張力，李曉辰，廖太陽，王培民，邢潤麟

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)最常見的退行性疾病之一，滑膜炎癥、軟骨破壞、骨贅生成是主要病理表現(xiàn)，發(fā)病機(jī)制至今未能完全明確，因而缺乏有效的針對(duì)性治療方法。中醫(yī)學(xué)多以癥狀特點(diǎn)將其歸入“痹證”“骨痿”范疇[1-2]。軟骨破壞是KOA病理進(jìn)程中的一大核心環(huán)節(jié)。軟骨的合成與分解之間的代謝平衡，在KOA的發(fā)生發(fā)展中有著至關(guān)重要的作用，這一病理環(huán)節(jié)以軟骨細(xì)胞為中心[3]。越來越多的研究表明，從衰老角度去認(rèn)識(shí)KOA，代謝因素在其中扮演重要角色。骨性關(guān)節(jié)炎被部分學(xué)者界定為一類代謝性骨病，而代謝綜合征甚至被定義為KOA的一種常見亞型[4-5]。作為人體最大的代謝器官，肝臟在人體代謝活動(dòng)中的作用非常關(guān)鍵。肝臟主要由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(即肝細(xì)胞)組成，數(shù)量最多，是肝臟代謝功能的主要執(zhí)行者[6]。

研究表明，伴隨機(jī)體衰老，肝細(xì)胞會(huì)逐漸呈現(xiàn)出細(xì)胞衰老表型，即細(xì)胞增殖分化能力停止，但細(xì)胞的基本功能仍得以保持[7]。在形態(tài)上出現(xiàn)細(xì)胞體積增大、核內(nèi)陷、核膜溶解、染色質(zhì)異常等結(jié)構(gòu)；在功能上出現(xiàn)細(xì)胞復(fù)制能力喪失、周期停滯、衰老相關(guān)基因p16、p21、p53表達(dá)上調(diào)等[8]。這樣的病理改變被證實(shí)可推動(dòng)多類代謝性疾病進(jìn)展[9-10]?；谠贙OA軟骨退變中細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的代謝紊亂以及肝細(xì)胞衰老對(duì)代謝功能的影響，二者之間是否存在聯(lián)系引起相關(guān)學(xué)者的研究興趣。

