華炯鋼， 葉偉成， 劉可姝， 云濤， 倪征， 陳柳， 朱寅初， 張存

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

自2000年以來，在福建、浙江、廣東和江蘇等地鴨鵝群暴發(fā)一種以肝、脾出現(xiàn)大量出血性壞死灶為主要特征的新疫病，根據(jù)臨床病理特征被命名為出血性壞死性肝炎(Hemorrhagic-Necrotic Hepatitis)，發(fā)病以5～10 d齡為主，死亡率達(dá)2%～15%，且患病鴨日齡越小，感染率和病死率越高[1-3]。多品種鴨(如番鴨、麻鴨、北京鴨、櫻桃谷等)和鵝均可發(fā)生[4-7]。經(jīng)分離鑒定、全基因組破譯和分子進(jìn)化樹分析，確定該病原為一種新型鴨呼腸孤病毒(Novel Duck Reovirus，NDRV)[1-7]，與經(jīng)典MDRV(Classical Muscovy Duck reovirus，CDRV)均屬于禽正呼腸孤病毒群(AvianOrthoreovirusspecies group II)成員，但二者屬于不同的基因型：CDRV為I型；NDRV為II型[8-11]。盡管傳統(tǒng)DRV 和NDRV都屬于禽正呼腸孤病毒群成員，病毒生物學(xué)特性有很多相似性，但是兩者在致病性、抗原性及基因組結(jié)構(gòu)上存在差異[2-3,9-12]。

本實驗選取經(jīng)DF-1細(xì)胞傳代致弱的一株NDRV(JDm10株)人工感染雛番鴨，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)[13]研究NDRV弱毒株在雛番鴨體內(nèi)的分布動態(tài)及排毒規(guī)律，為探討該病發(fā)病機(jī)理和研制NDRV活疫苗提供試驗依據(jù)，更為今后對該病的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與病毒株

112只1 d齡雛番鴨購自金華蘭溪禾旺克里莫種番鴨公司，出殼后未接種任何疫苗。NDRV JDm10弱毒株由本實驗室經(jīng)DF-1細(xì)胞連續(xù)傳代150代獲得(JD-150代)。

1.2 主要試劑與儀器

Prefilled Viral Total RNA Kit-Flex(貨號KFRPF-805296)購自Thermo Fisher Scientific公司；One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)(貨號RR064A)購自寶生物工程(大連)有限公司；Tissuelyser-24全自動樣品快速研磨儀(上海凈信科技公司)；Thermo Scientific King Fisher Flex全自動磁珠提取純化系統(tǒng)(Thermo Fisher公司)；熒光定量PCR(ABI 7500)儀(Applied Biosystems公司)。

1.3 引物設(shè)計與合成

參照文獻(xiàn)[13]設(shè)計Taq-Man-MGB探針和引物，由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。引物與探針引物以S3基因特異性保守序列作為靶目標(biāo)區(qū)，熒光定量RT-PCR檢測引物為P1和P2，產(chǎn)物大小為128 bp，探針引物5′端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)為FAM，3′端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為MGB。P1引物序列(5′-3′)ACAAGTGTCATCAACAGCAATA TCG，P2引物序列(5′-3′)ATCATAGTAATCTG CAATGACATGCA，MGB探針序列(5′-3′)FAM-CGCACTACAGAGCAA-MGB。

1.4 試驗設(shè)計與樣品采集

1 d齡雛番鴨分成2組，對照組42只，每只注射0.5 mL DMEM培養(yǎng)液；攻毒組70只，每只腿部肌肉接種P150代NDRV JDm10細(xì)胞病毒液(10-7.8TCID50/0.1 mL)0.5 mL。于攻毒后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、9 d、13 d、15 d、18 d、21 d、24 d、28 d、31 d和35 d共14個時間點，隨機(jī)選取試驗組5只番鴨和對照組3只番鴨先采血，后進(jìn)行安樂處死解剖，每只番鴨均取腦、胸腺、肺、心、肝、脾、胰腺、腎、盲腸扁桃體和法氏囊等臟器組織。同時采集口腔和泄殖腔棉拭子，置于內(nèi)含雙抗(1 000 IU·mL-1)的PBS(0.01 mol·L-1，pH 7.2)液中。除血液外，其余樣品均-20 ℃保存以備用。

