章豪，吳銀良，朱勇，趙健，陳國(guó)

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(寧波)，浙江 寧波 315040)

吡咯里西啶生物堿(PAs)是植物抵御昆蟲及食草動(dòng)物等侵害的一類化學(xué)物質(zhì)，廣泛分布在植物中[1]。目前，已在菊科的植物中檢測(cè)到PAs[2]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為，PAs是草藥產(chǎn)品與食品中最廣泛和最嚴(yán)重的摻雜性與內(nèi)源性的毒性成分[3]。PAs的毒性與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，可形成烯丙酯結(jié)構(gòu)的PAs具有肝臟毒性，會(huì)造成肝硬化、肝細(xì)胞壞死等癥狀[4]。歐盟于2019年實(shí)施PAs限量規(guī)定，成人每天攝入量不超過0.35 μg，兒童不超過0.14 μg[5]。WTO貿(mào)易技術(shù)壁壘委員會(huì)曾因我國(guó)出口的某種藥材中PAs含量過高而發(fā)布通告禁令；歐盟食品和飼料類快速預(yù)警系統(tǒng)也曾因我國(guó)出口至歐盟的草本茶原料中PAs含量過高發(fā)布警告。我國(guó)法定藥材標(biāo)準(zhǔn)中已收載了菊花等多種含有PAs的藥材，但對(duì)PAs在菊花中的含量及種類等缺乏相關(guān)的數(shù)據(jù)。目前，我國(guó)尚未建立高效的檢測(cè)方法，因此，還未能準(zhǔn)確評(píng)估其在菊花中的含量水平，亟須對(duì)我國(guó)常見菊花中PAs的檢測(cè)方法進(jìn)行研究，進(jìn)一步通過摸底檢測(cè)明確菊花中PAs含量數(shù)據(jù)，以期厘清我國(guó)菊花食品安全風(fēng)險(xiǎn)，確定關(guān)鍵控制點(diǎn)，形成管控措施，應(yīng)對(duì)潛在的國(guó)際貿(mào)易壁壘風(fēng)險(xiǎn)。

目前，針對(duì)PAs殘留采用的分析方法主要為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[6-9]、液相色譜法(LC)[10-12]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[13-15]、氣相色譜法(GC)[16-19]、分光光度法[20]、核磁共振法[21]和免疫學(xué)方法[22]。但使用分光光度法、核磁共振法和免疫學(xué)方法時(shí)存在基體干擾大的問題，更多是用來篩選，難以對(duì)多種PAs毒素進(jìn)行分析。而GC和GC-MS分析PAs存在過程煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、穩(wěn)定性差、檢出限高等缺陷，PAs分析使用 GC及GC-MS 較少，LC或LC-MS/MS是PAs主要分析手段。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)在 PAs 分析中選擇性好、靈敏度高，且適用于同時(shí)檢測(cè)多種 PAs，因而廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品或食品中PAs 的定性定量分析[9]。

PAs是含有特征性堿性氮的還原性生物堿，通常使用半極性或極性有機(jī)溶劑或在酸化水條件下萃取，其氧化形式(PANOs)屬于極性分子，容易被極性溶劑(例如甲醇)或稀酸水溶液萃取[6]。PAs前處理技術(shù)主要包括液液萃取(LLE)法、固相萃取(SPE)法、QuEChERS 法，以及發(fā)展的新型技術(shù)如分散液相微萃取(DLLME)、固相支持液/液萃取(SLE)[6-19]。其中，SPE是常用凈化PAs的前處理方法。常用固相萃取柱有C18和C8柱[8-11]。它們存在共提物多的缺點(diǎn)，在色譜分析中存在大的背景干擾，會(huì)對(duì)定量分析的準(zhǔn)確性以及靈敏度產(chǎn)生影響[7]。對(duì)于生物堿的凈化，陽(yáng)離子交換柱是一種更為有效的純化方法，可以有效地去除弱極性與離子型極性干擾物質(zhì)，對(duì)PAs及其氮氧化物均有良好的純化效果，并且不受其他共流出物的干擾[8]。

