王宏宇， 朱寅初， 云濤， 華炯鋼， 葉偉成， 倪征， 陳柳， 張存

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

2014年在我國(guó)湖南首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)鵝星狀病毒(Goose astrovirus，GAstV)，隨后在遼寧、山東、江蘇、安徽乃至廣東等主要養(yǎng)鵝省份均陸續(xù)出現(xiàn)以內(nèi)臟痛風(fēng)為典型臨床癥狀的傳染病，經(jīng)分離鑒定，病原為星狀病毒，且基因組序列有別于湖南發(fā)現(xiàn)毒株[1-3]。當(dāng)前證據(jù)顯示，該病主要可導(dǎo)致5～20 d齡雛鵝發(fā)病，患病雛鵝表現(xiàn)為精神沉郁，臥地不動(dòng)，采食下降甚至死亡，剖檢可見心臟和肝臟表面明顯的粉末狀白色尿酸鹽沉積，腎臟腫大壞死[4]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來(lái)該病造成的死亡率由最初的5%逐漸上升，最高可達(dá)50%，給我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[5]。

鵝星狀病毒基因組分析顯示，其為單股正鏈無(wú)囊膜RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約7～8 kb，兩側(cè)為5′UTR和3′UTR(具PolyA尾)，包含ORF1a、ORF1b和ORF2 3個(gè)開放閱讀框(ORF)[6-8]。ORF1a編碼多種非機(jī)構(gòu)蛋白；ORF1b序列與ORF1a存在重疊，編碼保守的RNA依賴性RNA聚合酶(RbRp)；ORF2為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，包裹病毒外表面，形成衣殼和纖突結(jié)構(gòu)。隨著越來(lái)越多病毒基因組的測(cè)序顯示，已報(bào)道的鵝星狀病毒存在兩種基因型，核酸序列差異大，臨床調(diào)查顯示單一和混合病毒感染等多種情況均有出現(xiàn)；鑒于當(dāng)前鵝星狀病毒的致病機(jī)制尚不清楚，感染情況復(fù)雜，因而對(duì)該病毒的及時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)后期防控尤為重要。在實(shí)際病原鑒定中針對(duì)一種基因型的鵝星狀病毒的PCR檢測(cè)不僅目標(biāo)樣本單一，而且操作工序復(fù)雜，成本高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因而本試驗(yàn)根據(jù)GenBank公布的GAstV 編碼RbRp的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，嘗試建立雙重一步法RT-PCR檢測(cè)體系，可直接以RNA為模板，并達(dá)到同一體系檢測(cè)不同基因型鵝星狀病毒的目的，為臨床混合感染和流行病學(xué)調(diào)查提供快速有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

2017—2020年，共采集來(lái)自浙江和江蘇共73份雛鵝及鵝胚樣本，全部樣品記錄品種、日齡、組織、地點(diǎn)等信息，并于-80 ℃冰箱保存。鴨瘟[9](Duck plague virus，DPV)、鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV)、坦布蘇病毒[10](Goose-origin tembusu virus，GTMUV)、鵝呼腸孤病毒[11](Goose-origin reovirus muscovy duck reovirus，GRV)、H9N2亞型禽流感病毒(Avain influenza virus，AIV)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。磁珠法病毒RNA抽提試劑盒購(gòu)自濟(jì)帆科技生物有限公司。TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0和DNA Marker 5000為TaKaRa公司產(chǎn)品；HiScript II One Step RT-PCR Kit(Dye Plus)為Vazyme公司產(chǎn)品；Plasmid Mini Kit為OMEGA公司產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)布的兩種不同序列的GAstV病毒基因序列，選取RdRp保守序列區(qū)域利用Oligo 7.0軟件分別設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增對(duì)應(yīng)GAstV病毒，引物由鉑尚生物技術(shù)公司合成(表1)。

表1 試驗(yàn)引物的基本情況

1.3 PCR擴(kuò)增

單一RT-PCR分別以對(duì)應(yīng)的鵝星狀病毒作模板擴(kuò)增，建立20 μL體系：2×One Step Mix 10 μL，One Step Enzyme Mix 1 μL，ddH2O 6 μL，上下游引物各1 μL，RNA模板1 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min，4 ℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物；經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，測(cè)序鑒定。

對(duì)雙重RT-PCR反應(yīng)的引物、模板等用量，退火溫度等參數(shù)設(shè)置梯度，通過(guò)優(yōu)化和多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，確定最佳反應(yīng)體系，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析鑒定。

1.4 雙重RT-PCR特異性試驗(yàn)

