倪春輝，李惠霞，劉永剛，韓 變，石明明，魏雪娟，李文豪，徐雪芬

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室, 甘肅 蘭州 730070；2 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護研究所, 甘肅 蘭州 730070)

莖屬線蟲DitylenchusFilipjev隸屬于動物界Animalia線蟲門Nematode墊刃目Tylenchida?？艫nguinidae[1]，已報道的莖屬線蟲近100種[2]，但目前被承認的莖屬線蟲有效種只有60多個[3]。與其他線蟲相比，莖屬線蟲具有食性較廣的特點，多數(shù)種以真菌為食，只有少數(shù)種可以侵染高等植物。一般為害植物的塊莖、球莖和鱗莖，也可為害地上部分，引起組織變色、壞死、腐爛和畸形，造成重大的經(jīng)濟損失[4]。莖屬線蟲中危害較大的有水稻莖線蟲D.angustus、鱗球莖線蟲D.dipsaci、腐爛莖線蟲D.destructor、非洲莖線蟲D. africanus與食菌莖線蟲D.myceliophagus[2,5]。其中，鱗球莖線蟲、腐爛莖線蟲和水稻莖線蟲，可對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重危害[5]。鱗球莖線蟲寄主范圍超過500種，主要發(fā)生于氣候溫和地帶，危害植物鱗莖及地上部分[6]。腐爛莖線蟲可侵染200多種植物，主要發(fā)生于溫帶地區(qū)，為害植物地下部分，在缺少高等植物的情況下還可取食多種真菌[7]。2014年Zhang等[8]在中國花生主要種植地區(qū)發(fā)現(xiàn)1種新的莖線蟲，并將其鑒定為花生莖線蟲D. arachis。

中藥黨參為桔?？艭ampanulaceae植物黨參Codonopsis pilosula(Franch) Nannf、素花黨參C.pilosula(Franch) Nannf.var.modesta (Nannf.)L.T.Shen或川黨參(C. tangshenOliv.)的干燥根，主要功效為補血、降壓、補中益氣、增強機體抵抗能力、增加血紅蛋白與紅細胞、治療貧血和降低血壓等[9]。在甘肅省，黨參主要產(chǎn)于定西、隴南、天水和平?jīng)龅鹊?，產(chǎn)量約占全國產(chǎn)量的70%和出口量的80%，已成為甘肅省農(nóng)民增收的重要經(jīng)濟作物之一[10]。目前，已報道的危害黨參的莖線蟲僅有腐爛莖線蟲[11]。2019年甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院線蟲實驗室在甘肅黨參主產(chǎn)區(qū)調(diào)查黨參線蟲病發(fā)生分布時，發(fā)現(xiàn)1種與腐爛莖線蟲差異較大的莖線蟲群體，本文擬通過形態(tài)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，明確黨參中分離的莖線蟲分類地位，為該線蟲的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試線蟲分離自甘肅省渭源縣(104° 15′5.76″E，35° 11′ 30.84 ″N)黨參病樣。

1.2 方法

1.2.1 線蟲分離 將黨參病樣沖洗干凈，自然晾干后拍照觀察。采用改良貝曼漏斗法[12]分離線蟲，將病根切成約1 cm小段，放入漏斗內(nèi)鋪墊的兩層面巾紙上，加水浸沒黨參根段。10～12 h后，收集指形管中的線蟲懸浮液，備用。

將線蟲懸浮液移入1.5 mL離心管，用有效氯為5 g/L的 NaClO溶液消毒2 min后，3 000 r/min離心2 min，棄上清液，隨后將下層線蟲懸浮液用無菌水沖洗2～3遍。以5 g/L硫酸鏈霉素與5 g/L氨芐青霉素混合液消毒10 min后，再次離心，吸出消毒液，無菌水沖洗3遍后定容，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆茫椒▍⒖嘉墨I[13]。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 參照謝輝等[14]方法將線蟲溫?zé)釟⑺拦潭ê螅贏xio Lab.A1顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)下觀察形態(tài)特征，并進行形態(tài)特征測量，參照文獻[2,7]方法計算測量值。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 參照王江嶺等[15]方法略有改進，提取單條線蟲DNA。挑取單條雌蟲于無菌水中清洗3遍，然后挑入裝有10 μL 線蟲裂解液(Worm lysis buffer，WLB)的 200 μL PCR 反應(yīng)管中，離心后依次在液氮中處理1 min，85 ℃水浴2 min，步驟重復(fù)2次。隨后加入1 mg/mL蛋白酶K 1 μL，于PCR儀中65 ℃溫育1 h，保持95 ℃ 10 min使蛋白酶K失活，14 000 r/min離心5 min，最后于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用線蟲ITS區(qū)通用引物18S：5′-TTGATT ACGTCCCTGCCCTTT-3′、26S：5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′[16]與 TW81：5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′、AB28：5′-ATATG-CTTAAGTTCAGCGGGT-3′[17]；28S 區(qū)引物 D2A：5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′與 D3B：5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′[18]，對線蟲ITS-rDNA、28S D2/D3基因序列進行PCR擴增。反應(yīng)采用25 μL體系：上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，2× SanTaqFast PCR Master Mix (含藍色染料) 12.5 μL(上海生工)，DNA 模板 3 μL，ddH2O 7.5 μL。

