向曉波 嚴履冰 周艷萌

(1. 遵義醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔外科，貴州遵義563000；2.遵義醫(yī)科大學2017級，貴州遵義563000；3.遵義醫(yī)科大學微生物學與免疫學實驗室，貴州遵義563000)

高效廣譜抗生素的廣泛使用、免疫抑制劑濫用、艾滋病及血液系統(tǒng)惡性腫瘤等因素，造成真菌感染率和致死率不斷增長，其中白色念珠菌(Candidaalbicans)就是真菌性感染的常見病原體之一[1]，同時也是最常見的醫(yī)院獲得性真菌感染的病原體，常在植入的醫(yī)療器械上形成生物膜，導致致命的播散性疾病[2]。目前唑類和多烯類抗生素是治療白色念珠菌感染的主要藥物，這些藥物均存在一定的毒性，且長期使用可導致白色念珠菌耐藥性不斷增強[3]。白色念珠菌的一個關(guān)鍵毒力因子是其在酵母和菌絲體兩種形態(tài)之間可以進行形態(tài)轉(zhuǎn)化，此能力在組織入侵、抵抗吞噬和生物膜形成中起著重要作用。生物膜具有引發(fā)或延長感染的潛力，并對傳統(tǒng)抗真菌治療產(chǎn)生高水平的耐藥性[4-5]。近來研究[6-8]顯示，中藥及中藥提取物在抗生物膜方面具有較好的作用。中藥厚樸(Mangnolia officinalis)為木蘭科木蘭屬植物厚樸或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮及枝皮?，F(xiàn)代藥理試驗[9]證明，厚樸具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗炎、保護心腦血管、抗?jié)円约翱鼓茸饔?。田玉珠等[10]發(fā)現(xiàn)和厚樸酚對白色念珠菌黏附及其生物膜的形成及厚度均有抑制作用。筆者前期的研究[11-12]顯示，厚樸冷浸液對白色念珠菌早期黏附和中期生物膜形成有抑制作用，厚樸酚通過抑制白色念珠菌的早期黏附而有效降低其致病性，并對已形成的生物膜具有明顯的抑制作用。本課題組擬在前期研究的基礎上，進一步探討厚樸煎劑抗白色念珠菌的作用機制，為厚樸用于臨床抗真菌感染提供基礎實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

白色念珠菌 (Candidaalbicans10231,C.albicans,10231) 標準株由遵義醫(yī)科大學醫(yī)學微生物學與免疫學實驗室饋贈。

1.1.2 藥物與試劑

芽管液體培養(yǎng)基按照參考文獻[13]制備；厚樸購于遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中藥局；酵母蛋白胨葡萄糖 (yeast peptone glucose，YPG) 液體培養(yǎng)基依據(jù)文獻[14]配制；沙氏瓊脂培養(yǎng)基(sabouraud agar medium，SDA)購于杭州濱和微生物試劑有限公司；LIVE/DEAD細菌活力檢測試劑盒(L13152)購于賽默飛世爾公司；異硫氰酸熒光素標記的刀豆蛋白 A(FITC-conA)購于美國Sigma公司;SYBR Premix Ex.TaqTM熒光定量 PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司；CFX96型實時熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1C.albicans菌懸液的制備

白色念珠菌劃線接種于SDA上，培養(yǎng)后挑取單個菌落再劃線接種于SDA培養(yǎng)基分離純化3次，然后挑取單個菌落轉(zhuǎn)種于YPG液體培養(yǎng)基中，37 ℃、90 r/min 搖床培養(yǎng)過夜活化2次，血細胞計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整菌液濃度至2× 106個/mL，備用。

1.2.2 藥物的配制

60 g厚樸粉末加入1 600 mL三蒸水中,煎煮3次，收集3次的液體混合并濃縮至400 mL獲得厚樸煎劑(0.15 g/mL)保存液，無菌濾器過濾并分裝放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時，將厚樸煎劑稀釋成 250、125、62.5、31.25、15.625 mg/L。

1.2.3 芽管形成試驗

實驗組以2×106個/mL的菌液1 mL與上述各濃度藥液1 mL混合，空白對照組以1 mL菌液與1 mL芽管液體培養(yǎng)基混合，每組3支復管，37 ℃培養(yǎng)30 h離心去上清，用100 μL 0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液(以下簡稱生理鹽水)重懸，每管取10 μL 涂片革蘭染色，顯微鏡下計數(shù)100個菌中正常芽管數(shù)和受抑制芽管數(shù)(正常芽管長度一般超過菌體直徑 2 倍及以上，受抑制芽管長度小于或等于菌體直徑)，計算均值和芽管生成率(芽管生成率=帶芽管的白色念珠菌數(shù)目/100)[13]。實驗重復3次。

