李慶瑾，隋志遠(yuǎn)，張繼虎，張志帥，高慶華，邢 鳳

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300）

阿片黑素促皮質(zhì)激素原（proopiom elanocortin，POMC）是位于下丘腦弓狀核（ARC）的前皮質(zhì)醇，是動(dòng)物腦和垂體中多種活性肽類和激素的共同前體，如促腎上腺皮質(zhì)激素[1-2]。POMC神經(jīng)元是位于下丘腦內(nèi)的重要組成部分，分泌的多肽如β-內(nèi)啡肽在哺乳動(dòng)物繁殖活動(dòng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。雞POMC基因首先被克隆，人POMC基因在2號(hào)染色體2p23位點(diǎn)上，包含3個(gè)外顯子，含有2個(gè)CpG島[3]。家兔POMC在2號(hào)染色體上，編碼區(qū)由249個(gè)氨基酸組成[4]。POMC表達(dá)由垂體和下丘腦中不同且獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子控制，牛POMC基因在11號(hào)染色體上，長(zhǎng)度為7 479 bp，有 3 個(gè)外顯子[5]。

動(dòng)物POMC基因在下丘腦、腦垂體、腦干、皮膚、淋巴系統(tǒng)等組織中含量較高。Liu K.等[6]研究發(fā)現(xiàn)POMC在雞的下丘腦、垂體等表達(dá)，在垂體中表達(dá)量最高，該基因的多態(tài)性與雞的繁殖性狀相關(guān)。馬淑慧等[7]還證實(shí)POMC基因表達(dá)量與綿羊毛色的生成有一定的相關(guān)性。周梅等[8]研究發(fā)現(xiàn)在小尾寒羊和蘇尼特羊垂體中POMC基因表達(dá)最高，其次是下丘腦，在其他組織中均微量表達(dá)。杜富寬等[9]對(duì)刀鱭的POMC基因進(jìn)行了克隆及表達(dá)分析，其cDNA序列長(zhǎng)度為1 212 bp，具有699 bp的開放閱讀框，編碼232個(gè)氨基酸，POMC在健康刀鱭的腦高表達(dá)，在鰓、腎、精巢相對(duì)高表達(dá)，在肝、脾、腸、頭腎、肌肉和卵巢中微表達(dá)。

在初情期時(shí)，機(jī)體通過抑制或興奮下丘腦促性腺激素釋放激素（GnRH）神經(jīng)元脈沖式釋放GnRH啟動(dòng)初情期；Kisspeptin是GnRH釋放的一個(gè)強(qiáng)有力的刺激因子[10]，POMC系統(tǒng)可以通過一個(gè)包含ARCKisspeptin神經(jīng)元的網(wǎng)絡(luò)間接地刺激GnRH神經(jīng)元以啟動(dòng)初情期[11]。在初情期啟動(dòng)的過程中，鴨下丘腦POMC的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，POMC表達(dá)的下調(diào)對(duì)初情期啟動(dòng)起協(xié)同作用[12]。

研究表明POMC與動(dòng)物的初情期具有一定的關(guān)聯(lián)性[12]，但POMC基因與綿羊初情期啟動(dòng)關(guān)聯(lián)性的研究還較少。母羊初情期是指母羊首次發(fā)情并排卵的年齡，是母羊獲得繁殖能力的標(biāo)志[13]，母羊初情期越早，就越早能進(jìn)行配種，繁殖性能越高[14]。多浪羊是新疆羊肉優(yōu)良風(fēng)味的典型代表，是新疆典型的早熟品種，4～5月齡達(dá)到初情期，6～8月齡可初配[15]。因此，本項(xiàng)目以多浪羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其POMC基因cDNA進(jìn)行克隆，利用Real-time PCR（qPCR）技術(shù)分析下丘腦、垂體和卵巢中POMC基因在初情期時(shí)的表達(dá)情況，為進(jìn)一步揭示POMC基因在多浪羊初情期啟動(dòng)中的作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及發(fā)情鑒定

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：30只未發(fā)情多浪羊母羊，年齡、體重相近，選自新疆五征綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。母羊90日齡后開始進(jìn)行初情期外觀察看，早晚各放入公羊試情1～2 h。評(píng)定母羊發(fā)情的標(biāo)準(zhǔn)為母羊以下表現(xiàn)：興奮不安、對(duì)外界刺激非常敏感、頻排尿、外陰紅腫有黏液、靜立接受公羊爬跨。

1.1.2 樣品采集

對(duì)于達(dá)到初情期發(fā)情期的5只母羊進(jìn)行屠宰，迅速采集初情期的多浪羊大腦、下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管、脾、肺和腎等9種組織，立即將新鮮的組織放入5 mL凍存管中，并置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成

