劉啟艷， 詹偉， 高娜， 張力文， 龐平， 李春， 彭玉

小兒厭食癥指排除全身性和消化道器質(zhì)性疾病，較長時間的食欲減退或消失、食量減少甚至拒食的一種常見疾病[1]。我國學齡前兒童厭食癥發(fā)病率為12%～34%，每年有遞增趨勢[2]。若本病治療不及時，可影響兒童生長發(fā)育，輕者發(fā)生疳證(營養(yǎng)不良)，重者并發(fā)佝僂病以及貧血等[3]。因此，小兒厭食癥仍是中西醫(yī)兒科醫(yī)生共同關(guān)注及防治的疾病之一。目前研究表明，小兒厭食癥的發(fā)生多種腦腸肽異常變化有關(guān)，如神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)、八肽膽囊收縮素(cholecystokinin-octopeptide，CCK-8)、瘦素(leptin，LP)[4-6]等。因此，認為腦腸肽異常表達可導致“腦腸肽-食欲中樞紊亂”，這是發(fā)生小兒厭食的重要環(huán)節(jié)[7]。在治療小兒厭食癥諸多藥物中，微量元素鋅是最為常見藥物，而中藥也具有較強的優(yōu)勢。理脾復(fù)方制劑是貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院治療小兒厭食的驗方-運脾散(院內(nèi)制劑名為運脾顆粒)基礎(chǔ)上研發(fā)的實驗用顆粒制劑。前期研究發(fā)現(xiàn)，運脾散治療厭食的有效率達93.3%[8]。目前，中西醫(yī)藥物發(fā)揮其治療研究機制多從血液或組織標本進行探索，而從細胞水平進行研究甚少。故此，本研究通過低、中、高劑量理脾復(fù)方制劑和硫酸鋅含藥血清作用于大鼠結(jié)腸平滑肌細胞(colon smooth muscle cells，CSMCs)，開展理脾復(fù)方制劑和硫酸鋅含藥血清對大鼠CSMCs增殖及其該細胞分泌的LP、NPY、CCK-8的調(diào)控影響，以期研究成果能闡釋理脾復(fù)方制劑和硫酸鋅治療厭食的作用機制與靶點。

1 材料與方法

1.1 動物 30日齡SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(60±5)g，生產(chǎn)許可合格證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 實驗藥物 理脾復(fù)方制劑組方藥材(蒼術(shù)、白術(shù)、茯苓、薏苡仁各10 g，山藥、陳皮、枳殼、神曲、甘草各6 g)由貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室劉曉龍博士鑒定，委托貴州中醫(yī)藥大學藥學院劉文教授參照陳大業(yè)方法[9-10]制備理脾復(fù)方制劑顆粒，其含量為2.70 g/kg，供試品樣品按干燥品計算，含柚皮苷(C27H32O11)應(yīng)不得<0.98 mg/g，含橙皮苷(C28H34O13)不得<0.52 mg/g；硫酸鋅口服液(浙江迪耳藥業(yè)有限公司，批號：13171001)。

1.3 主要試劑 高糖培養(yǎng)基(Gibco)；0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液(HyClone)；胎牛血清(Sera)；綿羊血清、二甲基亞砜(Solarbio)；即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒兔抗鼠、DAB顯色試劑盒(邁新試劑)；抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白抗體(博士德生物)；細胞增殖試劑盒、RIPA(強)組織細胞快速裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、山羊抗兔IgG、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗抗體、LP ELISA試劑盒、NPY ELISA試劑盒、CCK-8 ELISA試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司)；熒光聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(美國KAPABiosystems公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；LP、NPY一抗抗體(英國Abcam公司)；CCK-8一抗抗體(美國Invitrogen公司)。

