韋恩圖網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),將成分與疾病的靶點取交集,得到附子中12個生物堿抗腫瘤的潛在作用靶點,并繪制韋恩圖。根據(jù)得到的交集靶點推導(dǎo)出與之對應(yīng)的附子生物堿成分,剔除不作用于這些靶點的生物堿。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件,進(jìn)行可視化處理分析,構(gòu)建附子抗腫瘤的成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

2.2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 將“2.2.3”項中所得到的附子治療腫瘤的靶標(biāo)基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),構(gòu)建靶標(biāo)之間相互作用網(wǎng)絡(luò),條件設(shè)定為:物種(Homo sapiens),最小相互作用分?jǐn)?shù)(medium confidence)為0.400 0。由此獲得的蛋白相互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行可視化處理分析。

圖2 各對照品質(zhì)譜圖

2.2.5 GO分類富集分析和KEGG通路分析 運用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/),在“Functional Annotation Tool”欄目中,輸入藥物與疾病交集的靶標(biāo)基因,選擇“Offcial-gene-symbol”與“Homo sapiens”,提交基因序列,在“Gene-Ontology”條目中得到BP、CC、MF結(jié)果表,在“Pathways”條目中得到KEGG結(jié)果表。選取P<0.05的條目進(jìn)行整理分析,在“微生信”(http://www.bioinformatics.com.cn/)網(wǎng)站上繪制GO與KEGG通路富集圖。

3 結(jié)果

3.1 附子生物堿成分質(zhì)譜分析

如圖2所示,依次為對照品去甲豬毛菜堿、宋果靈、多根烏頭堿、尼奧靈、附子靈、次烏頭原堿、新烏頭原堿、烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、次烏頭堿的色譜峰。

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1 線性范圍與定量限 取對照品儲備液適量,用超純水稀釋為不同濃度梯度溶液,得到不同濃度的對照品溶液,按“2.1.1”項下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定。以待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),待測物的峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。12個生物堿的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍的結(jié)果見表3。

3.2.2 精密度試驗 將對照品母液稀釋10倍,按“2.1.1”項檢測條件進(jìn)行分析,連續(xù)進(jìn)樣6針,記錄各組分峰面積,計算其RSD值見表4。12個生物堿精密度RSD值均小于3.73%,表明該方法精密度良好。

推薦理由:當(dāng)代硬漢派偵探小說大師，勞倫斯·布洛克的代表作之一雅賊系列全盛回歸。全十一冊，午夜文庫·精裝小紅殼。如何獲得一幅屬于自己的蒙德里安？如何在十五天內(nèi)看完三十部鮑嘉的電影？錢德勒和哈米特為何相愛相殺？吉卜林為何銷毀自己的著作？金吉和喬安娜為何變身吉姆和約瑟夫？見證無尾貓“拉菲茲”從男低音改喵女高音的全過程……我，伯尼·羅登巴爾，是個現(xiàn)代紐約的紳士小偷。我白天守書店，晚上闖空門。我喜歡吉卜林的小說、斯賓諾莎的書和蒙德里安的畫……我所有的天賦，讓我只能做個賊。

表3 生物堿類成分的回歸方程、R、線性范圍、定量限(LOQ)

表4 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性與加樣回收率測定結(jié)果(n=6)

3.2.3 重復(fù)性試驗 按照“2.1.3”項下供試品溶液的制備,平行制備6份供試品溶液,進(jìn)樣得12個成分峰面積,計算相應(yīng)成分含量,通過含量計算其RSD值,結(jié)果見表4。測得其RSD均小于5.32%,表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液,室溫放置,分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行分析,計算12個待測成分的RSD值,結(jié)果見表4。12個生物堿RSD均小于4.94%,表明12個成分的供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.5 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品溶液,共6份,精密量取,加入各對照品,按照“2.1.3”項下制備供試品溶液,進(jìn)行測定分級,計算各待測物質(zhì)的平均回收率及RSD,見表4。12個待測物加樣回收率在95.85%～103.14%之間,RSD均小于4.9%,表明該方法準(zhǔn)確度符合要求。