將上述采集的組織樣品取50～100 mg加入液氮研磨，采用Trizol-酚-氯仿一步法提取上述采集組織的總RNA，此步驟全程在冰上進(jìn)行，然后對(duì)總RNA濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用天根試劑盒對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以合成 cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為 25 μL，包括總 RNA 2 μL，oligo（dT）18（0.25 μg/μL）2 μL，dNTPs（2.5 mmol/μL）2 μL 和 RNase free H2O 7 μL，然后 65 ℃ 5 min，冰浴 2 min。再加入 5×First strand Buffer 4 μL，DTT（0.1 mmol/μL）1 μL，RNase inhibitor（40 U/μL）1 μL，Supperscript TM Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）0.6 μL，RNase free H2O 5.4 μL。

1.2.2 引物合成及PCR擴(kuò)增

參考NCBI上公開的綿羊POMC基因mRNA序列（NP_001009266.1）設(shè)計(jì)引物，見表1，提取卵巢組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后對(duì)多浪羊POMC基因的cDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為:Premix 12.5 μL，10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μL，cDNA 1 μL，9.5 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 20 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。利用1.2%的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和完整性。將擴(kuò)增出來的產(chǎn)物回收、克隆測(cè)序，測(cè)序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，最后對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)及分析。

1.2.3 多浪羊POMC基因表達(dá)分析

根據(jù)前期測(cè)序得到的多浪羊POMC基因cDNA序列跨設(shè)計(jì)引物（表1），用qPCR試劑盒檢測(cè)POMC基因在下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管和子宮中的表達(dá)水平，以ACTB基因作為內(nèi)參基因。qPCR反應(yīng)體系：2×SG Green qPCR Mix 7.5 μL，10 μmol/L 的上下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 5.5 μL；qPCR 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性10 min，95℃變性20 s，退火60℃30 s，40個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸5 min。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，定量完成后得到不同樣本的Ct值，利用2-ΔΔCt法計(jì)算POMC基因相對(duì)表達(dá)量，最終的結(jié)果用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行單因素方差分析顯著性比較，P20.05（差異顯著）、P20.01（差異極顯著）為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

表1 基因克隆及定量PCR引物Table 1 Primers used for POMC gene cloning and qPCR

1.2.4 多浪羊POMC同源性比較及發(fā)育樹構(gòu)建

利用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后，用BLAST程序?qū)⒖寺〉玫降男蛄信cNCBI公布的綿羊POMC基因參考序列進(jìn)行同源性檢索。利用SignalP5.0在線分析軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)POMC氨基酸序列進(jìn)行潛在信號(hào)肽預(yù)測(cè)。采用MEGA5.0軟件對(duì)POMC基因氨基酸序列基于遺傳距離的鄰接法（NJ）構(gòu)建遺傳距離進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 多浪羊POMC基因cDNA克隆

以多浪羊卵巢組織總RNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序獲得兩條POMC cDNA序列（圖1），分別長(zhǎng)1 078、1 108 bp，兩條序列的CDS完全一樣，大小為792 bp，該CDS編碼263個(gè)氨基酸，與第一個(gè)相比，第二個(gè)5'UTR有一個(gè)143 bp的插入。

圖1 多浪羊卵巢POMC基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 The result of POMC PCR products in Duolang sheep

2.2 POMC序列同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI中獲得綿羊、牛和山羊等6個(gè)物種的POMC氨基酸序列，利用DNAMAN軟件將多浪羊POMC氨基酸序列（圖2）與這6個(gè)物種的序列進(jìn)行同源性比較（圖3），比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)多浪羊POMC氨基酸序列與綿羊和其他物種的序列表現(xiàn)出相當(dāng)高的同源性，與綿羊（NP_001009266.1）、牛（NP_776576.1）、山羊（XP_017911043.1）的同源性分別為99.62%、96.6%、96.3%；與豬（AAB32312.1）、馬（XP_014586753.2）、人（AG46625.1）的同源性分別為89.51%、83.08%以及79.78%。

圖2 多浪羊POMC基因編碼區(qū)及氨基酸序列Figure 2 Duolang sheep POMC gene CDS and deduced amino sequences

圖3 不同物種間POMC氨基酸序列比較Figure 3 Comparison of POMC amino acid sequences among different species

利用SignalP 5.0軟件對(duì)多浪羊POMC氨基酸進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果表明多浪羊POMC蛋白1～26氨基酸為其信號(hào)肽部分。利用MEGA5.0軟件制作了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），顯示多浪羊POMC氨基酸與綿羊、山羊、牛的親緣關(guān)系極近，與人、豬、馬的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Figure 4 Phylogenetic rooted tree analysis

