李 寧 尹延旭 余楚英 高升華 王 飛* 焦春海 姚明華

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢430064； 2. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 武漢 430064）

辣椒（Capsicum annuumL.）是我國(guó)栽培面積最大的蔬菜作物，年種植面積約為213.33萬(wàn)hm2（3 200萬(wàn)畝），總產(chǎn)量6 399.4萬(wàn)t，辣椒產(chǎn)業(yè)已成為我國(guó)最大的蔬菜產(chǎn)業(yè)。湖北省是我國(guó)辣椒主產(chǎn)區(qū)之一，受湖北氣候特點(diǎn)影響，辣椒生長(zhǎng)過(guò)程中極易受高溫和多種病蟲(chóng)害威脅，其中細(xì)菌性瘡痂病、根結(jié)線蟲(chóng)病等就是主要發(fā)生的流行性病蟲(chóng)害。

辣椒細(xì)菌性瘡痂?。˙acterial Spot Disease）由黃單胞桿菌屬細(xì)菌（Xanthomonas campestris pv vesicatori, Xcv）引起，是鄂西高山辣椒生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重影響辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。應(yīng)用辣椒瘡痂病抗源基因、培育抗病品種是解決瘡痂病危害最為有效的途徑。辣椒對(duì)瘡痂病菌的抗性為質(zhì)量性狀，與瘡痂病菌的互作遵循“gene for gene”假說(shuō)。前期研究中，已明確了湖北省辣椒瘡痂病菌優(yōu)勢(shì)生理小種為P0，因此應(yīng)用Bs2和Bs3抗源基因，轉(zhuǎn)育、聚合、創(chuàng)制抗性育種材料能夠有效克服瘡痂病的危害。

根結(jié)線蟲(chóng)是危害辣椒生產(chǎn)的重要土傳蟲(chóng)害，培育抗病品種是解決根結(jié)線蟲(chóng)危害最為有效的途徑。目前至少有11個(gè)抗根結(jié)線蟲(chóng)基因被鑒定，其中Me1、Me2、Me3、Me4、Me7和Mech1基因是耐熱的Me基因，Me1、Me3和Me7有廣譜抗性[1-2]。研究表明，Me1是一個(gè)抗性非常持久的基因，它不能夠被毒性或者非毒性線蟲(chóng)小種侵染；利用22種番茄Mi基因的非毒性小種及毒性小種試驗(yàn)也表明Me1抗所有毒性和非毒性小種[3-5]。因此，轉(zhuǎn)育和應(yīng)用Me1抗性基因?qū)苯房垢Y(jié)線蟲(chóng)育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

辣椒材料“墨麗-M-1”（原始編號(hào)：P5114）為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所課題組選育的核心親本自交系，果實(shí)為長(zhǎng)羊角椒，果面光亮，果皮呈墨綠色，中熟材料，耐熱，株型直立，綜合性狀優(yōu)良；經(jīng)接種鑒定抗根結(jié)線蟲(chóng)，同時(shí)分子標(biāo)記檢測(cè)攜帶Me1基因。

甜椒材料“ECW20R”和“ECW30R”為抗瘡痂病鑒別寄主，分別攜帶Bs2和Bs3抗性基因，是從甜椒材料“ECW”選育出的近等基因系材料，來(lái)源University of Florida，由Stall Robert 教授提供。

辣椒瘡痂病病原菌來(lái)源華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，由王猛教授提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間雜交、回交及配組試驗(yàn) 自2014年春季開(kāi)始材料創(chuàng)制工作。首先，“ECW20R”和“ECW30R”進(jìn)行雜交，獲得同時(shí)攜帶Bs2和Bs3抗源基因的材料“ECW2030R”；再以“墨麗-M-1”為母本，以“ECW2030R”為父本，獲得F1；以“墨麗-M-1”為輪回親本，利用與Bs2和Bs3基因連鎖的基因標(biāo)記進(jìn)行回交后代的選擇，同時(shí)進(jìn)行園藝性狀的選擇和人工接種鑒定。經(jīng)過(guò)連續(xù)回交5代和自交3代，育成兼抗瘡痂病和根結(jié)線蟲(chóng)的辣椒種質(zhì)。2018年春季進(jìn)行雜交配組試驗(yàn)，篩選出配合力優(yōu)良的雜交組合進(jìn)行品比試驗(yàn)。

1.2.2 辣椒抗瘡痂病和根結(jié)線蟲(chóng)的分子標(biāo)記輔助選擇 與辣椒抗根結(jié)線蟲(chóng)Me1基因連鎖標(biāo)記參照Berthou等[6]和Wang 等[7]描述。與辣椒抗瘡痂病Bs2基因連鎖基因標(biāo)記參照Truong等[8]，與Bs3基因連鎖基因標(biāo)記由本課題開(kāi)發(fā)[9]。具體分子標(biāo)記序列信息見(jiàn)表1描述。