1.2.4 厚樸煎劑對白色念珠菌早期黏附基因1(agglutinin-likesequencefamily，ALS1)、ALS2、ALS3的影響

1.2.4.1 樣品的制備

白色念珠菌轉(zhuǎn)種于YPG液體培養(yǎng)基中37 ℃搖床培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，用芽管液體培養(yǎng)基調(diào)整菌濃度為2×106個/mL，以每瓶80 mL分裝于克氏瓶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置90 min，吸棄上清，無菌PBS洗3次，實驗組分別加入31.25、15.625、7.812 5 mg/L厚樸煎劑，空白對照組加入等量的芽管液體培養(yǎng)基，37 ℃ 靜置培養(yǎng)1 h，吸棄培養(yǎng)基，用生物膜刮刀刮下黏附在瓶壁上的菌體，收集后離心去上清，用DEPC水洗1次，離心棄上清備用。

1.2.4.2 提取RNA

取沉淀用Novelase消化液懸重，室溫消化10 min后，每管沉淀中加入1 mL Trizol，按照Trizol試劑說明書提取總RNA，紫外分光光度法測定RNA 的濃度。

1.2.4.3 引物及其合成

根據(jù)文獻[15]中ALS1、ALS2、ALS3的基因序列，采用Primer Premier 6.0 軟件設計檢測白色念珠菌ALS1 mRNA、ALS2 mRNA、ALS3 mRNA 和 18 S-RNA 的實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)引物(表1)，各引物由上海生工生物工程公司合成。

表1 特異引物序列和PCR產(chǎn)物長度

1.2.4.4 qRT-PCR定量分析

以1 μg總 RNA 為模板，反應參數(shù)：95 ℃30 s；95 ℃5 s、60 ℃ 10 s，39個循環(huán)。每個基因6個復管，實驗重復3次。實驗以18S RNA 為內(nèi)參，qRT-PCR 數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法評估管家基因和ALS1、ALS2、ALS3的表達水平。

1.2.5 熒光顯微鏡觀察厚樸煎劑對白色念珠菌成熟期生物膜的影響

無菌1 cm×1 cm的蓋玻片用胎牛血清浸泡12 h備用。蓋玻片放入24孔板，每孔加入上述菌液1 mL，37 ℃靜置培養(yǎng)72 h，形成白色念珠菌成熟期生物膜，用 PBS 洗3次去除浮游菌，實驗組每孔加入0.5 mL上述濃度厚樸煎劑和0.5 mL芽管液體培養(yǎng)基，空白對照組加入1 mL芽管液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，用無菌PBS 洗3次去除浮游菌，每孔加入20 μL FITC-conA室溫避光染色1 h，冷PBS洗3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察厚樸煎劑對白色念珠菌成熟期生物膜的影響

生物膜制備同上，15.625 mg/L厚樸煎劑處理48 h，PBS 洗3次去除浮游菌后，3%(體積分數(shù))戊二醛固定4 h，PBS 洗4次，每次15 min；去除PBS，加入1%(質(zhì)量分數(shù))四氧化鋨于旋轉(zhuǎn)器上固定1.5 h，再用蒸餾水漂洗4次，每次10 min；以梯度乙醇脫水后，樣本先放于臨界點干燥儀中干燥，再將樣本放于真空鍍膜機中噴金，然后于掃描電鏡下觀察。

1.2.7 激光共聚焦顯微鏡觀察厚樸煎劑對白色念珠菌成熟期生物膜內(nèi)菌活力的影響

按照上述方法制備72 h生物膜，15.625 mg/L厚樸煎劑處理48 h，PBS洗3次去除浮游菌后，每孔加10 μL SYT09/PI室溫避光染色30 min，用激光共聚焦顯微鏡488 nm氬激光進行激發(fā)，PI發(fā)射波長635 nm，鏡下為紅光；SYT09發(fā)射波長500 nm，鏡下為綠光。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度厚樸煎劑對白色念珠菌芽管形成的影響

白色念珠菌革蘭染色呈陽性，顯微鏡下空白對照組(0 mg/L)白色念珠菌以交織成網(wǎng)的真菌絲為主，同時伴有少量的圓形或卵圓形的芽生孢子及假菌絲；各濃度厚樸煎劑均可抑制白色念珠菌的芽生孢子、假菌絲及真菌絲的形成，且抑制作用具有濃度依賴性(圖1A)。芽管計數(shù)結(jié)果顯示，隨厚樸煎劑濃度的升高受抑制芽管數(shù)量增加，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1B)。

圖1 不同濃度厚樸煎劑對白色念珠菌芽管形成的影響Fig.1 Effect of Magnolia officinalis decoction with different concentrations on germ tube formation of Candida albicansA: effects of different concentrations of Magnolia officinalis decoction on germ tube formation of Candida albicans(Gram staining)，scale bar=5 μm; B: inhibitory rate of Magnolia officinalis decoction at different concentrations on germ tube of Candida albicans; *P<0.05 vs control group(0 mg·L-1).

