馮鵬,孫治前,羅文珍,史正剛,李玉霞,吳麗萍,尚菁,田文霞,陳靜

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院,甘肅 蘭州 730000;2.河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院,甘肅 張掖 734000;3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州 730020)

抽動穢語綜合征(Tourette syndrome,TS)又稱多發(fā)性抽動癥,是發(fā)生在兒童時期以不自主的頭面部、肢體和發(fā)聲抽動為主要特征的常見神經(jīng)精神疾病。TS因臨床癥狀難以自控,給處于生長發(fā)育階段的兒童在學(xué)習(xí)、生活和性格塑造等方面帶來了深遠的影響[1-2]。臨床證據(jù)表明有2/3的TS患兒臨床癥狀可經(jīng)藥物控制或緩解,但依然有近1/3的TS患兒癥狀波動可持續(xù)至成年,嚴(yán)重的患兒甚至出現(xiàn)自殘行為[3]。如何有效控制兒童的抽動癥狀,并能長久地保持療效,使患兒順利融入學(xué)校、社會，已成為亟待解決的問題。中醫(yī)藥治療TS臨床療效確切,得到了患兒家長的廣泛認(rèn)可[4-5]。

本課題組長期從事TS的防治研究,通過多年臨床實踐總結(jié),自擬菖蒲郁金湯治療本病,療效確切,可明顯改善抽動癥狀、減少抽動損害[6-8]。在對菖蒲郁金湯干預(yù)TS模型大鼠的研究中發(fā)現(xiàn),菖蒲郁金湯可通過調(diào)控多巴胺(Dopamine,DA)系統(tǒng)發(fā)揮抗抽動的效應(yīng),但菖蒲郁金湯是如何調(diào)控DA的具體機制尚不清楚。在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,以突觸體為研究對象,進一步明確菖蒲郁金湯抗抽動的作用機制,擬從DA神經(jīng)元突觸前釋放角度研究菖蒲郁金湯對SANRE蛋白復(fù)合體介導(dǎo)的突觸囊泡釋放DA的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康SD大鼠240只,3周齡,體質(zhì)量(60±10)g,雄性,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供,實驗動物許可證號:SCXK(甘)2015-0002。所有動物飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房,使用許可證號:SYXK(甘)2015-0005。本實驗方案經(jīng)過甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查,符合動物保護、動物福利和倫理原則,符合國家實驗動物福利倫理相關(guān)規(guī)定,審查編號:2020-257。本實驗實施過程中嚴(yán)格遵守動物使用的3R原則。

1.2 藥物及試劑

硫必利,江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),批號:20191203,規(guī)格:100 mg,藥品研磨后加生理鹽水配制成3.194 mg·mL-1混合液;自擬菖蒲郁金湯(石菖蒲10 g,郁金10 g,僵蠶8 g,蟬蛻8 g,全蝎3 g,天麻8 g,遠志8 g,天竺黃8 g,磁石20 g,石決明20 g,川牛膝10 g,焦山楂8 g)中藥飲片由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供,處方藥材煎煮制備工藝按課題組前期研究方案進行[7],濃縮藥液至生藥含量為5.152 g·mL-1。上述藥液置于4 ℃冰箱備用。

3,3′-亞氨基二丙腈(3,3′-Iminodipropionitrile,IDPN)(美國Sigma公司,批號:MKCG8873)，Percoll試劑(北京索萊寶科技有限公司,批號:1209H048)，SNAP25、Synataxin-1a、VAMP-2兔來源單抗(美國Abcam公司,批號:GR153760-1、GR3344228-2、GR3259794-3)，羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號:2004C1120)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號:20200602)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量檢測試劑盒(上海新貝生物科技有限公司,批號:F2731、F3223)。

1.3 主要儀器

透射電鏡(日本Hitachi公司,型號:HT7700);超速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:SorvallTMWX+Ultracentrifuge Series);高速離心機(美國Beckman Coulter公司,型號:Microfuge 22R);酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:Multiskan MK3)；熒光倒置顯微(日本Olympus公司,型號:IX51)；熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司,型號:IQ-5)。