表1 本試驗(yàn)所用的分子標(biāo)記序列信息

基因組DNA提取參照Porebski等[10]的方法略有改進(jìn)。PCR擴(kuò)增體系參照Berthou 等[6]、Wang 等[7]和Truong 等[8]文中描述，PCR產(chǎn)物檢測(cè)參照李寧等[11]描述，用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 辣椒抗瘡痂病抗性接種鑒定 辣椒抗瘡痂病接種方法參照李寧等[12]描述，分別采用注射接種和噴霧接種兩種方法。將保存的瘡痂病病原菌菌株在YDC平板培養(yǎng)基上劃線，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑選單菌落，用無(wú)菌水分別配制成濃度約為108cfu/mL的菌懸液。接種苗齡為4 片真葉，接種濃度為2×108cfu/mL。

注射接種法，在苗子長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，注射接種上述配制好的菌懸液，對(duì)照植株的葉片用滅菌水，葉片上接種2～3 mm大小的斑，然后放置在溫室（28 ℃）中，觀察注射區(qū)域是否有壞死斑出現(xiàn)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，能夠很快鑒定材料抗/感。

噴霧接種法，在苗子長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，噴霧接種后置于人工氣候室內(nèi)，溫度設(shè)定為28 ℃，相對(duì)濕度 85%，光照 14 h/d（70 μmol/m2/s），15 d后觀察單株抗性水平進(jìn)行分級(jí)，然后計(jì)算病情指數(shù)。

瘡痂病病情分級(jí)及病情指數(shù)計(jì)算參照湖北省地方標(biāo)準(zhǔn)《辣椒瘡痂病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》（DB42/T 1698—2021）描述[13]。

1.2.4 辣椒耐熱性鑒定 辣椒耐熱性鑒定方法參照鞏振輝等[14]和余楚英[15]描述的鑒定方法，略有改動(dòng)。幼苗長(zhǎng)6～7片真葉時(shí)，選取辣椒從上往下第4片功能葉，打葉盤(pán)至裝有30 mL蒸餾水中，一式兩份分別放置25 ℃和40 ℃的人工氣候箱中，連續(xù)光照處理24 h。辣椒離體葉圓片耐熱性鑒定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照鞏振輝等[14]描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 種質(zhì)創(chuàng)新過(guò)程

湖北省辣椒瘡痂病菌優(yōu)勢(shì)生理小種為P0，根據(jù)Stall 等[16]的鑒別寄主表，Bs2和Bs3抗源基因均對(duì)P0生理小種表現(xiàn)為抗性，能夠用于抗瘡痂病育種實(shí)踐中。以攜帶抗原基因的鑒別寄主材料“ECW20R”和“ECW30R”進(jìn)行雜交，聚合獲得同時(shí)攜帶Bs2和Bs3抗源基因的材料“ECW2030R”的F1雜交種（圖1）?！癊CW2030R-F1”可以看作“ECW”的近等基因系材料，與“ECW”具有相同的園藝學(xué)特征，果形方燈籠形，但后代在Bs2和Bs3位點(diǎn)呈現(xiàn)Bs2Bs2、Bs2Bs3和Bs3Bs3的分離。

圖1 墨麗-M-Bs23/Me1R創(chuàng)制系譜圖

“墨麗-M-1”為“鄂椒墨麗”的母本，是本課題組選育的核心育種材料，攜帶抗根結(jié)線蟲(chóng)Me1基因。以“墨麗-M-1”為母本，“ECW2030R”為父本，獲得聚合Bs2和Bs3基因的三交種F1代，果形為雙親本中間型，呈長(zhǎng)燈籠形；以“墨麗-M-1”為輪回親本，利用與Me1基因（圖2）和Bs2、Bs3（圖3、圖4）基因連鎖的基因標(biāo)記進(jìn)行回交后代的選擇，同時(shí)進(jìn)行園藝性狀的選擇，重點(diǎn)選擇果形。在BC1F1～BC4F1代中果形分離明顯，但隨著回交代數(shù)的增加，果形逐漸偏向輪回親本“墨麗-M-1”；在BC5F1代果形大體穩(wěn)定，與“墨麗-M-1”基本一致。進(jìn)一步自交純化2代，果形與“墨麗-M-1”一致；同時(shí)進(jìn)行Bs2和Bs3基因分子標(biāo)記篩選，在候選的單株中均能同時(shí)檢測(cè)到Bs2和Bs3基因，也可證明材料已基本趨于穩(wěn)定，將該材料命名為“墨麗-MBs23/Me1R”。同時(shí)，對(duì)BC5F3各株系進(jìn)行抗瘡痂病人工接種鑒定，其抗性鑒定結(jié)果與分子鑒定的結(jié)果相吻合。種質(zhì)轉(zhuǎn)育創(chuàng)制的過(guò)程具體見(jiàn)圖1。