2.2 厚樸煎劑對白色念珠菌早期黏附基因相對表達量的影響

黏附早期，空白對照組ALS3基因的表達最高，ALS2基因其次，ALS1基因表達最低，實驗所用3個濃度厚樸煎劑均能使ALS1、ALS2、ALS3 mRNA的表達下調(diào)，且具有濃度依賴性，與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表2，圖2。

表2 厚樸煎劑對白念珠菌黏附基因相對表達量的影響

圖2 厚樸煎劑對白色念珠菌早期黏附基因相對表達量的影響Fig.2 Effect of Magnolia officinalis decoction on relative expression of early adhesion gene of Candida albicans *P<0.05 vs control group;ALS： agglutinin-like sequence family.

2.3 不同濃度厚樸煎劑對白色念珠菌成熟生物膜的影響

FITC-conA與生物膜中的胞外多糖結(jié)合，熒光顯微鏡下呈綠色熒光?？瞻讓φ战M隨培養(yǎng)時間的延長生物膜不斷增厚，而厚樸煎劑作用24、48和72 h后白色念珠菌生物膜結(jié)構(gòu)被破壞，72 h鏡下主要見散在的孢子相白色念珠菌，未見片狀生物膜(圖3～圖5)。SEM觀察15.625 mg/L厚樸煎劑作用48 h后對生物膜的影響，空白對照組白色念珠菌生物膜由分泌物包裹芽體、交織成網(wǎng)的菌絲形成，藥物組生物膜的結(jié)構(gòu)被破壞，鏡下白色念珠菌以孢子相為主，孢子失去典型形態(tài)，大小不均，表面有分泌物包裹，同時可見少量被抑制的菌絲(圖6)。

圖3 不同濃度厚樸煎劑作用24 h對白色念珠菌生物膜的影響Fig.3 Effect of Magnolia officinalis decoction on Candida albicans biofilm for 24 hours (scale bar=20 μm)

圖4 不同濃度厚樸煎劑作用48 h對白色念珠菌生物膜的影響Fig.4 Effect of Magnolia officinalis decoction on Candida albicans biofilm for 48 hours (scale bar=20 μm)

圖5 不同濃度厚樸煎劑作用72 h對白色念珠菌生物膜的影響Fig.5 Effect of Magnolia officinalis decoction on Candida albicans biofilm for 72 hours (scale bar=20 μm)

圖6 掃描電鏡觀察厚樸煎劑作用48 h對白色念珠菌生物膜的影響Fig.6 Effect of Magnolia officinalis decoction for 48 hours on Candida albicans biofilm was observed by SEMSEM: scanning electron microscope.

2.4 厚樸煎劑對白色念珠菌成熟期生物膜內(nèi)菌活力的影響

共聚焦顯微鏡下，死菌被PI 染色發(fā)紅色熒光, 活菌被SYT09染色發(fā)綠色熒光，橙色為死活菌重疊所致?？瞻讓φ战M白色念珠菌主要為交織成網(wǎng)的菌絲，以活菌為主，僅見少量死菌；15.625 mg/L厚樸煎劑作用48 h后，白色念珠菌以孢子相為主，死菌數(shù)量明顯增加，可見少量被抑制的菌絲(圖7)。

圖7 厚樸煎劑作用48 h對白色念珠菌生物膜內(nèi)菌活力的影響Fig.7 Effect of Magnolia officinalis decoction for 48 h on bacterial activity in Candida albicans biofilm (scale bar=20 μm)A-C： Candida albicans is mainly mycelium； D-F： Candida albicans is mainly spore phase