3.3 飲片生物堿含量測定

按“2.1.3”項下方法,制備3批附子飲片供試品溶液。以“2.1.1”項下色譜及質(zhì)譜條件,對3批附子飲片中的生物堿成分進(jìn)行含量測定,具體結(jié)果見表5。含量較高的為單酯型生物堿(如苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿)和醇胺型生物堿(如新烏頭原堿、附子靈、宋果靈)。其中單酯型平均占比59.07%,醇胺型平均占比29.48%。

表5 不同批號附子生物堿類成分含量測定

3.4 活性生物堿成分及治療靶點

Swiss Target Prediction中12個生物堿共預(yù)測到254個作用靶點,去除重復(fù)靶點后有131個。GeneCards中疾病“Cancer”靶點共25 460個,選取相關(guān)性得分大于20的基因作為腫瘤疾病的靶點,共780個。藥物靶點與疾病靶點相交后得到26個附子抗腫瘤的潛在作用靶點,韋恩圖見圖3,交集靶點信息見表6。進(jìn)一步推導(dǎo)出與交集靶點相對應(yīng)的附子生物堿成分共8個,分別為苯甲酰新烏頭原堿、宋果靈、次烏頭堿、附子靈、多根烏頭堿、去甲豬毛菜堿、新烏頭原堿、尼奧靈。提示這8個生物堿可能為附子水煎液中具有潛在抗腫瘤功效的活性成分。

圖3 附子生物堿抗腫瘤韋恩圖

3.5 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

Cytoscape 3.8.2軟件繪制出了“活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,見圖4。圖中共36個節(jié)點,64條邊。左側(cè)矩形代表附子水煎液中8個具有抗腫瘤活性的生物堿成分,右側(cè)橢圓代表這些成分的抗腫瘤靶點基因。靶點的顏色越深表示度值(Degree)越大,即此靶點所連靶點的數(shù)量越多。附子的8個生物堿中,宋果靈、次烏頭堿、去甲豬毛菜堿、多根烏頭堿為其中的關(guān)鍵抗腫瘤活性成分。宋果靈對應(yīng)15個靶基因,次烏頭堿對應(yīng)5個靶基因,去甲豬毛菜堿對應(yīng)4個靶基因,多根烏頭堿對應(yīng)2個靶基因,宋果靈的抗腫瘤活性最強。26個疾病靶點中,MTAP基因?qū)?yīng)4個活性成分,ABCB1基因?qū)?yīng)2個活性成分,表明這兩個基因可能為附子生物堿抗腫瘤的關(guān)鍵作用靶點。

表6 附子生物堿抗腫瘤潛在靶點與對應(yīng)活性成分

3.6 核心靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

把在STRING數(shù)據(jù)庫中得到的蛋白相互作用信息表導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件,構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖,見圖5。使用Network Analyzer模塊進(jìn)行可視化處理分析,節(jié)點代表靶點,整個網(wǎng)絡(luò)圖中共有26個節(jié)點、103條邊,平均節(jié)點度為7.92,平均局部聚類系數(shù)為0.747。圖中顏色越深、形狀越大的基因代表其度值(Degree)越大,在整體中處于核心地位。AKT1、EGFR基因在整個網(wǎng)絡(luò)圖中處于核心位置,MTOR、ERBB2、ESR1、PIK3CA次之。說明這些靶點基因可能在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。

圖4 附子生物堿抗腫瘤的“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)

圖5 附子生物堿抗腫瘤核心靶點的相互作用關(guān)系

3.7 GO注釋分析與KEGG通路富集

DAVID數(shù)據(jù)庫中,BP共富集到118條,以P<0.05為篩選條件共有90條;CC共富集到17條,篩選后有13條;MF共富集到42條,篩選后有34條。選取BP、CC、MF中排名靠前的功能條目進(jìn)行繪圖分析,GO注釋分析圖見圖6。在生物過程層面上,這些核心靶點參與了磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Phosphatidylinositol-mediated signaling)、磷脂酰肌醇3激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控(Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling)、炎癥反應(yīng)(Inflammatory response)等生物過程;在細(xì)胞成分水平上,主要涉及了質(zhì)膜(Plasma membrane)、細(xì)胞核(Nucleus)、細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasm);在分子功能層面上,主要存在蛋白質(zhì)結(jié)合(Protein binding)、ATP結(jié)合(ATP binding)、激酶活性(Kinase activity)等功能。