擴增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 10 s， 55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，38 個循環(huán)；72 ℃ 5 min，于 4 ℃ 條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送往北京擎科西安分公司測序，使用軟件SeqMan進行序列拼接，于NCBI進行BLAST比對，下載相似性較高的序列，以BI法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：使用MAFFT比對分析后，用DAMBE檢測飽和度，用軟件MrMTgui連接PAUP與MrModelTest進行模型選擇，最后使用Mrbayes以最佳模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用FigTree修正發(fā)育樹。

1.2.4 特異性引物PCR擴增 參照Zhang等[19]花生莖線蟲ITS區(qū)特異性引物DARF (5′-GGGAAGGCGAAGCTAAGCTA-3′) 與 DARR(5′-AACTTAGAGGCCAACGAAGCC-3′)，對“1.2.3”中提取的DNA模板和腐爛莖線蟲群體DNA模板進行 PCR 擴增，擴增程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 10 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，38 個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。取5 μL擴增產(chǎn)物用25 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

1.2.5 ITS-rDNA區(qū)段PCR-RFLP分析 選用DdeⅠ、HinfⅠ、Tru9Ⅰ(MseⅠ)、SduⅠ這 4 種內(nèi)切酶，參照Subbotin等[20]的方法對線蟲ITS-rDNA區(qū)PCR產(chǎn)物進行酶切。酶切體系20 μL：PCR純化產(chǎn)物 8 μL，內(nèi)切酶 (10 U/μL)1 μL，與內(nèi)切酶相對應(yīng)的Buffer 2 μL，ddH2O 9 μL。37 ℃ 條件下反應(yīng) 1.5 h，以腐爛莖線蟲作為對照。反應(yīng)產(chǎn)物用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。使用在線軟件Wbcuter 2.0(http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html)分析酶切片段長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)描述

雌蟲：蟲體圓柱形，兩端較細，經(jīng)溫?zé)釟⑺篮蟪省癑”字型，尾部稍向腹部彎曲(圖1A)。唇區(qū)低平，稍有溢縮?？卺橀L8.2～9.8 μm。中食道球梭形，有瓣?；壳蜉^發(fā)達(圖1B)，半月體較清晰，位于排泄孔前1至數(shù)個體環(huán)處(圖1C)。食道腺稍覆蓋于腸背部。側(cè)線6條。陰門橫裂，稍有突起，位于蟲體后端。單生殖腺前伸，后陰子宮囊發(fā)達，長度是肛陰距的55%。尾部向末端逐漸變窄，端圓(圖1D、1G)。

圖1 花生莖線蟲的光學(xué)顯微鏡結(jié)果Fig. 1 Light photomicrographs of Ditylenchus arachis

雄蟲：除生殖系統(tǒng)外，與雌蟲相似。交合刺后端向腹面彎曲，引帶較短；交合傘明顯，較長，自交合刺前端向后延伸，約至尾長的70%(圖1E)。

2.2 形態(tài)特征指標(biāo)

對分離得到的莖線蟲群體進行形態(tài)特征測量，將其測量值與花生莖線蟲河北群體測量值進行比較(表1)，甘肅黨參莖線蟲群體與花生莖線蟲河北群體的形態(tài)特征測量均值雖存在差異，其中，甘肅黨參莖線蟲群體除體長、陰門至頭端的長度與體長的比值、尾長均值略大外，其他均值均略小。但是所有測量范圍值基本一致，故根據(jù)形態(tài)學(xué)特征初步將甘肅黨參莖線蟲群體鑒定為花生莖線蟲。