3 討論

中藥湯劑是我國應用最多、最早的一種劑型，其制法簡單，用水為溶劑，起效較快，目前在中醫(yī)臨床仍然廣泛使用，而中藥濃煎劑則是在中藥湯劑的基礎上發(fā)展起來的，它是將單方或復方的中草藥經(jīng)水煎煮，濃縮成一定容量的液體制劑[16]。本研究制備中藥厚樸煎劑，探討其對白色念珠菌的芽體、菌絲及生物膜的作用。念珠菌病是最常見的侵襲性真菌感染，目前在全球醫(yī)院中侵襲性真菌感染排第三至第四位，而白色念珠菌仍然是念珠菌病的主要病因[17]。白色念珠菌是一種二相性真菌，從形態(tài)上分為酵母相和菌絲相，在一些因素的誘導下，酵母相可以向菌絲相轉(zhuǎn)換[18]，菌態(tài)轉(zhuǎn)換是白色念珠菌由定殖菌向致病菌轉(zhuǎn)變的一種標志，與白色念珠菌致病性和生物膜形成密切相關(guān)[19-20]。本研究用芽管形成試驗觀察厚樸煎劑對白色念珠菌菌態(tài)轉(zhuǎn)換的影響，結(jié)果顯示通過抑制白色念珠菌芽管、假菌絲和真菌絲的形成以及酵母細胞的增殖，從而抑制白色念珠菌發(fā)生菌態(tài)轉(zhuǎn)換，芽管計數(shù)結(jié)果提示厚樸煎劑對白色念珠菌芽管的抑制作用具有濃度依賴性。白色念珠菌生物膜的發(fā)育過程可分為四個主要階段:黏附、增殖、成熟和擴散[17]，黏附階段是其形成生物膜與致病的基礎，因此抑制黏附是抗白色念珠菌生物膜感染的關(guān)鍵措施，而芽管的形成可以提高白色念珠菌的組織侵襲性和黏附力，厚樸煎劑抑制芽管形成說明其可以抑制白色念珠菌的黏附[21]。白色念珠菌黏附性主要由其細胞表面蛋白黏附素完成，白色念珠菌ALS基因家族編碼的黏附素參與了該菌對宿主的黏附和生物膜的形成。以往的研究[22]表明ALS1、ALS2、ALS3在白色念珠菌體外生物膜形成過程中呈優(yōu)勢表達。因此本實驗進一步檢測了厚樸煎劑對ALS1、ALS2、ALS3基因的影響，qRT-PCR結(jié)果提示厚樸煎劑作用后可下調(diào)3個基因的表達，說明厚樸煎劑可能是通過下調(diào)白色念珠菌早期黏附基因的表達從而影響其早期黏附；同時ALS1還是菌絲形成關(guān)鍵基因之一，厚樸煎劑作用后ALS1的下調(diào)導致白色念珠菌菌絲形成受到抑制。

真菌生物膜是指真菌黏附于惰性或活性實體的接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等物質(zhì)，將其自身包繞其中而形成的大量真菌聚集膜樣物，主要組成為菌絲[1]。本研究制備的白色念珠菌成熟期生物膜，在熒光顯微鏡下空白對照組生物膜由大量菌絲交織呈片狀，而厚樸煎劑作用后隨著藥物濃度的增加及作用時間延長，未見大片狀生物膜，鏡下主要為孢子相白色念珠菌；掃描電鏡觀察生物膜發(fā)現(xiàn)空白對照組生物膜以分泌物包裹菌絲為主，15.625 mg/L 的厚樸煎劑作用48 h后，生物膜結(jié)構(gòu)被破壞，鏡下多見孢子相白色念珠菌，在菌體表面也包裹有分泌物，菌體大小不一。進一步在共聚焦顯微鏡下觀察厚樸煎劑對成熟期生物膜中菌活力的影響，發(fā)現(xiàn)空白對照組以菌絲和活菌為主，而15.625 mg/L的厚樸煎劑組以孢子相為主，且死菌數(shù)量明顯增加。共聚焦顯微鏡和芽管形成試驗說明厚樸煎劑可能是通過破壞成熟期生物膜的結(jié)構(gòu)，然后進入生物膜內(nèi)抑制芽管的形成從而發(fā)揮殺菌作用的。

綜上所述，厚樸煎劑早期可通過下調(diào)ALS1、ALS2、ALS3基因抑制白色念珠菌發(fā)生菌態(tài)轉(zhuǎn)換和生物膜的形成，同時可以破壞成熟期生物膜的結(jié)構(gòu)從而促進藥物進入生物膜內(nèi)抑制芽管形成并發(fā)揮殺菌作用。但是實驗中沒有進一步檢測影響菌絲形成的基因、影響生物膜形成的信號通路等，因此厚樸煎劑對白色念珠菌菌絲形成及其生物膜的作用機制還需進一步驗證。