2 方法

2.1 分組

由SPSS軟件生成隨機數(shù),將大鼠隨機分為空白組(60只)和造模組(180只),造模方法采用Diamond建立的腹腔注射IDPN方法[9],劑量為300 mg·kg-1·d-1;空白組腹腔注射等體積的生理鹽水,每日1次,共7 d。造模完次日進行行為學(xué)評定,當(dāng)刻板行為及運動行為評分均≥2分,表明造模成功[10],將造模成功的180只大鼠再次隨機分為模型組、硫必利組及菖蒲郁金湯組，每組60只。

2.2 給藥

造模完成后次日(即干預(yù)d0)開始,根據(jù)人-大鼠體表面積比換算[11],硫必利組給予硫必利藥液0.048 g·kg-1·d-1,菖蒲郁金湯組予以菖蒲郁金湯藥液77.28 g·kg-1·d-1(此劑量為人臨床等效劑量的4倍,前期研究此劑量抗抽動效果最佳[6]),空白組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃,每天固定9:30—10:00之間進行操作,每日1次,連續(xù)4周。

2.3 刻板、運動行為評分

將動物放入1個較大的觀察籠內(nèi),動物適應(yīng)5 min后,按照文獻的評分方法[12],在造模期間每天10:00—11:00,進行雙盲觀察(刻板行為測試和運動行為測試同時進行),5 min記錄1次,統(tǒng)計其平均分。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 行為學(xué)評分表

2.4 樣品采集、處理

在d0以及干預(yù)期間的各觀察點(d7、d14、d21、d28),每組隨機選取12只實驗動物,其中3只腹腔注射麻醉，打開胸腔,暴露心臟,于心尖處剪開心臟,經(jīng)左心室至升主動脈插管,剪開右心耳;先用生理鹽水200 mL快速灌注,直至右心房流出液體變清;然后用4 ℃、4%多聚甲醛持續(xù)灌注250 mL,灌注完畢取出腦組織,剝離紋狀體置于4 ℃、4%多聚甲醛中保存,用于免疫組化檢測蛋白。另取3只大鼠,依前法麻醉后斷頭處死,剝離紋狀體(全程在冰面上進行),置于凍存管中液氮保存,用于檢測DA含量。剩余6只大鼠麻醉后斷頭處死,迅速剝離紋狀體,用于制備突觸體(其中3只用于mRNA的檢測,另外3只用于蛋白的檢測)。

2.5 突觸體的制備

參考文獻[13-15]中的制備方法,采用Percoll密度梯度離心法制備突觸體:①在提取突觸體當(dāng)天先配制3%、10%、15%、23%Percoll梯度液,并按3%至23%的順序分層加注(梯度液配制成功后,4 ℃保存,不超過24 h),以分層后在各個梯度交界處可見銀白色為準(zhǔn)。②取2.4項下的紋狀體,用冰點均質(zhì)緩沖液反復(fù)多次洗去血液等雜質(zhì),濾紙吸干后稱質(zhì)量,按1∶9(W/V)的要求將組織剪碎放入研磨管研磨,離心(4 ℃,3 600 r·min-1,10 min),取上清液,用冰點均質(zhì)緩沖液稀釋蛋白濃度在5～7 mg·mL-1范圍內(nèi),備用。將合適蛋白濃度的上清液平鋪于3%Percoll梯度液面上(切勿擊穿梯度液),離心(4 ℃,18 000 r·min-1,5 min)后可見明顯分為5層,提取第2層(由管底向管口),即粗制突觸體,用預(yù)冷的蔗糖/EDTA緩沖液稀釋10倍,離心(4 ℃,15 000 r·min-1,20 min),棄上清液,加入等滲培養(yǎng)液,離心(4 ℃,12 000 r·min-1,5 min),洗去Percoll所得沉淀物即為純凈突觸體。

2.6 突觸體的形態(tài)學(xué)電鏡驗證

將2.5項下制備的突觸體用2.5%戊二醛固定48 h。按照透射電鏡樣品的制備方法[16]進行2%鋨酸固定,然后在梯度酒精和丙酮中脫水,樹脂浸透包埋,固化,超薄切片,醋酸鈾和枸櫞酸鉛復(fù)染,透射電鏡觀察、攝片。