圖6 附子生物堿抗腫瘤潛在靶點的GO富集分析(前10)

圖7 附子生物堿抗腫瘤潛在靶點KEGG 富集分析的10條通路

KEGG中共富集到了71條通路,以P<0.05為篩選條件,共篩選到70條。按富集的顯著程度選取排名靠前的通路進(jìn)行繪圖分析,KEGG通路富集圖見圖7。圖中,顏色越深的點代表其富集程度越顯著。缺氧誘導(dǎo)因子1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)、腫瘤細(xì)胞中的中心碳代謝(Central carbon metabolism in cancer)為其中較為重要的幾條通路,另外還涉及到癌癥中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)的調(diào)控、胰腺癌(Pancreatic cancer)等疾病的發(fā)生發(fā)展。

4 討論

附子中主要含有三類生物堿成分：雙酯型生物堿如烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿，單酯型生物堿如苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿，醇胺型生物堿如烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿，其中雙酯型生物堿是附子中活性成分，亦是其毒性成分。去甲豬毛菜堿、多根烏頭堿、附子靈、宋果靈、尼奧靈為附子中含量較高的幾種生物堿。研究表明,附子中雙酯型生物堿(如烏頭堿、次烏頭堿)、單酯型生物堿(如苯甲酰烏頭原堿)、水溶性生物堿(如尼奧靈)均有良好的抗腫瘤活性[10-13]。由此可知,這14種生物堿可用于全面評價附子生物堿抗腫瘤方面的藥理活性。

目前對這些生物堿抗腫瘤研究,大多集中于雙酯型成分,對單酯型、醇胺型生物堿與生物堿類成分研究較少,無法全面了解附子抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究在測定過程中,發(fā)現(xiàn)3批飲片中烏頭堿和新烏頭堿含量低于百萬分之一,故未將其放入測定項。含量測定結(jié)果表明,單酯型生物堿含量在總生物堿中占比最高,醇胺型次之,雙酯型烏頭堿類成分含量較低。課題組后期含藥血清生物堿測定結(jié)果表明,醇胺型生物堿在血清中含量最高,說明煎煮可促進(jìn)雙酯型烏頭生物堿轉(zhuǎn)化,降低附子毒性而增加有效成分含量,提高臨床煎煮液的使用安全性;進(jìn)入體內(nèi)的單、雙酯型生物堿可能被進(jìn)一步代謝為毒性更小的醇胺型生物堿,成為發(fā)揮抗腫瘤藥效的關(guān)鍵性成分。本實驗明確了附子藥液中生物堿成分含量,可為附子后續(xù)入血成分的研究提供基礎(chǔ)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明,在生物堿成分與疾病相交集的26個靶基因中,我們推導(dǎo)出具有抗腫瘤活性的8個附子生物堿成分,其中宋果靈對應(yīng)的疾病靶點最多,提示宋果靈可能為其中發(fā)揮抗腫瘤藥效的關(guān)鍵性生物堿。在此26個交集靶點中,MTAP與ABCB1基因為附子生物堿抗腫瘤關(guān)鍵作用靶點。MTAP是一種抑癌基因,以往研究表明,MTAP在惡性腫瘤中經(jīng)常會選擇性缺失,其功能的缺失突變在癌癥發(fā)病機制中至關(guān)重要[14-15]。ABCB1過度表達(dá)與腫瘤多藥耐藥密切相關(guān),它可以通過泵出癌細(xì)胞的底物藥物,顯著降低某些抗癌藥物的細(xì)胞內(nèi)濃度,成為化療主要障礙[16]。

核心靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中,發(fā)現(xiàn)AKT1、EGFR基因在整個網(wǎng)絡(luò)圖中處于核心位置,是最為重要的兩個靶點蛋白。在許多腫瘤細(xì)胞中,AKT1過度表達(dá)和激活,調(diào)控細(xì)胞增殖和生長,參與細(xì)胞凋亡和代謝在內(nèi)的多種過程[17-18]。EGFR為表皮生長因子受體,在不同形式的癌癥中經(jīng)常以高水平表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞異常生長和分裂[19]。

