李珂 李京 賀西京 王爽 郝丹丹 朱峪

骨肉瘤是一種以增殖腫瘤細(xì)胞直接產(chǎn)生骨或骨樣組織為特點(diǎn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤，發(fā)病率為（4～5）/106。青少年時(shí)期是骨肉瘤的發(fā)病高峰期，約在15 歲左右，以原發(fā)性骨肉瘤為主[1]。骨肉瘤可以發(fā)生在任何骨中，最常見(jiàn)的部位為長(zhǎng)骨干骺端，尤其是股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端[2]，手術(shù)治療聯(lián)合新輔助化療是目前臨床常用的治療方法[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路在多種腫瘤中均有異常表達(dá)，如胃癌、肝癌、乳腺癌等[4-6]。有研究表明，Notch 通路的過(guò)度活化在骨肉瘤中也存在，能夠介導(dǎo)骨肉瘤的增殖和遷移侵襲能力[7-8]。DAPT是一種-分泌酶抑制劑，能夠阻斷Notch 信號(hào)通路的激活。本研究通過(guò)檢測(cè)DAPT 對(duì)體外培養(yǎng)的人骨肉瘤143B 細(xì)胞和MG63 細(xì)胞以及體內(nèi)異種移植瘤模型的影響，探究Notch 信號(hào)通路對(duì)143B 細(xì)胞和MG63 細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，為骨肉瘤的治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

人骨肉瘤細(xì)胞株143B 和MG63（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所）。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素（P&S）（Gibco 公司，美國(guó)），PBS、胰蛋白酶購(gòu)自Hyclone，-分泌酶抑制劑DAPT（Sigma 公司，美國(guó)），用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成50 mM 的儲(chǔ)存液分裝備用，使用時(shí)用DMEM 培養(yǎng)基稀釋?zhuān)籎agged1 活性肽（序列：CDYYYGFGCNKFCRPR，10 M，GenScript）以10 M 的最終濃度加入到培養(yǎng)液中；DMSO、4%多聚甲醛（PFA）、結(jié)晶紫溶液、Triton X-100、牛血清白蛋白（BSA）和BrdU（B5002，10 M）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購(gòu)自APExBIO。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素（P&S）的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)143B 細(xì)胞和MG63 細(xì)胞，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每48 h 更換培養(yǎng)液1 次。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的143B 細(xì)胞和MG63 細(xì)胞，制成1.5×104/mL的細(xì)胞懸液，每孔100 L 接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 待其貼壁后，加入終濃度為0、5、10 和20 M 的DAPT，陽(yáng)性對(duì)照組為含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組為不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，每2 天換液1 次。待任意一孔的細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后棄去上清，加入100 L含10%CCK-8的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度OD 值。

1.2.3 集落形成試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的143B細(xì)胞和MG63 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以每皿300 個(gè)細(xì)胞的濃度接種于6 cm 的培養(yǎng)皿中，陽(yáng)性對(duì)照組為含血清的培養(yǎng)液，DAPT 組則加入終濃度為10 M 的DAPT。將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 周，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的集落形成時(shí)，棄去上清液，用PBS 浸洗3 次，加入2mL 4%多聚甲醛固定15min，然后棄去固定液，加1 mL 結(jié)晶紫溶液染色15 min，最后用流水緩慢洗去染液，空氣干燥。

1.2.4 BrdU 摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將143B 細(xì)胞和MG63 細(xì)胞分別接種在含有細(xì)胞爬片的24 孔板里，陽(yáng)性對(duì)照組僅加入細(xì)胞培養(yǎng)液，DAPT 組加入終濃度為10 M 的DAPT，Jagged1 組加入終濃度為10 M的Jagged1 活性肽。培養(yǎng)48 h 后，在各組中加入10 M BrdU，置于37℃孵育4 h，然后棄去上清，用4%PFA 固定，隨后在2 mol/L 的HCl 與1 mol/L Na2B4O7中孵育。用PBS 洗滌后，將細(xì)胞與小鼠抗BrdU 抗體在室溫下孵育4 h，然后與山羊抗小鼠的二抗和DAPI 在室溫下孵育1 h，最后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.2.5 裸鼠成瘤試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所采用的6 只4 周齡BABL/C 雄性裸鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，操作均于SPF 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房完成，且所有操作均遵守西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)章程。實(shí)驗(yàn)前將裸鼠隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組和DAPT 組，每組3 只。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG63 細(xì)胞以2.5×107/mL 的濃度重懸于PBS 中，每只裸鼠注射100 L 細(xì)胞懸液于右側(cè)后肢外側(cè)皮下，隨后每隔一天對(duì)裸鼠腹腔注射1 次DAPT（DAPT組，10 mg/kg，用5%DMSO 稀釋?zhuān)┗虻润w積的5%的DMSO（對(duì)照組，用PBS 稀釋?zhuān)?，每周檢測(cè)異種移植腫瘤的大小。注射4 周后處死裸鼠，取出皮下腫瘤進(jìn)行測(cè)量和拍照，并將腫瘤標(biāo)本進(jìn)行切片及染色。