外泌體是一類由細(xì)胞分泌、直徑在30～120 nm之間的細(xì)胞外囊泡，包裹了多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等活性物質(zhì)。其擁有富含受體的脂質(zhì)膜性結(jié)構(gòu)，可保護(hù)膜內(nèi)miRNA、LncRNA等攜帶生物信息的活性物質(zhì)在循環(huán)系統(tǒng)穩(wěn)定傳輸，介導(dǎo)細(xì)胞間通訊、并可能通過遠(yuǎn)距傳輸?shù)姆绞絽⑴c組織間對(duì)話[11]。研究表明肝細(xì)胞來源外泌體參與推動(dòng)一些代謝類疾病的進(jìn)程[12]，其對(duì)軟骨代謝紊亂和最終退變有無作用仍然未知。中醫(yī)學(xué)歷來有“肝主筋”“膝為筋之府”的基礎(chǔ)理論認(rèn)識(shí)，“柔肝養(yǎng)筋”則是最常見的中醫(yī)治膝處方選藥原則，常用藥如白芍、木瓜等[13-15]。既往有研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來源、脂肪細(xì)胞來源的外泌體對(duì)KOA軟骨細(xì)胞具有調(diào)控作用[16-18]。衰老表型肝細(xì)胞是否可能通過外泌體的分泌與軟骨細(xì)胞形成對(duì)話，進(jìn)而影響KOA軟骨細(xì)胞的代謝平衡，柔肝養(yǎng)筋類中藥是否可以在此環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，研究主要是針對(duì)此問題開展。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RNA快速提取試劑盒(貨號(hào)：RN001，上海奕杉生物科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑(貨號(hào)：R222-01、Q331-02，南京諾唯贊生物公司)，CCK-8試劑(貨號(hào)：K1018，美國APExBIO公司)，過氧化氫、PKH67(貨號(hào)：SML0790、MINI67-1KT，德國Sigma公司)，小鼠IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒(貨號(hào)：JEB-12787、JEB-12474，南京金益柏生物科技有限公司)，兔多克隆p16、p21、p53抗體(貨號(hào)：AF0228、AF6290、AF0879，Affinity生物科技有限公司)，兔多克隆MMP3、MMP13，小鼠單克隆GAPDH抗體(貨號(hào)：17873-1-AP、18165-1-AP、60004-1-Ig，武漢三鷹生物科技有限公司)，兔單克隆SOX9抗體(82630，美國CST公司)、兔多克隆ADAMTS5抗體(DF13268，美國Affinity Biosciences公司)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Invitrogen Gibco公司)，JEM1230型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)，納米顆粒追蹤分析儀(德國Particle Metrix公司)，ABI 7500 qPCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)，2D蛋白電泳系統(tǒng)、超靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)LAS4000(美國GE公司)，EL800酶標(biāo)儀(美國BIOTEK公司)，熒光倒置顯微鏡攝像系統(tǒng)(德國Leica公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝原代細(xì)胞培養(yǎng)及分組 0.3%戊巴比妥鈉麻醉狀態(tài)下開放小鼠腹腔，肝葉上翻使肝臟門靜脈及下腔靜脈充分暴露。門靜脈插管，恒流泵按5 L·min-1流速生理鹽水持續(xù)灌注，剪開下腔靜脈形成回流。待肝臟呈土黃色，泵入0.2%Ⅳ型膠原酶，周身流注后夾閉下腔靜脈充分消化。隨后摘取肝葉，培養(yǎng)基中用鑷子撕開肝臟包膜，抖落肝原代細(xì)胞，梯度離心純化，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整每皿含1×107個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)箱孵育，24 h后換用無外泌體血清培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⒏渭?xì)胞隨機(jī)分為空白組、衰老組和白芍組，空白組不做特殊處理，衰老組用0.3 mmol·L-1過氧化氫孵育60 min誘導(dǎo)肝細(xì)胞衰老[19]，白芍組在過氧化氫誘導(dǎo)肝細(xì)胞衰老后用CCK-8法篩選出的最佳濃度的白芍水煎液干預(yù)24 h，實(shí)驗(yàn)中注意加入相應(yīng)體積的PBS為對(duì)照干預(yù)。

1.2.2 CCK-8法篩選白芍水煎液的最佳干預(yù)濃度 取白芍飲片(購自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)15 g，蒸餾水浸泡過夜，煎煮后旋蒸儀濃縮至15 mL，使藥液1 mL相當(dāng)于原生藥1 g藥材，過22 μm濾膜后用于干預(yù)肝細(xì)胞。肝細(xì)胞按每1×106mL-1密度預(yù)接種于96孔板，白芍水煎液梯度稀釋為10、50、100、500 μg·mL-1和1、10、100 mg·mL-1，每組6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置對(duì)照孔、空白孔，干預(yù)24 h。檢測時(shí)，每孔添加10 μL CCK-8試劑，孵育后于450 nm波長下讀取OD值。計(jì)算細(xì)胞存活率并據(jù)此確定白芍水煎液干預(yù)肝細(xì)胞的最佳濃度。

1.2.3 外泌體的提取 超速離心法提取各組肝細(xì)胞外泌體。吸取各組肝細(xì)胞上清液，30 000 r/min離心15 min以去除細(xì)胞碎屑，隨后移入超離管，PBS嚴(yán)格配平。10萬g超速離心75 min，去除上清后于離心管底部收集沉淀物(即外泌體)，PBS復(fù)溶后保存于-80 ℃冰箱，備用。

1.2.4 透射電鏡與粒徑分析 取肝細(xì)胞外泌體重懸液滴至銅網(wǎng)，10 min后濾紙吸盡重懸液，2%磷鎢酸染色2 min，再次吸盡液體后透射電鏡拍照。粒徑分析選用納米顆粒跟蹤分析系統(tǒng)檢測肝細(xì)胞外泌體粒子的直徑分布。外泌體重懸液稀釋后用NanoSight NS300儀器進(jìn)行外泌體粒徑范圍、質(zhì)量濃度的測定。