GO注釋分析中,26個核心靶點在生物過程層面上,參與了以磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)為主的生物學(xué)過程。磷脂酰肌醇信號通路可幫助細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運,且在細(xì)胞生長、增殖及抑制細(xì)胞死亡等方面發(fā)揮重要作用。經(jīng)磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途徑是人類惡性腫瘤中最常激活的致病級聯(lián)信號之一,它的激活可以啟動一系列下游信號以支持細(xì)胞生長和增殖[20-21]。在腫瘤發(fā)展進(jìn)程中,炎癥反應(yīng)與其有密切聯(lián)系:一方面,腫瘤可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),通過分泌細(xì)胞因子(如IL-6)、趨化因子(如CXCR1)和生長因子(如TGF-β)來刺激炎癥的產(chǎn)生[22];另一方面,炎癥反應(yīng)也可以促進(jìn)腫瘤發(fā)展,炎癥信號可通過Tregs、未成熟髓細(xì)胞和其他抑制因子的作用,形成腫瘤微環(huán)境,誘導(dǎo)免疫抑制[23]。Zhang等發(fā)現(xiàn),附子聯(lián)合給藥可顯著降低放射治療誘導(dǎo)生成的TGF-β與Treg細(xì)胞，抑制炎癥反應(yīng)、增加機體免疫功能，從而減緩肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長[24]。朱瑞麗等發(fā)現(xiàn),附子中苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿可以顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中IL-6分泌,具有較好的抗炎效果[25]。由此說明附子生物堿可能通過調(diào)節(jié)PI3K信號通路與炎癥反應(yīng),抑制細(xì)胞增殖分化,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

KEGG通路富集圖中,缺氧誘導(dǎo)因子-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)、腫瘤細(xì)胞中的中心碳代謝(Central carbon metabolism in cancer)是其中最為重要的3條通路。在腫瘤微環(huán)境中,缺氧應(yīng)激反應(yīng)經(jīng)常被腫瘤細(xì)胞利用以促進(jìn)其轉(zhuǎn)移和發(fā)展,而HIF-1則是這一過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[26],它的激活有誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的趨勢[27]。許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展已被證明是雌激素依賴性的[28]。雌激素可以結(jié)合相應(yīng)受體ESR1、ESR2來刺激細(xì)胞存活、增殖或分化[29],通過干預(yù)雌激素信號通路可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡[30]。生物體能量的主要來源依賴于中心碳代謝,包括磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑以及三羧酸循環(huán)。腫瘤細(xì)胞可以利用糖酵解產(chǎn)物乳酸為燃料,促進(jìn)三羧酸循環(huán),使得乳酸鹽在葡萄糖消耗期間可以支持細(xì)胞存活、維持腫瘤代謝[31]。在細(xì)胞凋亡早期,三羧酸循環(huán)中的重要組分細(xì)胞色素C會從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì),啟動Caspase凋亡級聯(lián)反應(yīng)。邵鑫等人發(fā)現(xiàn)苯甲酰烏頭原堿能使人肺癌A549細(xì)胞的Caspase-3表達(dá)增加,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。

在附子抗腫瘤機制的現(xiàn)有研究中,認(rèn)為生物堿類成分可以通過調(diào)節(jié)自噬與凋亡、上調(diào)抑癌基因、抑制P38 MAPK與NF-κB信號通路、調(diào)節(jié)免疫發(fā)揮抗腫瘤作用[32-36]。本文的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測到附子生物堿抗腫瘤可能是通過干預(yù)MTAP、ABCB1基因,調(diào)控AKT1、EGFR蛋白表達(dá),參與磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號通路、雌激素信號通路、中心碳代謝等途徑來實現(xiàn)。目前研究證實雙酯型生物堿如烏頭堿具有這樣的生物活性和作用機制,但由于附子飲片經(jīng)水煎后,只有微量的雙酯型生物堿可進(jìn)入體內(nèi),故推測實際發(fā)揮抗腫瘤功效的成分為含量較高的單酯型與醇胺型生物堿,本研究的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)亦揭示了兩者的抗腫瘤潛力,然而目前對單酯型與醇胺型生物堿在本文預(yù)測所得機制方面的研究尚存在空缺,可以作為后續(xù)研究重點。本研究通過生物堿成分分析與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制預(yù)測,可為附子抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)及其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。