1.4 主要實驗儀器 EPS300電泳儀、Tanon-5200全自動化學發(fā)光分析儀(上海天能)；Multiskan FC酶標儀(Thermo)；DMIL LED倒置相差顯微鏡(OLYMPS)；CFX-Connect 96熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀(Bio-Rad)；JY045-3C凝膠成像系統(tǒng)(北京君意)；DM3000顯微鏡(Leica)；ST16R型臺式高速冷凍離心機(長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 大鼠CSMCs簡化培養(yǎng)與細胞鑒定、保存 本實驗大鼠CSMCs原代培養(yǎng)參照劉啟艷簡化方法[11]進行CSMCs原代、傳代培養(yǎng)及鑒定、保存。

1.5.2 含藥血清制備 60只幼齡大鼠中取10只培養(yǎng)大鼠CSMCs，余50只大鼠參照文獻[12]實驗動物隨機分組法分為對照組，低、中、高劑量理脾復(fù)方制劑組，硫酸鋅組，每組10只。對照組灌胃給予等體積飲用水；硫酸鋅組灌胃給予20 mg/kg硫酸鋅口服溶液；低、中、高劑量理脾復(fù)方制劑組分別灌胃給予2.4、4.8、9.8 g/kg理脾復(fù)方制劑，各組每日灌胃1次，連續(xù)7 d，末次灌胃后1～2 h后予2%戊巴比妥鈉3 mL/kg，腹腔麻醉后股動脈采血，各組血液靜置2 h后，離心(2 000 r/min×10 min)后無菌分離血清，0.22 μm過濾器進行過濾，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，使用時室溫恢復(fù)并采用高糖培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基稀釋成10%濃度。

1.5.3 CCK-8細胞增殖檢測 收集對數(shù)期第3代CSMCs，用DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，接種于96孔板中(5×103個細胞/孔，每孔180 μL)，邊緣孔用無菌磷酸鹽緩沖液填充，同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基)，對照孔(相應(yīng)濃度、相應(yīng)組別含藥血清)每組設(shè)3復(fù)孔，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，細胞貼壁后按上述分組處理細胞，培養(yǎng)至各預(yù)設(shè)的時間點(0、2、4、6、8、12、24、36、48 h)，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光值(OD值)，每組取3孔平均值，計算增殖率并繪制細胞增殖曲線，尋找含藥血清對大鼠CSMCs增殖影響最佳起始時間點。增殖率=(含藥血清組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%。

1.5.4 酶聯(lián)免疫吸附法測CSMCs的LP、NPY、CCK-8蛋白濃度 提取10%含藥血清干預(yù)大鼠CSMCs至最佳增殖起始時間點，收集各組別細胞，提取總蛋白。嚴格按照LP、NPY、CCK-8酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒操作進行。

1.5.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測CSMCs的LP、NPY、CCK-8蛋白相對表達量 將提取后各組CSMCs總蛋白，BCA法定量后，100 ℃水煮5 min蛋白變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳電分離蛋白移至聚偏二氟乙烯膜，經(jīng)稀釋后的LP、NPY、CCK-8抗體孵育、電化學發(fā)光顯色后，置于凝膠成像儀中觀察各組LP、NPY、CCK-8蛋白表達的變化情況。

1.5.6 實時聚合酶鏈反應(yīng)法檢測CSMCs的LP、NPY、CCK-8 mRNA相對表達量 從NCBI基因庫中查尋目標基因序列，LP和GAPDH引物由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司合成，CCK-8和NPY引物由武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司合成。Trizol法提取各含藥血清組干預(yù)至最佳增殖起始點時CSMCs的RNA。引物序列如下：GAPDH，上游：5′-CAA GTT CAA CGG CAC AG-3′，下游5′-CCA GTA GAC TCC ACG ACA T-3′；CCK-8，上游：5′-AGC AGG TCC GCA AAG-3′，下游：5′-GGC CGA AAT CCA TCC-3′；LP，上游：5′-CCC ATT CTG AGT TTG TC-3′，下游：5′-GGT CTC GCA GGT TCT-3′；NPY，上游：5′-GAC CCT CGC TCT ATC C-3′，下游：5′-TTG ATG TAG TGT CGC AGA-3′；擴增片段長度分別為36，12，15，11 bp。選GAPDH作為內(nèi)參基因。完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和cDNA擴增反應(yīng)體系，反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，39個循環(huán)，65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCT法計算樣品中基因相對表達量。各組大鼠LP、NPY、CCK-8基因表達量(△Ct值)，△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參照基因Ct。