1.5 RNA的提取

將血液樣品先置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置2 h，然后4 000 r·min-1離心10 min，取上層血清待用；將各棉拭子樣品在振蕩器上充分混合后，用滅菌鑷子將拭子中的液體擠出，3 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液200 μL待用；將各組織臟器樣品按1∶5(m/m)比例加入無菌PBS(0.01 mol·L-1，pH 7.2)后，常溫下在高通量全自動樣品快速研磨機(jī)上勻漿成糊狀，凍融3次后，將研磨液經(jīng)12 000 r·min-1離心5 min，取上清待用。取上述各樣品上清液200 μL，按照Prefilled Viral Total RNA Kit-Flex試劑盒說明書在Thermo Scientific King Fisher Flex全自動磁珠提取純化系統(tǒng)上進(jìn)行RNA提取。RNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 qRT-PCR檢測

根據(jù)建立的qRT-PCR方法對不同時間點采集的不同組織、拭子及血液樣品的RNA進(jìn)行檢測。以提取的NDRV JDm10弱毒株DF-1細(xì)胞病毒RNA作為陽性對照，正常DF-1細(xì)胞RNA作陰性對照。反應(yīng)體系和條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立均參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。具體如下：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL、TaKaRa ExTaqHS 0.4 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL、P1/P2(10 μmol·L-1)0.4 μL、MGB-Probe(10 μmol·L-1)0.8 μL、模版2 μL、Rox Dye Ⅱ 0.4 μL、RNase Free dH2O 5.2 μL。反應(yīng)條件為42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s、54 ℃ 31 s，40個循環(huán)。以Ct值和擴(kuò)增曲線確定樣品RNA的陰、陽性，即采集的不同時間點樣品中是否含有NDRV核酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 一步法qRT-PCR檢測NDRV標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍系列稀釋的NDRV RNA標(biāo)準(zhǔn)品為模版，按照優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行一步法qRT-PCR反應(yīng)。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以Ct值為Y軸，RNA標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸，其回歸方程為y=-3.477x+42.504，R2為0.999。

2.2 NDRV JDm10-150株在攻毒雛番鴨各組織器官的分布

攻毒前期雛番鴨各組織器官及血液NDRV檢測均為陰性；于接毒后6 h，即可從雛番鴨的各組織器官及血液中檢測出NDRV核酸；接毒12 h后，除腦組織外，心、肝、脾、肺、腎、胸腺、法氏囊、胰腺、盲腸扁桃體及血清均可檢到NDRV核酸，且肝、脾、腎在各臟器組織及血清中病毒含量最高；接毒后1～5 d，只有肝、脾、腎臟組織及血清可檢測到NDRV核酸，且含量減少，其余組織器官均檢測不到NDRV核酸或NDRV核酸檢測為陰性；接毒后9 d，各組織器官及血液均檢測不到NDRV核酸或NDRV核酸檢測為陰性；接毒后第13～35 d，除腦和血清外，大部分的組織臟器中均又檢測到NDRV核酸，其中脾臟和法氏囊組織器官中NDRV核酸含量始終保持較高水平(表1)。

表1 鴨新型呼腸孤病毒在雛番鴨組織中的qRT-PCR檢測結(jié)果

2.3 攻毒番鴨的NDRV JDm10-150排出情況

攻毒后6 h，即在咽拭子和泄殖腔拭子中均可檢測到NDRV核酸。接毒24 h后咽拭子中檢測NDRV核酸為陰性，或檢測不出NDRV核酸；28 d后泄殖腔拭子中才完全檢測不到NDRV核酸或NDRV核酸檢測為陰性。結(jié)果表明，弱毒株NDRV JDm-150接種雛番鴨后可通過口腔分泌物和泄殖腔排泄物向外界排毒，但通過口腔分泌物排毒時間短，主要還是通過泄殖腔排泄物向外界排毒(表2)。