圖2 引物SCAR_CD的檢測(cè)結(jié)果

圖3 引物14F/R的檢測(cè)結(jié)果

圖4 引物Bs3F/R的檢測(cè)結(jié)果

2.2 “墨麗-M-Bs23/Me1R”的植物學(xué)特征及配合力

創(chuàng)制的材料“墨麗-M-Bs23/Me1R”果實(shí)果形與“墨麗-M-1”一致，同時(shí)BC5F3各株系整齊度好，花期和開(kāi)花節(jié)位一致（圖5）。

圖5 墨麗-M-Bs23/Me1R的植株特征

分別利用“墨麗-M-Bs23/Me1R”和“墨麗-M-1”為母本，與“鄂椒墨麗”的父本“THI-P-22-1”進(jìn)行雜交，獲得F1代。對(duì)“墨麗-M-Bs23/Me1R×THI-P-22-1”和 “墨麗-M-1×THI-P-22-1”的雜交組合的果實(shí)商品性、單果質(zhì)量、產(chǎn)量、首花節(jié)位進(jìn)行比較，“墨麗-M-Bs23/Me1R×THI-P-22-1”和 “墨麗-M-1×THI-P-22-1”間的差異不顯著。

表2 轉(zhuǎn)育抗病材料與回交親本配組比較

2.3 “墨麗-M-Bs23/Me1R”及其輪回親本抗性鑒定

在“墨麗-M-1”和“墨麗-M-Bs23/Me1R”的幼苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，注射接種配制好的瘡痂病菌懸液，對(duì)照植株的葉片用滅菌水，葉片上接種2～3mm大小的斑，然后放置在溫室（28 ℃）中，接種24 h后，“墨麗-M-Bs23/Me1R”的注射區(qū)域有壞死斑出現(xiàn)，表現(xiàn)出抗病，而“墨麗-M-1”則不能誘導(dǎo)HR反應(yīng)。15 d后統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，“墨麗-M-1”病情指數(shù)為59.23(A)，“墨麗-M-Bs23/Me1R”的病情指數(shù)為7.31(B)。誘導(dǎo)壞死反應(yīng)及病情指數(shù)的鑒定結(jié)果均顯示，“墨麗-M-Bs23/Me1R”對(duì)辣椒瘡痂病菌表現(xiàn)為抗性，這也與分子檢測(cè)的結(jié)果一致。

在“墨麗-M-1”和“墨麗-M-Bs23/Me1R”的幼苗長(zhǎng)至六葉一心時(shí)，選取辣椒從上往下第4片功能葉，打葉盤(pán)至裝有 30 mL蒸餾水中，一式兩份分別放置25℃和40℃的人工氣候箱中處理。結(jié)果顯示，“墨麗-M-1”和“墨麗-M-Bs23/Me1R”均呈現(xiàn)葉圓片邊緣輕度失綠的癥狀，統(tǒng)計(jì)計(jì)算熱害指數(shù)，分別為11.32(a)和13.14(a)，二者差異不顯著（圖 6）。

圖6 “墨麗-M-1”和“墨麗-M-Bs23/Me1R”的耐熱性鑒定

3 結(jié)論

（1）根據(jù)Bs3基因啟動(dòng)子區(qū)在抗病材料ECW30R與感病材料ECW的序列差異，開(kāi)發(fā)了Indel標(biāo)記引物Bs3F/R；該標(biāo)記對(duì)抗感瘡痂病材料的鑒定結(jié)果與人工接種鑒定結(jié)果完全一致，能夠準(zhǔn)確鑒定出Bs3基因。

（2）利用與辣椒抗瘡痂病Bs2、Bs3基因和抗根結(jié)線蟲(chóng)Me1基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記，能夠準(zhǔn)確快速的從回交群體中篩選出目標(biāo)性狀材料，極大的提高育種的準(zhǔn)確率、預(yù)見(jiàn)性和效率。

（3）創(chuàng)制出耐熱兼瘡痂病和根結(jié)線蟲(chóng)雙抗的辣椒種質(zhì)“墨麗-M-Bs23/Me1R”，具有輪回親本“墨麗-M-1”的特征，配合力高，商品性優(yōu)。