2 結(jié)果

2.1 10%理脾復(fù)方制劑和硫酸鋅含藥血清在24 h時開始穩(wěn)定促進CSMCs增殖 見圖1。

圖1 10%含藥血清對正常大鼠CSMCs增殖的影響

圖1結(jié)果表明，在2 h時，高劑量理脾復(fù)方制劑組10%含藥血清抑制CSMCs增殖；在4 h時，除高劑量理脾復(fù)方制劑組外，其余各組10%含藥血清中的CSMCs增殖率呈持續(xù)、非勻速增高；在8 h及24 h時間點，各組CSMCs增殖率呈下降趨勢；24～36 h，各組CSMCs增殖率呈均速增高。此外，各組CSMCs在24 h以后，其增殖率均在20%以上，處于對數(shù)增長期，故此24 h為最佳起始時間點。

2.2 10%含藥血清干預(yù)大鼠CSMCs后的LP、NPY、CCK-8蛋白濃度 10%理脾復(fù)方制劑與硫酸鋅含藥血清上調(diào)大鼠CSMCs中LP、NPY蛋白濃度，下調(diào)CCK-8蛋白濃度，見表1。

表1 10%含藥血清干預(yù)大鼠CSMCs后的LP、NPY、CCK-8蛋白濃度

表1結(jié)果表明，與對照組比較，10%理脾復(fù)方制劑含藥血清對大鼠CSMCs的LP、NPY蛋白濃度均為上調(diào)作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，上調(diào)作用呈高劑量理脾復(fù)方制劑組>中劑量理脾復(fù)方制劑組>低劑量理脾復(fù)方制劑組；對CCK-8均為下調(diào)作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，下調(diào)作用呈高劑量理脾復(fù)方制劑組>中劑量理脾復(fù)方制劑組>低劑量理脾復(fù)方制劑組。10%硫酸鋅含藥血清對LP、NPY蛋白濃度有上調(diào)作用，對CCK-8蛋白濃度有下調(diào)作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 10%含藥血清干預(yù)大鼠CSMCs后的LP、NPY、CCK-8蛋白相對表達量 10%理脾復(fù)方制劑與硫酸鋅含藥血清上調(diào)大鼠CSMCs中LP、NPY蛋白相對表達量，下調(diào)CCK-8蛋白相對表達量，見表2。

表2 10%含藥血清干預(yù)大鼠CSMCs后的LP、NPY、CCK-8蛋白相對表達量

表2結(jié)果表明，與對照組比較，10%理脾復(fù)方制劑含藥血清對大鼠CSMCs中LP、NPY蛋白相對表達量均為上調(diào)作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，上調(diào)作用呈高劑量理脾復(fù)方制劑組>中劑量理脾復(fù)方制劑組>低劑量理脾復(fù)方制劑組，對CCK-8蛋白相對表達量各組蛋白均為下調(diào)作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，下調(diào)作用呈高劑量理脾復(fù)方制劑組>中劑量理脾復(fù)方制劑組>低劑量理脾復(fù)方制劑組。10%硫酸鋅含藥血清對大鼠CSMCs中LP、NPY蛋白相對表達量有上調(diào)作用，對CCK-8蛋白相對表達量有下調(diào)作用。

2.4 10%含藥血清干預(yù)大鼠CSMCs后的LP、NPY、CCK-8 mRNA相對表達量 10%理脾復(fù)方制劑與硫酸鋅含藥血清上調(diào)大鼠CSMCs中LP、NPY、CCK-8 mRNA相對表達量，見表3。