表2 攻毒后雛番鴨排毒qRT-PCR檢測Ct值

3 小結(jié)與結(jié)論

弱毒疫苗在動物體內(nèi)的分布和增殖規(guī)律是闡明疫苗免疫機(jī)理的重要基礎(chǔ)。而對病原體在宿主機(jī)體內(nèi)分布與增殖規(guī)律的研究，根據(jù)病原體特性，可采用組織病理學(xué)檢查、電鏡觀察、血清學(xué)、原位雜交和PCR/RT-PCR等技術(shù)手段[14]。對于DRV(CDRV和NDRV)主要采用常規(guī)RT-PCR技術(shù)研究其在雛番鴨體內(nèi)的分布與增殖規(guī)律[15-17]，未見使用靈敏度更高、特異性更強(qiáng)且可進(jìn)行定量的qRT-PCR技術(shù)。而該技術(shù)可將病原體在宿主機(jī)體內(nèi)的分布、增殖動態(tài)變化與宿主病程有效的結(jié)合，通過實時監(jiān)測病原體在宿主機(jī)體內(nèi)變化，從而確定宿主病程階段[14]。因此，本試驗應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)對NDRV JDm10-150毒株在雛番鴨體內(nèi)的分布動態(tài)、增殖規(guī)律和排毒規(guī)律進(jìn)行了研究。

首先，雛番鴨感染NDRV JDm-150弱毒株后6 h，各組織器官及血液中即可檢測出NDRV核酸，包括胸腺、脾臟和法氏囊等中樞免疫器官，并且病毒在脾臟中增殖最快。感染后13 d起，直至35 d，脾臟和法氏囊組織中的病毒含量均高，胸腺較低。表明脾臟和法氏囊是NDRV JDm10弱毒定居和繁殖的主要場所，這一特點與NDRV強(qiáng)毒感染鴨相同[3,17]。脾臟和法氏囊是禽類的主要中樞免疫器官，NDRV JDm10-150弱毒能迅速分布于這2個免疫器官，表明該弱毒株可刺激雛番鴨機(jī)體迅速產(chǎn)生免疫力，可對NDRV強(qiáng)毒在各組織器官的分布及增殖起干擾作用，符合弱毒疫苗特性，免疫宿主后可迅速為宿主提供免疫保護(hù)力[14]。

其次，在感染NDRV JDm-150弱毒株12 h后，各組織器官及血液中的NDRV核酸量持續(xù)降低，且大部分組織臟器中的病毒核酸檢測呈陰性(肝臟、脾臟和腎臟除外)。至感染后9 d，各組織臟器及血液中NDRV核酸均呈陰性，表明雛番鴨機(jī)體的免疫作用對NDRV JDm10-150弱毒株的增殖起到了抑制作用。而感染后13 d起，各組織臟器中的NDRV核酸基本又呈陽性(腦和心臟除外)。直至感染后35 d，脾臟、法氏囊和胰腺等組織器官中仍可檢測到NDRV核酸，表明NDRV JDm10-150弱毒株持續(xù)存在(尤其在脾臟和法氏囊中)，可不間斷的刺激番鴨中樞免疫器官產(chǎn)生特異性抗體，為其提供免疫保護(hù)。

研究[17]發(fā)現(xiàn)，NDRV強(qiáng)毒株可以通過消化道和呼吸道途徑傳播，并通過這2種途徑向外排毒，排毒時間2周左右。因此，在生產(chǎn)實際中應(yīng)加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理，切斷傳染源，對防治NDRV病的發(fā)生有重要作用。本實驗通過對咽喉和泄殖腔棉拭子的檢測發(fā)現(xiàn)，NDRV JDm10-150弱毒感染雛番鴨后，主要通過糞便向外界排毒，感染6 h后就可排毒，且持續(xù)24 d。表明NDRV弱毒株可迅速通過糞便排出體外，然后通過消化道再次進(jìn)入鴨體，從而起到加強(qiáng)免疫的作用，這一結(jié)果具有重要的免疫學(xué)意義和生態(tài)學(xué)意義。

本試驗明確了NDRV弱毒株在雛番鴨體內(nèi)組織器官中的動態(tài)分布情況和排毒規(guī)律，該研究結(jié)果對新型鴨呼腸孤病毒病的分子流行病學(xué)調(diào)查、疫病防控以及其弱毒疫苗研究提供指導(dǎo)意義和理論依據(jù)。