根據(jù)建立并優(yōu)化的多重PCR方法對(duì)水禽常見病毒包括GTMUV、GPV、MDRV、DPV和AIV進(jìn)行檢測(cè)，以鑒定其特異性。

1.5 敏感性試驗(yàn)

使用目的片段所在基因的克隆載體作為陽(yáng)性質(zhì)粒，用NanoDrop測(cè)定核酸濃度，計(jì)算陽(yáng)性質(zhì)?？截悢?shù)。其后將質(zhì)粒模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，并以優(yōu)化條件進(jìn)行多重PCR敏感性測(cè)試。

1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

用建立的雙重RT-PCR方法間隔一周對(duì)樣本重復(fù)檢測(cè)，每次不同濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，連續(xù)檢測(cè)3次后，以驗(yàn)證此PCR方法的可靠性和穩(wěn)定性。

1.7 臨床樣本應(yīng)用試驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)室在周圍地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)采集和送檢的病死鵝及鵝胚等樣本73份進(jìn)行核酸提取，應(yīng)用建立的雙重RT-PCR方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并用單一的PCR方法進(jìn)行復(fù)檢比較，以檢驗(yàn)此方法在實(shí)際應(yīng)用中的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單片段擴(kuò)增

根據(jù)已經(jīng)公布的新型鵝星狀病毒全基因組序列，進(jìn)化分析顯示其可分為兩個(gè)基因型，Group Ⅰ和GroupⅡ，且兩者序列差異較大(圖1)。單一引物PCR結(jié)果顯示，各引物可有效擴(kuò)增出目的基因，條帶單一清晰，條帶大小與預(yù)期相符，彼此間序列不產(chǎn)生交叉，測(cè)序結(jié)果比對(duì)證實(shí)為鵝星狀病毒編碼RdRp基因序列，大小分別為Ⅰ型441 bp，Ⅱ型為277 bp(圖2)，適合鵝星狀病毒的檢測(cè)及分型鑒定。

圖1 鵝星狀病毒RbRp核酸序列進(jìn)化樹

M—DL1000；Ⅰ—基因Ⅰ型；Ⅱ—基因Ⅱ型；N—陰性對(duì)照；A—Ⅰ型核酸樣本；B—Ⅱ型核酸樣本。

2.2 雙重RT-PCR檢測(cè)方法的優(yōu)化

通過(guò)設(shè)置不同退火溫度及引物混合濃度等參數(shù)的比較試驗(yàn)，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠成像結(jié)果條帶明暗度、清晰度，分析得出退火溫度在50～54 ℃皆可，適宜引物濃度GastV Ⅰ和Ⅱ各為1 μmol·L-1(圖3～4)。最終擴(kuò)增程序?yàn)?0 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

M—DL1000；1—0.25 μmol·L-1；2—0.5 μmol·L-1；3—1 μmol·L-1；4—2 μmol·L-1；N—陰性對(duì)照。

M—DL1000；1—50 ℃；2—52 ℃；3—54 ℃；4—56 ℃；5—58 ℃；6—60 ℃；N—陰性對(duì)照。

2.3 PCR方法特異性

采用優(yōu)化后的雙重RT-PCR反應(yīng)條件，對(duì)不同鵝星狀病毒、鵝細(xì)小病毒、禽流感病毒、坦布蘇病毒、鴨瘟病毒、鴨呼腸孤病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該引物只能擴(kuò)增出星狀病毒相應(yīng)的目的條帶，條帶清晰，其他對(duì)鵝常見病毒種類和陰性對(duì)照未見擴(kuò)增產(chǎn)物(圖5)。上述結(jié)果表明，該雙重RT-PCR方法有良好的特異性。

M—DL1000；1—GastV；2—TMUV；3—GPV；4—MDRV；5—DPV；6—AIV；N—陰性對(duì)照。

2.4 敏感性

對(duì)10倍稀釋的陽(yáng)性核酸樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，再根據(jù)前期公式計(jì)算的拷貝數(shù)換算，最終結(jié)果顯示，所建立的雙重RT-PCR方法對(duì)GAstV Ⅰ型和Ⅱ型的的最低檢測(cè)模板量分別為103和102拷貝(圖6)。

M—DL1000；A—Ⅰ型單一PCR敏感性；B—Ⅱ型單一PCR敏感性；C—雙重PCR敏感性；1～9—109～101拷貝·mL-1。

2.5 重復(fù)性檢測(cè)