表1 甘肅黨參莖線蟲群體與河北原始群體測量值比較1)Table 1 Morphometrics comparison of Ditylenchus arachis population from Codonopsis pilosula in Gansu with original Hebei population of D. arachis

2.3 特異性引物檢測

采用花生莖線蟲特異性引物對甘肅黨參莖線蟲群體與腐爛莖線蟲群體進行PCR擴增，結(jié)果(圖2)顯示，甘肅黨參莖線蟲群體擴增條帶為150～200 bp，符合花生莖線蟲特異性引物擴增條帶長度(171 bp)，而腐爛莖線蟲未擴增到任何片段。

圖2 甘肅黨參莖線蟲群體與腐爛莖線蟲ITS特異性引物擴增電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of PCR products amplified from Ditylenchus arachis from Codonopsis pilosula in Gansu and D. destructor using species-specific ITS primers

2.4 分子生物學(xué)特征

采用線蟲ITS區(qū)通用引物18S、26S與TW81、AB28雙向測序后拼接序列，比對后得到引物TW81、AB28擴增的具體序列長度，為816 bp，上傳至NCBI獲得序列號為MW207369和MW207370。28S區(qū)引物D2A與D3B雙向測序后拼接序列，得到序列長度為777 bp，上傳至NCBI，獲得序列號為MW207367和MW207368。NCBI中BLAST比對發(fā)現(xiàn)，甘肅黨參莖線蟲群體ITS-rDNA序列與河北花生莖線蟲群體KX426050序列相似性為99.75%，僅存在2個堿基差異；28S D2/D3區(qū)序列與河北花生莖線蟲群體KX426054序列相似性為100%，無堿基差異。

基于ITS-rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3A)，甘肅黨參莖線蟲群體與花生莖線蟲聚為一枝，與腐爛莖線蟲聚為一大枝，結(jié)果表明甘肅莖線蟲群體ITS-rDNA序列與花生莖線蟲親緣關(guān)系最近，其次為腐爛莖線蟲，與其他莖屬線蟲距離較遠。

圖3 基于 ITS-rDNA (A) 和28s D2/D3 (B)的甘肅黨參莖線蟲(GSDA1、GSDA2)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of stem nematode (GSDA1、GSDA2) from Codonopsis pilosula in Gansu Province based on ITS-rDNA (A) and 28s D2/D3 (B)

采用貝葉斯法構(gòu)建28S D2/D3區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3B)。結(jié)果顯示，甘肅黨參莖線蟲群體與花生莖線蟲聚為一支，與腐爛莖線蟲聚為一大支，表明甘肅黨參莖線蟲群體28S D2/D3區(qū)序列與花生莖線蟲親緣關(guān)系最近，其次為腐爛莖線蟲，與其他莖屬線蟲距離較遠。據(jù)此，將甘肅黨參莖線蟲群體鑒定為花生莖線蟲。

2.5 ITS-rDNA區(qū)段PCR-RFLP分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載花生莖線蟲序列KX426050，使用軟件BioEdit與線蟲ITS-rDNA通用引物TW81/AB28比對，截去序列兩端，得到以引物TW81/AB28擴增的花生莖線蟲序列。以軟件Wbcuter 2.0使用4種內(nèi)切酶DdeⅠ、HinfⅠ、SduⅠ、Tru9Ⅰ(MseⅠ)對甘肅黨參莖線蟲群體、花生莖線蟲與腐爛莖線蟲進行酶切，得到酶切片段數(shù)量及大小(表2)。由表2可知，甘肅黨參莖線蟲群體與花生莖線蟲群體酶切片段大小一致，且明顯區(qū)別于腐爛莖線蟲。以內(nèi)切酶DdeⅠ、HinfⅠ、Tru9Ⅰ(MseⅠ)和SduⅠ對甘肅黨參莖線蟲群體與腐爛莖線蟲ITS-rDNA區(qū)PCR純化產(chǎn)物進行酶切，結(jié)果如圖4所示，結(jié)果與使用軟件Wbcuter 2.0的酶切結(jié)果一致，甘肅黨參莖線蟲群體與腐爛莖線蟲群體酶切結(jié)果存在明顯差異。