1.2.5 小鼠軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)及分組干預(yù) 脫頸法處死大鼠，開放膝關(guān)節(jié)腔。離斷前后交差韌帶后于脛骨平臺(tái)處翻折取下軟骨帽。洗凈后粉碎至1 mm3，加入4% Ⅱ型膠原酶，于培養(yǎng)箱中(37℃、5%CO2)孵育2 h，終止消化后過濾、離心、重懸、種皿，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。滿皿后正常傳代，將3～5代的軟骨細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用5 μg·mL-1的LPS干預(yù)軟骨細(xì)胞12 h以模擬KOA的炎癥微環(huán)境，將各組肝細(xì)胞上清中所收集的外泌體分別用于干預(yù)LPS致炎的軟骨細(xì)胞，并相應(yīng)的標(biāo)記為空白組、衰老組、白芍組。

1.2.6 ELISA檢測 收集LPS干預(yù)前后的軟骨細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒說明檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量。配合抗體稀釋液和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液建立標(biāo)曲并完成加樣，覆膜孵育30 min，洗滌后加入酶標(biāo)試劑，覆膜孵育30 min，洗滌后加入顯色液、終止液，酶標(biāo)儀檢測OD450值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算樣品濃度用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.7 PHK67熒光標(biāo)記 將PHK熒光指示劑調(diào)至工作濃度25 μg·mL-1，加入復(fù)溶于PBS的外泌體中染色15 min，1% BSA終止染色。隨后按前述方法重新收集染色后的外泌體，并加入預(yù)接種于6孔板的軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)箱孵育4 h，洗滌后4%多聚甲醛固定10 min，DAPI染核后熒光顯微鏡觀察攝片。

1.2.8 qPCR檢測 檢測肝細(xì)胞中衰老相關(guān)基因p16、p21、p53，及軟骨細(xì)胞中合成降解相關(guān)基因MMP3、MMP13、SOX9、ADAMTS5的mRNA表達(dá)。采用RNA快速提取試劑盒于無RNA酶環(huán)境下提取細(xì)胞總RNA。分光光度法測定RNA的濃度并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配平逆轉(zhuǎn)錄上樣量，DEPC水補(bǔ)齊至20 μL?；靹螂x心后按擴(kuò)增試劑盒說明書所需條件PCR儀擴(kuò)增。各目的基因經(jīng)GenBank檢索序列，后用Oligo v6.6軟件設(shè)計(jì)引物，上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司幫助合成。目的基因及內(nèi)參基因GAPDH序列見表1。以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 目的基因序列

1.2.9 Western blot RIPA冰上裂解，離心后BCA法測定蛋白濃度并配平加樣量。依次執(zhí)行電泳、濕轉(zhuǎn)、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h、一抗室溫孵育2 h、二抗室溫孵育2 h，最后顯色液曝光。測定條帶灰度值后以GAPDH為內(nèi)參半定量計(jì)算，用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 白芍緩解過氧化氫誘導(dǎo)的肝細(xì)胞衰老

首先，采用CCK-8法驗(yàn)證白芍水煎液對(duì)肝細(xì)胞的細(xì)胞毒性(圖1A)，結(jié)果顯示：10、50、100 μg·mL-1的白芍水煎液對(duì)肝細(xì)胞存活率沒有明顯影響，而500 μg·mL-1及1、10、100 mg·mL-1將造成肝細(xì)胞存活率的降低(P<0.05，P<0.01)，故而選定100 μg·mL-1為白芍水煎液干預(yù)肝細(xì)胞的最佳濃度。隨后用0.3 mmol·L-1過氧化氫誘導(dǎo)肝細(xì)胞衰老并觀察白芍水煎液的干預(yù)效應(yīng)，檢測肝細(xì)胞中衰老相關(guān)基因p16、p21、p53的mRNA及蛋白表達(dá)水平(圖1B～D)，結(jié)果顯示：p16、p21、p53的基因和蛋白相對(duì)表達(dá)在衰老組均高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；白芍組較衰老組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