應(yīng)用此雙重RT-PCR檢測(cè)方法，間隔一周對(duì)同一模板進(jìn)行反復(fù)檢測(cè)，共重復(fù)3次，每次3個(gè)重復(fù)，并設(shè)置陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，多次試驗(yàn)結(jié)果一致，表明所建立的PCR方法具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

2.6 臨床樣本的檢測(cè)應(yīng)用

利用上述建立的雙重RT-PCR方法對(duì)江浙數(shù)個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采集到的病樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，73份病樣中有68份為鵝星狀病毒陽(yáng)性，陽(yáng)性率93.2%(圖7)；其中GAstV Ⅰ型和Ⅱ型均陽(yáng)性的有5份，而GAstV Ⅱ型單獨(dú)存在的有63份，GastV Ⅰ單獨(dú)存在的陽(yáng)性樣本則只有一個(gè)。該結(jié)果與單一PCR檢測(cè)結(jié)果完全相同。

M—DL1000；1～14—臨床樣品；N—陰性對(duì)照。

3 討論

鵝星狀病毒作為新發(fā)疫病病原，近年已給各地養(yǎng)鵝業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前在我國(guó)多地區(qū)雛鵝群中出現(xiàn)流行，臨床暴發(fā)痛風(fēng)；在排除飼料和環(huán)境等問題后，明確了雛鵝痛風(fēng)的主要病因是由鵝星狀病毒感染引起[12]。病毒基因組序列同源性分析顯示，臨床鵝星狀病毒主要存在兩種不同基因型分離株，且兩種病毒核酸序列差異較大，但都屬于星狀病毒成員，感染宿主主要為20 d齡雛鵝；分別為以FLX株為代表的Group Ⅰ型和以GD株為代表的Group Ⅱ型，而這兩種毒株也呈現(xiàn)混合感染現(xiàn)象，至今尚不清楚兩種基因型病毒的各自致病機(jī)理。傳統(tǒng)的病毒分離、電鏡觀察鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)等病毒檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作難度高，特異性差；準(zhǔn)確快速的診斷技術(shù)在病原體鑒別診斷上應(yīng)用價(jià)值較大，尤其是對(duì)于混合感染。雖然已有研究人員建立了GAstV的PCR檢測(cè)方法[13]，但都是針對(duì)單一基因型病毒的檢測(cè)，存在操作煩瑣、不能同時(shí)檢測(cè)到兩種基因型病毒的不足。而鵝星狀病毒作為新發(fā)病原，對(duì)其研究甚少，不同毒株及其致病機(jī)制尚不清楚，因此，建立快速檢測(cè)該病毒感染并且可區(qū)分基因型的方法，將有利于防控該病。

兩種基因型鵝星狀病毒基因組均由3個(gè)開放閱讀框組成，ORF1a、ORF1b和ORF2，分別主要編碼絲氨酸蛋白酶、RNA依賴性RNA聚合酶和衣殼蛋白。本研究選取其RNA依賴性聚合酶區(qū)域基因序列作為檢測(cè)靶基因，設(shè)計(jì)特異性引物，建立的一步法RT-PCR方法，操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)以RNA為檢測(cè)模板，在反應(yīng)體系中完成RNA反轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增。經(jīng)對(duì)反應(yīng)體系和條件的摸索優(yōu)化后，敏感性高，最低可檢測(cè)出103拷貝的星狀病毒；特異性好，條帶單一，不會(huì)因其他RNA病毒而受到干擾，產(chǎn)物可回收測(cè)序。應(yīng)用所建立的一步法RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床收集到的73份樣本進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)本次樣品中仍以Ⅱ型病毒更為普遍，是優(yōu)勢(shì)毒株；Ⅱ型病毒與Ⅰ型共同感染的情況也存在，發(fā)現(xiàn)5例，占檢測(cè)總數(shù)6.8%；僅發(fā)現(xiàn)一例Ⅰ型病毒單一感染情況，這與已有研究報(bào)道的情況相符合[14-17]。結(jié)合其他學(xué)者的流行病學(xué)調(diào)查顯示，不同地區(qū)病毒感染情況存在差異，部分地區(qū)主要以混合感染為主，其樣品中混合感染可達(dá)94.03%[18]，值得引起重視。此外，報(bào)道顯示兩種基因型GAstV分離株都有致病能力，可致鵝胚死亡，并有明顯病變，因而對(duì)GAstV應(yīng)加以重視。本研究建立的方法快速、靈敏、特異且穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低，將為GAstV臨床診斷和早期流行病毒調(diào)查提供快捷可靠的技術(shù)手段。