1.2.6 腫瘤組織染色

將取下來(lái)的腫瘤組織石蠟包埋后連續(xù)切片，在60℃的恒溫烤箱烤片30min 后進(jìn)行染色。使用二甲苯脫蠟2 次10min，然后用無(wú)水乙醇洗去二甲苯2 次5 min。用95%和80%的乙醇各清洗10 min，自來(lái)水清洗1 min，蒸餾水洗1 min。然后進(jìn)行蘇木素染色4 min，隨即用自來(lái)水清洗2 min。用1%鹽酸酒精分化20 s，自來(lái)水洗2min，用1%稀氨水返藍(lán)30s，自來(lái)水清洗2 min。然后進(jìn)行伊紅染色90 s，接著用80%和95%乙醇各脫水10s，無(wú)水乙醇脫水5min，二甲苯透明20min，封片。Ki67 染色則在切片脫蠟后加熱20 min，過(guò)氧化物酶阻斷，洗脫，然后孵育Ki67 一抗20 min，洗脫后用二抗孵育20 min，然后用DAB 顯色，蘇木素復(fù)染5 min，洗脫酒精處理后，用二甲苯透明，最后封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間檢驗(yàn)采用t 檢驗(yàn)、2檢驗(yàn)和單因素方差分析比較。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAPT 對(duì)143B 細(xì)胞和MG63 細(xì)胞增殖的影響

分別使用0、5、10 和20 M 的DAPT 作用于143B 細(xì)胞和MG63 細(xì)胞，48 h 后使用CCK-8 法檢測(cè)這兩種骨肉瘤細(xì)胞的增殖情況。CCK-8 結(jié)果顯示DAPT能夠明顯抑制143B細(xì)胞和MG63 細(xì)胞的增殖，且呈濃度依賴(lài)性，濃度越大，抑制增殖能力越強(qiáng)，但10 M 的DAPT 與20 M 的DAPT 對(duì)143B 細(xì)胞的增殖抑制能力無(wú)明顯差異。不同濃度對(duì)于143B細(xì)胞和MG63 細(xì)胞的增殖抑制情況見(jiàn)圖1。根據(jù)CCK-8 結(jié)果，筆者選擇10 M 的DAPT 進(jìn)行集落形成試驗(yàn)，結(jié)果顯示與陽(yáng)性對(duì)照組相比，DAPT 能夠明顯抑制143B 細(xì)胞和MG63 細(xì)胞集落的形成。集落形成情況見(jiàn)圖2。

圖1 不同濃度DAPT 處理的CCK-8 結(jié)果：A.143B 細(xì)胞增殖情況；B.MG63 細(xì)胞增殖情況

圖2 對(duì)照組與DAPT 組集落形成對(duì)比：A.143B 細(xì)胞；B.MG63 細(xì)胞

2.2 調(diào)控Notch信號(hào)通路對(duì)143B細(xì)胞和MG63 細(xì)胞增殖的影響

Jagged1 是一種Notch 通路的激動(dòng)劑，筆者分別在143B細(xì)胞和MG63 細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10 M的Jagged1 活性肽觀察其對(duì)這兩種細(xì)胞增殖的影響。通過(guò)BrdU 染色法檢測(cè)，結(jié)果顯示各組中BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量：Jagged1 組>對(duì)照組>DAPT 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明Jagged1 通過(guò)激活Notch信號(hào)通路促進(jìn)143B細(xì)胞和MG63 細(xì)胞的增殖，而DAPT 則通過(guò)抑制Notch 信號(hào)通路而抑制143B 細(xì)胞和MG63 細(xì)胞的增殖。BrdU 染色情況如圖3 所示。

圖3 不同組間BrdU 染色結(jié)果（×200）：A.143B 細(xì)胞；B.MG63 細(xì)胞

2.3 DAPT 對(duì)裸鼠骨肉瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的影響

為了探究DAPT 對(duì)體內(nèi)骨肉瘤生長(zhǎng)的影響，筆者使用MG63 細(xì)胞進(jìn)行裸鼠成瘤試驗(yàn)，并通過(guò)腹腔注射DAPT 觀察腫瘤的大小情況。如圖4 所示，DAPT 組腫瘤大小明顯小于對(duì)照組，而HE 染色結(jié)果顯示對(duì)照組的細(xì)胞核數(shù)量明顯多于DAPT 組，且腫瘤組織結(jié)構(gòu)更加緊密，血管分布更加豐富。反觀DAPT 組，細(xì)胞核數(shù)量少且腫瘤組織結(jié)構(gòu)疏松，中間有腔隙形成。Ki67 染色結(jié)果中對(duì)照組的陽(yáng)性率明顯高于DAPT 組。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，DAPT 在體內(nèi)能夠明顯抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)，破壞骨肉瘤的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)。