我們通過優(yōu)化儀器條件和樣品前處理方法，建立了基于Oasis MCX固相萃取柱能同時(shí)對(duì)菊花15種PAs毒素殘留進(jìn)行UPLC-MS/MS分析的方法。該方法具有精密度和準(zhǔn)確度高、檢測(cè)耗時(shí)短的特點(diǎn)，能同時(shí)對(duì)菊花樣品多種PAs毒素進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

UPLC XevoTMTQ-S micro 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)及MassLynxV4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；Vortex Genie 3 漩渦振蕩器(德國(guó)IKA公司)。

PAs標(biāo)準(zhǔn)品(天芥菜堿、天芥菜堿-N-氧化物、倒千里光堿、倒千里光堿-N-氧化物、千里光寧堿、千里光寧堿-N-氧化物、千里光堿、千里光堿-N-氧化物、促黑激素、促黑激素-N-氧化物、千里光菲靈堿、千里光菲靈堿-N-氧化物、歐天芥菜堿、歐天芥菜堿-N-氧化物和克氏千里光堿)純度大于95%(德國(guó)PhytoLab GmbH & Co. KG公司)；甲酸(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；乙腈、甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司)；Oasis MCX固相萃取小柱(200 mg/6 mL，美國(guó)Waters公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取適量(精確至0.1 mg)15種PAs標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制質(zhì)量濃度為1 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃ 保存；分別準(zhǔn)確吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋，配制質(zhì)量濃度為10 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。制備菊花空白樣品溶液，樣品處理方法采用1.2.2節(jié)，通過稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品處理

稱取5.00 g(精確至0.01 g)菊花樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1 mol·L-1硫酸水溶液，10 000 r·min-1均質(zhì)1 min，超聲提取15 min；以5 000 r·min-1速度離心10 min，將上清液收集，殘?jiān)儆?0 mL 0.1 mol·L-1硫酸水溶液提取1次，合并提取液。分別采用5 mL甲醇與5 mL去離子水活化Oasis MCX固相萃取小柱，移取提取液至固相萃取小柱，待液面到達(dá)柱床表面時(shí)用5 mL水淋洗，再用1%甲酸水溶液淋洗，最后用5 mL 0.5%氨水甲醇溶液洗脫，洗脫液在40 ℃下氮?dú)獯蹈?；? mL 0.1%(V/V)甲酸水-甲醇(90∶10,V/V)溶液復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS分析。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18(1.7 μm，100 mm×2.1 mm)；流動(dòng)相：A相為0.1%(V/V)甲酸水溶液，B相為甲醇；梯度洗脫程序：0～1.0 min，10%B；1.0～7.0 min，10%B～90%B；7.0～8.0 min，90%B；8.0～8.1 min，90%B～10%B；8.1～10.0 min，10%B；流速0.30 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式；ESI源正離子模式電離；錐孔氣流速：50 L·h-1；脫溶劑氣流速：1 000 L·h-1；脫溶劑氣溫度：500 ℃；離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：2.0 kV；萃取錐孔電壓：20 V；RF透鏡電壓：0.5 V；15種PAs毒素的母離子、子離子及其錐孔電壓和碰撞能量見表1。

表1 15種PAs毒素的母離子、子離子及其錐孔電壓和碰撞能量

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

在使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法中多采用ESI源正離子電離模式來測(cè)定PAs毒素殘留[6-9]。采用甲醇分別配制1.0 mg·L-115種PAs毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過Intellistart軟件分別摸索15種PAs毒素的母離子、子離子及其錐孔電壓和碰撞能量(表1)，15種PAs毒素在ESI源正離子電離模式下均可獲得較好的響應(yīng)。

考查乙腈和甲醇作為色譜流動(dòng)相的有機(jī)相時(shí)PAs毒素的分離效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，千里光堿、千里光菲靈堿-N-氧化物和倒千里光堿-N-氧化物的響應(yīng)較差，而采用甲醇作為有機(jī)相時(shí)，15種PAs毒素的響應(yīng)均較好，因此，確定甲醇為有機(jī)相。