注:A.不同劑量的白芍水煎液對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響，與10 μg·mL-1比較，*P<0.05，**P<0.01。B.各組肝細(xì)胞衰老相關(guān)基因p16、p21、p53的mRNA表達(dá)水平，與空白組比較，**P<0.01;與衰老組比較,#P<0.05，##P<0.01。C.各組肝細(xì)胞衰老相關(guān)基因p16、p21、p53的代表性蛋白條帶。D.各組肝細(xì)胞衰老相關(guān)基因p16、p21、p53的蛋白表達(dá)水平，與空白組比較，**P<0.01；與衰老組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖1 白芍緩解H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞衰老

2.2 肝細(xì)胞外泌體的鑒定

以空白組外泌體為代表，通過透射電鏡觀察所收集外泌體，并進(jìn)行粒徑分析(圖2A～B)，結(jié)果顯示：各組外泌體均呈現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)，形態(tài)大小無差異；粒徑富集均滿足40～120 nm區(qū)間，代表性粒徑富集于116.8 nm，豐度98%。以空白組外泌體為代表，選用提取外泌體后的肝細(xì)胞作為對(duì)照，檢測外泌體標(biāo)記物四旋蛋白CD9、CD63、CD81的表達(dá)情況，均為陽性表達(dá)(圖2C)。

注：A.肝細(xì)胞外泌體代表性電鏡觀察；B.肝細(xì)胞外泌體代表性粒徑分析；C.肝細(xì)胞外泌體標(biāo)記物四旋蛋白CD9、CD63、CD81的表達(dá)

圖2 肝細(xì)胞外泌體的鑒定

2.3 不同干預(yù)下的肝細(xì)胞外泌體對(duì)LPS致炎軟骨細(xì)胞的影響

ELISA法檢測軟骨細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量以確定LPS成功構(gòu)建模擬KOA炎癥環(huán)境的細(xì)胞模型(圖3)，結(jié)果顯示與空白組比較，LPS干預(yù)后細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨后用PHK67熒光指示劑觀察LPS軟骨細(xì)胞對(duì)各組肝細(xì)胞外泌體的攝入(圖4)，結(jié)果顯示：各組外泌體均被LPS軟骨細(xì)胞攝入，熒光強(qiáng)度無差異。隨后用空白組、衰老組、白芍組收集的肝細(xì)胞外泌體分別干預(yù)LPS致炎的軟骨細(xì)胞，檢測軟骨細(xì)胞中合成降解相關(guān)基因MMP3、MMP13、SOX9、ADAMTS5的mRNA和蛋白表達(dá)水平(圖5～6)，結(jié)果顯示：MMP3、MMP13、ADAMTS5基因和蛋白相對(duì)表達(dá)在衰老組均高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；白芍組較衰老組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。SOX9的基因和蛋白相對(duì)表達(dá)在衰老組均低于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；白芍組較衰老組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與空白組比較,**P<0.01。

注：×200，標(biāo)尺=500 μm。綠色熒光為PKH67染色后的 肝細(xì)胞外泌體；藍(lán)色熒光為DAPI染色的細(xì)胞核。

圖4 軟骨細(xì)胞攝入肝細(xì)胞外泌體代表性熒光圖

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)具有高發(fā)病率和致殘率，但目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究并未取得實(shí)質(zhì)進(jìn)展，具體發(fā)病機(jī)制仍未明確。軟骨破壞是KOA病程的核心環(huán)節(jié)，一旦軟骨破壞開始，這一病理進(jìn)程往往很難剎車，且進(jìn)展較快。但隨著對(duì)KOA發(fā)病特點(diǎn)以及治療后情況觀察的不斷深入，對(duì)其認(rèn)識(shí)也在逐步深入。如既往很長一段時(shí)期將KOA視作運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)單一受累的疾病，近年來逐步提出其與代謝、免疫、內(nèi)分泌等多個(gè)系統(tǒng)存在緊密關(guān)聯(lián)。其中軟骨退變作為一類衰老表現(xiàn)，其本身代謝紊亂與全身其他組織器官的代謝紊亂之間是否存在聯(lián)系，我們認(rèn)為這是切入KOA治療的一個(gè)重要契機(jī)。肝細(xì)胞是人體最大代謝器官，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的衰老是否對(duì)軟骨代謝產(chǎn)生影響，中醫(yī)“柔肝養(yǎng)筋”治法能否在此環(huán)節(jié)產(chǎn)生良性效應(yīng)及其潛在機(jī)制，這是本次研究的重點(diǎn)。