表3結(jié)果表明，與對照組比較，10%理脾復(fù)方制劑含藥血清對大鼠CSMCs中LP、NPY mRNA相對表達量有上調(diào)作用，除低劑量理脾復(fù)方制劑組外，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，上調(diào)作用呈高劑量理脾復(fù)方制劑組>中劑量理脾復(fù)方制劑組>低劑量理脾復(fù)方制劑組，對CCK-8表達有上調(diào)作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表達量上調(diào)趨勢呈低劑量理脾復(fù)方制劑組>中劑量理脾復(fù)方制劑組>高劑量理脾復(fù)方制劑組；10%硫酸鋅含藥血清對大鼠CSMCs中LP、NPY、CCK-8 mRNA相對表達量有上調(diào)作用。

表3 10%含藥血清干預(yù)大鼠CSMCs后的LP、NPY、CCK-8 mRNA相對表達量

3 討論

結(jié)腸位于消化道末端，主要由黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜四層組成，結(jié)腸肌層包括縱行肌和環(huán)形肌，這是結(jié)腸運動的基礎(chǔ)[13]，縱肌主要產(chǎn)生肌張力，環(huán)肌主要產(chǎn)生位相性收縮，共同將腸內(nèi)容物推向直腸，以排出體外。攝食行為主要經(jīng)過以下兩種方式影響結(jié)腸運動：進食與否：空腹時多見的袋狀往返運動，進食時見分節(jié)推進運動及多袋推進運動，這兩種運動均可推動食物殘渣向前運動，以促進結(jié)腸內(nèi)容物排出體外[14]；胃-結(jié)腸反射：當機體攝入食物時，由于胃的拉伸而增加結(jié)腸的蠕動，而結(jié)腸蠕動可促進結(jié)腸排空，為食物增加消化空間，這種現(xiàn)象稱之為胃-結(jié)腸反射，其實質(zhì)是食物攝入的結(jié)腸反應(yīng)[15]，小兒進食時易引發(fā)胃-結(jié)腸反射[16]，兩種方式均與神經(jīng)肽密切相關(guān)[15]。

LP、NPY、CCK-8既是胃腸道中的神經(jīng)肽，亦是腦腸肽，三者均影響胃腸運動及食欲變化。LP是一種主要由脂肪細胞產(chǎn)生的相對分子質(zhì)量16 000的多肽，骨骼肌、胃、腦下垂體等組織可能產(chǎn)生少量的LP。LP通過可溶性LP受體刺激阿黑皮素神經(jīng)肽合成并產(chǎn)生α-促黑激素，發(fā)揮抑制食欲與減少體質(zhì)量作用。NPY由36個氨基酸組成的活性單鏈多肽,由于結(jié)構(gòu)中富含酪氨酸，故稱為神經(jīng)肽酪氨酸，“Y”指的就是分子兩端的酪氨酸殘基，是最有效的食欲肽之一。CCK由115個CCK氨基酸前體衍生而來，包括硫酸化的CCK-8和CCK-7、非硫酸化的CCK-8和CCK-7、CCK-5等[17]，是第一個被證明具有厭食作用的腸道激素。既往研究發(fā)現(xiàn)CCK在腸道平滑肌的分布及興奮作用向直腸方向呈階梯遞減趨勢[18]，NPY的Y1和Y2受體mRNA在小鼠降結(jié)腸表達[19]，可溶性LP受體在胃腸道中大量存在[20]，傳入和傳出迷走神經(jīng)末梢均含可溶性LP受體[21]。由此可推測，CSMCs分泌LP、NPY、CCK-8影響攝食行為，其藥物發(fā)揮治療厭食作用機制可能通過調(diào)節(jié)其CSMCs中的LP、NPY、CCK-8表達。故此，本實驗對治療小兒厭食的有效藥物，即理脾復(fù)方制劑和硫酸鋅口服液進行相關(guān)研究。