2.7 ELISA法檢測紋狀體中DA含量的變化

按照ELISA試劑盒說明書測定大鼠紋狀體中DA的含量，450 nm下讀取吸光值。將樣品檢測OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得測定濃度,再乘以稀釋倍數(shù),計算得出DA濃度。

2.8 qPCR法檢測SNAP-25、Syntaxin-1a、VAMP-2 mRNA表達

將2.5項下制備的突觸體提取總RNA,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s;隨后按照qPCR試劑盒說明書進行定量檢測,擴增條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,循環(huán)40次,同時做熔解曲線,重復(fù)3次,實驗結(jié)果取CT值進行分析。引物序列依據(jù)Gen-Bank公布的序列進行設(shè)計,引物設(shè)計由大連寶生生物工程有限公司負(fù)責(zé)完成。引物詳情見表2。

表2 目的基因序列

2.9 Western blot法檢測突觸體內(nèi)SNAP-25、Syntaxin-1a、VAMP-2蛋白表達

將2.5項下制備的突觸體,按照RIPA試劑盒操作說明提取蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。按照實驗操作步驟制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜,5%BSA室溫封閉2 h。分別加入兔源SNAP-25一抗(1∶2 000),兔源Syntaxin-1a一抗(1∶2 000),VAMP-2一抗(1∶5 000),4 ℃孵育過夜,羊抗兔二抗室溫孵育2 h(1∶4 000),沖洗條帶3次,每次5 min,將條帶放入暗室,加入ECL發(fā)光液,壓片、曝光。采用Image J對蛋白條帶進行定量,以GAPDH為參照,每組實驗重復(fù)3次。

2.10 免疫組織化學(xué)法檢測紋狀體中SNAP-25、Syntaxin-1a、VAMP-2表達

取4%多聚甲醛固定的紋狀體,梯度酒精脫水后石蠟包埋,切片機連續(xù)切片,切片厚約5 μm,將切好的石蠟切片依次經(jīng)過二甲苯和梯度酒精浸泡,水化后進行抗原修復(fù),隨后用3%H2O2對切片中過氧化氫酶進行失活,5%山羊血清封閉,SNAP-25一抗(1∶250),兔源Syntaxin-1a一抗(1∶200),VAMP-2一抗(1∶200),4 ℃孵育過夜,洗滌,加生物素標(biāo)記的二抗,37 ℃孵育30 min,洗滌,加HRP標(biāo)記的鏈霉素,37 ℃孵育30 min,DAB顯色,洗滌,蘇木素染色,PBS洗滌4次,每次5 min,甘油封片,顯微鏡下觀察,Image J軟件分析光密度值。

2.11 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 突觸體形態(tài)鑒定

實驗所獲取的突觸體具有典型的突觸體“雪人”形態(tài)結(jié)構(gòu)特征[17]：結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)清晰,突觸前膜、突觸間隙、突觸后膜清晰可見,突觸線粒體輪廓完整,突觸前膜附近可見大小不一、邊界清楚的囊泡。見圖1。

注:箭頭所指為突觸間隙,★為突觸前膜,▲為突觸后膜。圖1 突觸體典型的“雪人”結(jié)構(gòu)(×15 000)

3.2 紋狀體內(nèi)DA的含量變化

干預(yù)后d0,與空白組相比,模型組、硫必利組和菖蒲郁金湯組大鼠紋狀體中DA的含量均顯著下降(P<0.01)?？瞻捉M和模型組各干預(yù)時間點(d7、d14、d21、d28)DA的含量與d0相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。硫必利組和菖蒲郁金湯組d7、d14、d21、d28的DA含量與d0相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),2組均呈升高趨勢,在各干預(yù)時間點的DA含量均高于模型組(P<0.01)。在干預(yù)d7、d14,菖蒲郁金湯組DA含量低于硫必利組(P<0.01)；在干預(yù)d21、d28菖蒲郁金湯組DA含量低于硫必利組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠紋狀體DA含量