表2 軟件Wbcuter酶切甘肅黨參莖線蟲和腐爛莖線蟲ITS序列結(jié)果Table 2 Enzyme digestion results of Ditylenchus arachis population from Codonopsis pilosula in Gansu and D. destructor ITS sequences by Wbcuter bp

圖4 腐爛莖線蟲(A)與甘肅黨參莖線蟲(B)ITS-rDNA區(qū)段PCR-RFLP結(jié)果Fig. 4 Electrophoresis of ITS-rDNA amplified by PCR-RFLP for Ditylenchus destructor (A) and D. arachis population in Gansu (B)

3 討論與結(jié)論

莖線蟲屬是植物線蟲病害中一類重要的病原，也是最難進行種類鑒定的屬之一，大多數(shù)種類的特征描述仍然存在著不完善的問題[2,4]?；ㄉo線蟲病普遍發(fā)生于我國花生主產(chǎn)區(qū)，一段時間誤認為是腐爛莖線蟲為害，章淑玲[21]對采集到的線蟲群體，進行形態(tài)特征與分子特征的比對分析，發(fā)現(xiàn)該種雖與腐爛莖線蟲親緣關(guān)系較近，卻與腐爛莖線蟲存在差異，明顯區(qū)別于其他莖屬線蟲，將其命名為花生莖線蟲D. arachis。本研究對采集的甘肅黨參莖線蟲群體進行鑒定，通過形態(tài)特征與分子特征比對分析，發(fā)現(xiàn)該線蟲群體形態(tài)特征與花生莖線蟲相符，形態(tài)測量值除體長、陰門至頭端的長度與體長比、尾長均值略大外，其他測量值均值均略小，但是所有測量范圍基本一致，差異可能是地理環(huán)境因素造成的。通過ITS-rDNA與28S D2/D3區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)甘肅黨參莖線蟲群體與花生莖線蟲群體聚為一支，明顯區(qū)別于腐爛莖線蟲?；ㄉo線蟲特異性引物PCR擴增與ITS-rDNA區(qū)段PCR-RFLP結(jié)果顯示，甘肅黨參莖線蟲群體與花生莖線蟲群體ITS-rDNA區(qū)段無明顯差異。綜上所述，將甘肅黨參莖線蟲群體鑒定為花生莖線蟲。

花生莖線蟲主要為害花生地下部分，發(fā)病植株呈現(xiàn)矮化、黃化癥狀，嚴重時可導(dǎo)致全株枯死，植株地下部分表現(xiàn)出根系發(fā)育不良、固氮根瘤減少、結(jié)莢數(shù)減少、果莢表面呈黑褐色腐爛斑、種皮褐變皺縮等癥狀，線蟲可侵染花生的果莢、種粒、胚栓及根莖，研究表明，2年內(nèi)干燥的果莢和種皮還可分離出線蟲[22]。本研究采集的發(fā)病黨參，蘆頭部表面呈黑褐色腐爛斑、表皮褐變皺縮等癥狀，與花生莖線蟲為害花生果莢癥狀相似，但由于分離得到的線蟲群體較少，未得到大量繁殖群體，致病性測定困難，故花生莖線蟲是否為害黨參及為害時具體癥狀需要進一步研究。

研究表明該線蟲適生性強、食性廣、抗逆性強，對其他作物有潛在危害風(fēng)險，是一種危害較大的病原線蟲[23-25]。該線蟲經(jīng)緩慢脫水處理，在-80 ℃條件下保存35 d后，仍有部分線蟲可以復(fù)蘇為害[24]。花生性喜溫暖，種子萌發(fā)溫度較高，生長最適溫度為23～30 ℃[26-27]。黨參喜冷涼濕潤氣候，最適溫度18～20 ℃[28]。渭源縣黨參種植區(qū)溫度較低，由于采集環(huán)境存在較大差異，本研究采集線蟲群體與河北地區(qū)花生莖線蟲群體在致病性、適生性等方面是否存在差異，有待進一步研究分析。

本研究對甘肅省渭源縣黨參病樣中分離的莖線蟲，結(jié)合形態(tài)特征與分子特征進行鑒定，將其鑒定為花生莖線蟲，結(jié)果表明花生莖線蟲已在甘肅省定殖。甘肅省渭源縣以中藥材和馬鈴薯為主要經(jīng)濟作物，其產(chǎn)品為地下塊根和塊莖，而線蟲主要為害植物地下部，因此，應(yīng)該對該地區(qū)線蟲病害予以足夠的重視。