理脾復(fù)方制劑原名為運脾散(院內(nèi)制劑名為運脾顆粒)，是貴州中醫(yī)藥大學治療厭食的經(jīng)驗方，該方為“四君子湯”和“平胃散”化裁而來，由蒼術(shù)、白術(shù)、茯苓、山藥、薏苡仁、陳皮、枳殼、神曲、甘草共同組成。在該方藥物中，100%藥物含揮發(fā)油，揮發(fā)油多為芳香藥物所含，“香能通氣，能主散，能醒脾陰……能和合五臟”(《藥品化義》)。此外，芳香之藥有化濕、燥濕、理氣、溫中醒脾之效，如《醫(yī)方考》所言：“脾胃喜甘而惡苦，喜香而惡穢，喜燥而惡濕，喜利而惡滯……香能開胃竅。”另外，該方藥物中，100%藥物歸脾經(jīng)，提示以健脾、運脾之效為主。最后，67%藥物甘味，44%藥物性味為辛、苦、溫，33%藥物性味為平，22%藥物性味為寒，提示組方藥物苦甘相得、辛苦相宜、溫寒并用，使該方充分發(fā)揮行濕、燥濕、化濕、下濕之效，“理順脾胃氣機轉(zhuǎn)樞，恢復(fù)胃納脾運”作用。但其發(fā)揮治療小兒厭食癥的作用具體機制則不詳。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10%低、中、高劑量理脾復(fù)方制劑含藥血清促進CSMCs增殖，提示理脾復(fù)方制劑可影響結(jié)腸運動及CSMCs腦腸肽的表達。此外，本實驗研究發(fā)現(xiàn)，10%理脾復(fù)方制劑含藥血清有上調(diào)CSMCs中LP、NPY蛋白濃度、蛋白相對表達量、mRNA相對表達量，下調(diào)CCK-8蛋白濃度及蛋白相對表達量，且提示調(diào)節(jié)LP、NPY、NPY的作用隨理脾復(fù)方制劑的劑量增大而增強，證實理脾復(fù)方制劑有調(diào)控CSMCs中LP、NPY、CCK-8表達，這可能是理脾復(fù)方制劑發(fā)揮治療厭食作用的重要機制和靶點之一。

生長遲緩和攝食減少是鋅缺乏的早期癥狀[22]，研究顯示缺鋅飲食后的3～5 d內(nèi)，食物攝取量被抑制[23]。由于鋅具有改善味覺及增進食欲的作用，許多早期厭食患兒家長及臨床兒科醫(yī)生給予補充鋅元素，鋅補充劑也被兒童普遍接受，且無論補充哪種鋅鹽(硫酸鋅、醋酸鋅或葡萄糖酸鋅)都是有效的[24]。但補充微量元素鋅是否影響CSMCs的增殖或其內(nèi)腦腸肽的表達，未見相關(guān)報道。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，10%硫酸鋅含藥血清促進CSMCs增殖，上調(diào)CSMCs中LP、NPY蛋白濃度、蛋白相對表達量、mRNA相對表達量，下調(diào)CSMCs中CCK-8蛋白濃度、蛋白相對表達量，證實硫酸鋅能調(diào)控CSMCs中LP、NPY、CCK-8表達，這可能是硫酸鋅發(fā)揮治療厭食作用的另一重要機制。

綜上，理脾復(fù)方制劑和硫酸鋅可促進CSMCs增殖，影響CSMC中LP、NPY、CCK-8的表達，可能是治療厭食的重要作用機制之一。但是，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10%理脾復(fù)方制劑和硫酸鋅含藥血清對CCK-8 mRNA調(diào)控作用與蛋白濃度及蛋白相對表達量調(diào)控作用相反，這提示理脾復(fù)方制劑與硫酸鋅對CSMCs中CCK-8在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平影響上可能不同，但其具體機制有待進一步研究。