圖4 A.裸鼠成瘤情況；B.腫瘤組織切片HE 染色結(jié)果（×400）；C.腫瘤組織切片Ki67 染色結(jié)果（×400）

3 討論

Notch受體是一種控制細(xì)胞間通信和組織形態(tài)發(fā)生的跨膜蛋白家族，其包含Notch1、Notch2、Notch3 和Notch4 等4 種受體，并且具有相似的結(jié)構(gòu)，包括N 端的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C 端的Notch 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。Notch 通路有5 種配體：Jagged1 和Jagged2，Delta1、Delta3 和Delta4，通過(guò)配體和跨膜受體的結(jié)合激活通路，導(dǎo)致跨膜Notch 受體的蛋白水解酶裂解，使得Notch 細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）從膜上釋放出來(lái)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中[9-10]。NICD 在細(xì)胞核中與轉(zhuǎn)錄因子RBP-JK 相互作用，從而誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。

正因?yàn)镹otch信號(hào)通路在不同生理過(guò)程中保持穩(wěn)態(tài)才能保證生物體內(nèi)微環(huán)境的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，一旦Notch 信號(hào)發(fā)生改變，可能會(huì)導(dǎo)致不同的病理狀態(tài)或疾病發(fā)生[11-12]。人類(lèi)癌癥中Notch 通路的病理改變大多發(fā)生在Notch1 基因中，目前已有研究報(bào)道，在一些腫瘤（如肺癌、肝癌、骨肉瘤及結(jié)腸癌）中Notch1 的表達(dá)量均有顯著升高，也有研究表示活化的Notch1 能夠促進(jìn)骨肉瘤的增殖和遷移侵襲能力[13-15]。

DAPT 是一種-分泌酶抑制劑，能夠阻斷Notch 信號(hào)通路的活化，而Jagged1 作為一種Notch 通路激動(dòng)劑，能夠激活Notch 信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加不同濃度梯度的DAPT于體外培養(yǎng)的143B 細(xì)胞和MG63 細(xì)胞中，采用CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Notch通路抑制對(duì)這兩種人骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力的影響，結(jié)果表明DAPT 能夠通過(guò)抑制Notch 信號(hào)通路顯著抑制143B 和MG63 細(xì)胞的增殖，且和濃度呈正相關(guān)，但10 M 的DAPT 與20 M 的DAPT 對(duì)143B 細(xì)胞的增殖、抑制能力無(wú)明顯差異。為了驗(yàn)證DAPT 抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的結(jié)果，筆者又采用腫瘤集落形成試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)在DAPT 組添加中等劑量10 M 的DAPT 來(lái)與對(duì)照組比較，結(jié)果顯示DAPT 能夠顯著抑制腫瘤集落的形成。隨后筆者通過(guò)BrdU染色法檢測(cè)DAPT和Jagged1 對(duì)兩種骨肉瘤細(xì)胞增殖能力的影響，BrdU 是胸腺嘧啶的衍生物，可以標(biāo)記活細(xì)胞中新合成的DNA，代替胸腺嘧啶特異性的整合到復(fù)制細(xì)胞新合成的DNA 中。結(jié)果顯示DAPT 組的BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞明顯少于對(duì)照組和Jagged1 組，而Jagged1 組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，說(shuō)明Notch 信號(hào)通路能夠調(diào)控人骨肉瘤143B 和MG63 細(xì)胞的增殖，且與增殖呈正相關(guān)。

為了給臨床研究提供更加可靠的治療建議，筆者利用裸鼠建立人骨肉瘤的異種移植瘤模型，并通過(guò)腹腔注射DAPT來(lái)驗(yàn)證Notch 通路在體內(nèi)對(duì)骨肉瘤的調(diào)控作用。通過(guò)觀察骨肉瘤成瘤的結(jié)果，DAPT 組相比對(duì)照組能夠顯著抑制腫瘤大小，且對(duì)腫瘤組織的Ki67 染色結(jié)果表明對(duì)照組的陽(yáng)性率明顯高于DAPT 組，說(shuō)明Notch 通路同樣在體內(nèi)能夠調(diào)控骨肉瘤的增殖和生長(zhǎng)，抑制Notch 通路能夠明顯抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)。另外，為了觀察腫瘤內(nèi)部的組織學(xué)變化，筆者又對(duì)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行了HE 染色，結(jié)果顯示對(duì)照組的腫瘤內(nèi)部細(xì)胞核的數(shù)量明顯多于DAPT 組，而且組織內(nèi)部更加緊密，血管數(shù)量也明顯多于DAPT 組，說(shuō)明DAPT 在體內(nèi)抑制了骨肉瘤的惡性行為。

綜上所述，本文通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，使用-分泌酶抑制劑DAPT 和Notch 通路激動(dòng)劑Jagged1 對(duì)143B 和MG63 兩種骨肉瘤細(xì)胞系進(jìn)行干預(yù)，探究Notch 通路對(duì)這兩種骨肉瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。結(jié)果表明，Notch 通路參與143B 和MG63 細(xì)胞的增殖和成瘤行為，且通過(guò)抑制Notch 通路能夠抑制人骨肉瘤的惡性行為，為骨肉瘤的臨床治療提供了重要參考。