外泌體近年在細(xì)胞、組織間通訊中的作用成為研究者非常感興趣的話題。多種細(xì)胞來源的外泌體被證實(shí)對(duì)KOA軟骨細(xì)胞有影響。如Qi等研究了間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體對(duì)KOA軟骨細(xì)胞活力的影響，證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌外泌體能提高KOA軟骨細(xì)胞p38絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平，減少線粒體功能障礙，進(jìn)而抑制KOA軟骨細(xì)胞凋亡[20]。Wu等的研究證實(shí)髕下脂肪墊來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體能提高KOA軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)MMP13、ADAMTS5的表達(dá)，對(duì)KOA有軟骨保護(hù)效應(yīng)[21]。本研究針對(duì)肝細(xì)胞衰老是否能通過外泌體的分泌對(duì)KOA軟骨產(chǎn)生影響，以及經(jīng)典的“柔肝養(yǎng)筋”要藥白芍是否對(duì)此環(huán)節(jié)產(chǎn)生干預(yù)，設(shè)計(jì)了兩部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證。

注：與空白組比較,*P<0.05，**P<0.01；與衰老組比較， #P<0.05，##P<0.01。

注：與空白組比較,**P<0.01；與衰老組比較，#P<0.05，##P<0.01。

首先是利用過氧化氫誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞衰老模型，觀察白芍水煎液對(duì)肝衰老表型的干預(yù)效應(yīng)。經(jīng)CCK-8法篩選，100 μg·mL-1為白芍水煎液干預(yù)肝細(xì)胞的最佳濃度。研究結(jié)果表明，白芍水煎液能減少肝細(xì)胞衰老表型標(biāo)記物p16、p21、p53的基因和蛋白表達(dá)水平，提示白芍水煎液能夠緩解肝細(xì)胞衰老。隨后，為進(jìn)一步研究肝細(xì)胞衰老是否能通過外泌體的分泌對(duì)KOA軟骨產(chǎn)生影響，以及白芍水煎液是否對(duì)此環(huán)節(jié)形成良性干預(yù)，采用LPS刺激軟骨細(xì)胞模擬KOA炎癥環(huán)境，并分別執(zhí)行超速離心收集正常肝細(xì)胞分泌外泌體、衰老表型肝細(xì)胞外泌體、白芍水煎液干預(yù)下的衰老表型肝細(xì)胞外泌體。將所提取的各組外泌體分別作用于LPS致炎軟骨細(xì)胞，結(jié)果顯示：衰老表型的肝細(xì)胞外泌體增加LPS致炎軟骨細(xì)胞中基質(zhì)降解相關(guān)細(xì)胞因子MMP3、MMP13、ADAMTS5的表達(dá)水平，降低SOX9的表達(dá)水平，經(jīng)白芍水煎液干預(yù)的衰老表型肝細(xì)胞外泌體則可顯著改善這一結(jié)果。這樣的結(jié)果驗(yàn)證了我們有關(guān)肝細(xì)胞衰老通過外泌體的分泌促使KOA軟骨發(fā)生退變，經(jīng)典的柔肝養(yǎng)筋要藥白芍是否對(duì)此環(huán)節(jié)存在良性干預(yù)的科學(xué)假說。

我們認(rèn)為，本研究中不同組別的外泌體主要區(qū)別于囊泡內(nèi)容物，如微小RNA、蛋白、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)，它們通過激活靶細(xì)胞不同的信號(hào)通路產(chǎn)生作用，而白芍很可能改變了肝細(xì)胞衰老表型，進(jìn)而使其外泌體所攜帶的生物活性物質(zhì)發(fā)生種屬、數(shù)量的改變，從而影響軟骨細(xì)胞在炎癥刺激下的代謝平衡。下一步，我們將針對(duì)外泌體中包含多種可攜帶生物信息的活性物質(zhì)，對(duì)肝細(xì)胞外泌體作用于軟骨細(xì)胞的具體物質(zhì)做出鑒定，并結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床樣本采集，對(duì)我們的研究結(jié)果進(jìn)一步論證。