2.3 多浪羊POMC基因組織表達(dá)譜分析

利用半定量RT-PCR檢測(cè)了多浪羊POMC基因在大腦、下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管、脾、肺和腎9種組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示（圖5），POMC基因在檢測(cè)的組織中均表達(dá)，其中在垂體和下丘腦中的表達(dá)量相對(duì)較高，其他組織中的表達(dá)量相對(duì)較弱。

圖5 POMC基因9種組織表達(dá)譜Figure 5 POMC gene expression profiles in nine tissues

2.4 多浪羊POMC基因在初情期時(shí)不同組織中mRNA表達(dá)水平分析

為了研究多浪羊POMC基因mRNA在初情期不同組織的中的表達(dá)規(guī)律，進(jìn)一步對(duì)達(dá)到初情期的多浪羊5個(gè)相關(guān)生殖組織即卵巢、下丘腦、垂體、輸卵管和子宮的表達(dá)情況進(jìn)行了real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖6所示，垂體中POMC基因的表達(dá)量顯著高于其他組織（P20.05），下丘腦中POMC基因表達(dá)量顯著高于卵巢、輸卵管及子宮（P20.05），該基因在生殖軸相關(guān)的下丘腦、垂體中高表達(dá)，推測(cè)其可能參與調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸，并且對(duì)多浪羊初情期發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。

圖6 POMC基因在5種組織中的表達(dá)量Figure 6 POMC gene relative mRNA levels in the five tissues

3 討論

3.1 哺乳動(dòng)物POMC基因序列分析

哺乳動(dòng)物POMC基因在結(jié)構(gòu)和序列上均表現(xiàn)高度保守性，在哺乳動(dòng)物的下丘腦、垂體中高表達(dá)，在睪丸間質(zhì)細(xì)胞、卵巢細(xì)胞及免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中也有表達(dá)，對(duì)于動(dòng)物生殖和代謝等功能具有十分重要的作用[2-3]。

POMC基因cDNA序列在多種哺乳動(dòng)物中已被克隆出來[16]，本研究對(duì)多浪羊POMC基因進(jìn)行克隆及序列分析，多浪羊POMC基因有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，第一條長(zhǎng)1 078 bp，第二條長(zhǎng)1 108 bp。這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的不同是在5′UTR，可變剪接可以形成不同的轉(zhuǎn)錄本，它在真核生物中普遍存在[17]，本試驗(yàn)POMC由于可變剪接也可能形成了兩種不同的轉(zhuǎn)錄本。將多浪羊POMC氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)其與綿羊、牛、山羊的同源性均在96%以上，與豬、馬、的同源性在83%以上，與人的同源性為79.78%，說明多浪羊POMC氨基酸序列與牛、山羊、馬等哺乳動(dòng)物的同源性均較高，該基因在物種進(jìn)化過程中高度保守，功能穩(wěn)定。

3.2 POMC基因表達(dá)與綿羊初情期等繁殖性能關(guān)系

POMC基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中廣泛分布[18]。周梅等[8]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)POMC基因在小尾寒羊和蘇尼特羊垂體中表達(dá)量最高，而大腦、小腦、卵巢輸卵管和子宮中表達(dá)量比較低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，POMC在多浪羊垂體中的表達(dá)量是最高的，其次是下丘腦，在卵巢、輸卵管、子宮、腎、肺、脾和大腦中的表達(dá)水平很低。本研究結(jié)果與周梅等研究結(jié)果一致[8]，而下丘腦、垂體對(duì)綿羊發(fā)情相關(guān)激素GnRH、FSH、LH的分泌有調(diào)節(jié)作用，梁慧慧等[19]研究發(fā)現(xiàn)在哈薩克羊下丘腦POMC基因表達(dá)可以通過直接或間接的途徑參與GnRH的分泌與合成，可能是參與調(diào)節(jié)哈薩克羊發(fā)情相關(guān)通路的重要基因。綜上所述，我們推測(cè)POMC基因也可能參與多浪羊下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)，對(duì)多浪羊初情期的啟動(dòng)發(fā)揮一定的作用。

4 結(jié)論

本研究通過基因克隆獲得多浪羊POMC基因兩條cDNA序列，通過同源性比較與綿羊、牛、山羊、豬，馬、人的同源性較高，說明該基因在進(jìn)化過程中功能穩(wěn)定。在多浪羊初情期中，POMC分別在下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）的垂體中顯著性表達(dá)，其次在下丘腦中也有高表達(dá)，表明POMC對(duì)多浪羊初情期的調(diào)控發(fā)揮一定的作用，這對(duì)于進(jìn)一步探索POMC與綿羊初情期間的關(guān)系提供了科學(xué)的理論依據(jù)。