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

PAs的提取，溶劑一般選用極性較大的溶液如甲醇[6-7]或水[8-9]等，加入少量的酸，可提高PAs的水溶性[14-17]。因此，本研究使用甲醇、水和0.05 mol·L-1硫酸水溶液3種溶劑對(duì)菊花樣品在10 μg·kg-1加標(biāo)水平下進(jìn)行提取。發(fā)現(xiàn)不加酸提取時(shí)，采用水提取所有PAs毒素的回收率均低于采用甲醇提取的回收率；而加酸提取時(shí)，采用0.05 mol·L-1硫酸水提取所有PAs毒素的回收率均高于采用甲醇提取的回收率，因此，確定以0.05 mol·L-1硫酸水溶液進(jìn)行提取。這可能是因?yàn)镻As毒素以離子形式存在于酸性環(huán)境中，顯著增強(qiáng)其水溶性，導(dǎo)致酸水的提取效率比甲醇高。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

在考查菊花基質(zhì)中15種PAs毒素的基質(zhì)效應(yīng)時(shí)我們采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率×100%的計(jì)算方法。結(jié)果越接近100%，表明基質(zhì)效應(yīng)越小。當(dāng)結(jié)果小于100%時(shí)表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，大于100%時(shí)表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。表2顯示，15種PAs毒素均存在一定的基質(zhì)抑制效應(yīng)或是增強(qiáng)效應(yīng)。為了消除基質(zhì)效應(yīng)所帶來的影響，我們采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行測(cè)定。采用菊花空白基質(zhì)液配制1～1 000 μg·L-1橫跨3個(gè)數(shù)量級(jí)的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(其中千里光堿、千里光菲靈堿-N-氧化物和倒千里光堿-N-氧化物為5～1 000 μg·L-1)進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定分析，通過峰面積對(duì)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得到線性回歸方程。15種PAs毒素在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999，線性關(guān)系良好。通過3倍信噪比(S/N=3)進(jìn)行估算，15種PAs毒素的檢出限為0.5～9.0 μg·kg-1；通過10倍信噪比(S/N=10)進(jìn)行估算，15種PAs毒素的定量下限為1.7～30.0 μg·kg-1。

表2 15種PAs毒素在杭白菊基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)

2.4 回收率與精密度

對(duì)杭白菊進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，并計(jì)算相應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。杭白菊空白樣品中PAs毒素的加標(biāo)MRM色譜圖如圖1所示。杭白菊中千里光堿、千里光菲靈堿-N-氧化物和倒千里光堿-N-氧化物的添加量為30 μg·kg-1，其余12種PAs毒素的添加量為6 μg·kg-1，每批次同一濃度5個(gè)平行樣品，重復(fù)測(cè)定3次。

圖1 杭白菊加標(biāo)樣品的MRM色譜

表3顯示，15種PAs毒素的加標(biāo)回收率為82.6%～94.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～5.0%。

表3 15種PAs毒素在杭白菊中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

結(jié)果表明，方法對(duì)于15種PAs毒素在杭白菊中的殘留分析均具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

3 小結(jié)

建立了同時(shí)對(duì)菊花15種PAs毒素殘留進(jìn)行測(cè)定的UPLC-MS/MS方法，采用硫酸溶液提取菊花樣品中PAs毒素，離心后將上清液過Oasis MCX固相萃取小柱凈化，氮?dú)獯蹈珊髲?fù)溶，采用UPLC-MS/MS進(jìn)行分析。15種PAs毒素的添加回收率為82.6%～94.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～5.0%；檢出限為0.5～9.0 μg·kg-1，定量下限為1.7～30.0 μg·kg-1。該方法檢測(cè)耗時(shí)短，具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，具備同時(shí)測(cè)定菊花樣品中多種PAs毒素的能力。