3.3 各組大鼠突觸體內(nèi)SNAP-25、Syntaxin-1a、VAMP-2 mRNA表達比較

與空白組比較,模型組大鼠突觸體內(nèi)SNAP-25、Syntaxin-1a、VAMP-2 mRNA表達水平在各觀察點都明顯降低(P<0.01)。在d7,硫必利組、菖蒲郁金湯組各指標(biāo)mRNA表達與模型組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);在d14,菖蒲郁金湯組SNAP-25、Syntaxin-1a mRNA的表達高于模型組(P<0.05),VAMP-2 mRNA表達與模型組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);硫必利組各指標(biāo)mRNA表達與模型組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);在d21,菖蒲郁金湯組各指標(biāo)mRNA的表達高于模型組(P<0.01),硫必利組SNAP-25、Syntaxin-1a mRNA的表達高于模型組(P<0.05),VAMP-2 mRNA表達與模型組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);在d28,硫必利組、菖蒲郁金湯組各指標(biāo)mRNA的表達均高于模型組(P<0.01)。硫必利組和菖蒲郁金湯組在干預(yù)期間各觀察點大鼠突觸體內(nèi)各指標(biāo)的mRNA表達水平總體呈逐漸上升的趨勢。與d0相比，菖蒲郁金湯組從d14開始Syntaxin-1a mRNA的表達水平，差異出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01),從d21開始SNAP-25、VAMP-2 mRNA差異出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。在治療結(jié)束后(即d28)的菖蒲郁金湯組中各指標(biāo)mRNA的表達要高于硫必利組(P<0.05)。如圖2所示。

注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05, ##P<0.01;與硫必利組比較,▲P<0.05；與d0比較,圖2 各組大鼠突觸體中SNAP-25、Syntaxin-1a、 VAMP-2 mRNA的表達情況

3.4 各組大鼠突觸體SNAP-25、Syntaxin-1a、VAMP-2蛋白表達比較

Western blot結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組大鼠突觸體中SNAP-25、Syntaxin-1a、VAMP-2蛋白的相對表達在各觀察點降低(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較,硫必利組及菖蒲郁金湯組突觸體內(nèi)各指標(biāo)蛋白的相對表達在干預(yù)期間各觀察點升高(P<0.05，P<0.01),總體呈上升趨勢。在d28,菖蒲郁金湯組中SNAP-25和VAMP-2的蛋白相對表達量與硫必利組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),Syntaxin-1a的蛋白相對表達量高于硫必利組(P<0.05)。如圖3所示。

注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05, ##P<0.01;與硫必利組比較,圖3 不同時間點各組大鼠突觸體中目標(biāo)蛋白的表達情況

3.5 各組大鼠紋狀體SNAP-25、Syntaxin-1a、VAMP-2蛋白表達的比較

免疫組化結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組大鼠紋狀體的SNAP-25、Syntaxin-1a、VAMP-2蛋白的表達量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,硫必利組及菖蒲郁金湯組SNAP-25、Syntaxin-1a、VAMP-2蛋白的表達量在干預(yù)期間各觀察點顯著升高(P<0.05，P<0.01),總體呈上升趨勢。菖蒲郁金湯組和硫必利組從d7開始SNAP-25蛋白表達量與d0相比較，差異出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01),從d14開始Syntaxin-1a、VAMP-2的蛋白表達量與d0相比較，差異出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。在d21、d28菖蒲郁金湯組Syntaxin-1a的蛋白相對表達量高于硫必利組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),SNAP-25、VAMP-2的蛋白相對表達量顯著高于硫必利組(P<0.05，P<0.01),如圖4～6。

注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與硫必利組比較,▲P<0.05； 與d0比較,★圖4 各組大鼠紋狀體SNAP-25蛋白的表達

注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與d0比較,★圖5 各組大鼠紋狀體Syntaxin-1a蛋白的表達

注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與硫必利組比較, ▲▲P<0.01；與d0比較,★圖6 各組大鼠紋狀體VAMP-2蛋白的表達

圖7 SNARE蛋白復(fù)合體介導(dǎo)囊泡膜與突觸前膜融合示意圖

4 討論

TS發(fā)病機制復(fù)雜,病因眾多,目前的研究表明TS可能與遺傳、神經(jīng)遞質(zhì)失衡、免疫、社會心理及環(huán)境因素均有關(guān),國際上尚未有明確的定論。在眾多理論假說中,“神經(jīng)遞質(zhì)失衡”理論在國內(nèi)外得到了廣泛的認(rèn)可。該假說認(rèn)為TS的發(fā)生與皮質(zhì)-基底節(jié)-丘腦-皮質(zhì)回路緊密相關(guān),因回路富集了大量的神經(jīng)遞質(zhì),這些神經(jīng)遞質(zhì)在調(diào)控人體的運動能力和情感表達方面有著重大作用,其中研究較為明確的是DA[18-20]。DA是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì),與癲癇、抑郁癥、注意力缺陷多動癥等的發(fā)病密切相關(guān)[21],DA系統(tǒng)的正常運轉(zhuǎn)在其合成、釋放、轉(zhuǎn)運、代謝等方面受到調(diào)控,是目前包括退行性疾病在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域研究的重點。

DA作為神經(jīng)遞質(zhì)承擔(dān)著傳遞信息的重要任務(wù),包含有DA的突觸囊泡與突觸前膜的融合(即“胞吐”)是完成信息傳遞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[22]。囊泡融合過程涉及多種蛋白,其中SNARE蛋白是介導(dǎo)囊泡融合的核心分子,也是突觸小泡外排的核心驅(qū)動力[23-24]。SNARE蛋白復(fù)合體由SNAP-25、VAMP-2以及Syntaxin-1a共同組成[25]，三者通過組裝成為四股螺旋復(fù)合物可以拉近囊泡和突觸前膜的距離,同時復(fù)合體形成過程中所產(chǎn)生的能量可以促進融合孔的形成,促使突觸小泡與突觸前膜完全融合,隨后DA得以釋放到突觸間隙中(圖7),因此SNARE復(fù)合體各組分蛋白的表達異常會直接影響DA的釋放[26]。Verhage等[27]將由干擾SNARE復(fù)合體以及相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白功能引起的腦部疾病定義為SNARE病。于佳等[28]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對突觸體相關(guān)蛋白進行分析驗證，發(fā)現(xiàn)可以通過調(diào)節(jié)SNARE蛋白復(fù)合體的表達進而影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,這被認(rèn)為是抗抑郁的新機制和新靶點。臨床研究顯示VAMP-2基因變異后可出現(xiàn)發(fā)育遲緩、孤獨癥、行為障礙、癲癇等[29]。裴青等[30]的實驗表明Syntaxin-1a的過表達導(dǎo)致培養(yǎng)的神經(jīng)元突觸密度增加,而抑制Syntaxin-1a的表達則影響突觸的大小。有研究觀察到SNAP-25基因敲除的小鼠胞吐作用嚴(yán)重受損[31],而SNAP-25的表達異常可導(dǎo)致精神分裂癥、注意力缺陷多動癥的出現(xiàn),說明其在神經(jīng)發(fā)育中起到重要且多樣的作用[32]。綜合以上信息表明SNARE蛋白復(fù)合體中各組分蛋白的表達異?？赡苁嵌喾N神經(jīng)精神類疾病發(fā)病的機制。

本研究關(guān)注點集中在DA突觸前釋放,并以突觸體為研究對象,更加精準(zhǔn)地反映出DA突觸前釋放的情況,以明確菖蒲郁金湯對TS抗抽動作用的機制。結(jié)果表明模型組由于IDPN的影響導(dǎo)致DA的釋放量較空白組明顯降低,這與之前文獻的報道一致[33]。伴隨著DA的降低，SNAP-25、Syntaxin-1a和VAMP-2 mRNA和蛋白的表達量都有明顯的下降,并在菖蒲郁金湯的干預(yù)下有所回調(diào),同時DA含量隨著干預(yù)時間的延長而升高。實驗初步證實了菖蒲郁金湯能夠調(diào)控SNARE蛋白復(fù)合體的表達,改善DA神經(jīng)元突觸前釋放的功能,從而影響腦內(nèi)DA的含量,進而產(chǎn)生抗抽動的作用。DA的釋放需要SNARE蛋白復(fù)合體的介導(dǎo)來完成胞吐的過程,但是SNARE復(fù)合體的組裝又受到其他蛋白調(diào)控,如鈣離子信號蛋白、CPX蛋白、Munc18-1、Munc13-1等,課題組將在今后的實驗中進一步完善并明確其關(guān)系。