劉 玉 謝 緯 祝慶華 李敏芳 唐明文 陳 生

（廣東省深圳市中醫(yī)院，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518003）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種持續(xù)進(jìn)展的以氣流受限為特征的疾病，嚴(yán)重危害人類健康，與接觸有毒顆粒和氣體的顯著暴露引起的氣道和肺泡異常有關(guān)，致殘率和死亡率極高，社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題［1］。COPD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前臨床用于治療COPD的藥物難以取得滿意的療效。

香煙煙霧刺激引起肺內(nèi)氧化應(yīng)激是吸煙導(dǎo)致COPD的始動環(huán)節(jié)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是造成肺組織細(xì)胞凋亡促進(jìn)COPD發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制［7］。冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)藥用真菌，具有補(bǔ)肺益腎、止血化痰等功效，主要用于治療久咳虛喘、勞嗽咯血、陽痿遺精、腰膝酸痛等癥［2］。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，冬蟲夏草主要成分含有腺苷、多種氨基酸、甘露醇、麥角醇、糖及多種維生素、微量元素等，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用［3-4］。大量臨床研究也顯示，冬蟲夏草治療肺部疾病具有確切臨床療效［5-6］。有研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草可干預(yù)糖尿病、腎病動物模型ERS發(fā)展［8-9］，但冬蟲夏草是否能通過抵抗ERS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡而發(fā)揮治療COPD尚不完全明確。本實(shí)驗(yàn)采用香煙煙霧提取物（CSE）誘導(dǎo)A549細(xì)胞方法建立體外COPD細(xì)胞模型，通過冬蟲夏草干預(yù)COPD細(xì)胞模型，觀察細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路p-PERK-eIF2α相關(guān)蛋白水平的變化，探討冬蟲夏草調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路PERK-eIF2α抑制香煙煙霧提取物刺激下的人支氣管上皮細(xì)胞凋亡，為冬蟲夏草的合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人肺泡上皮細(xì)胞（A549細(xì)胞，廣州華韻生物科技有限公司）。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（0.25%）（美國Gibco公司，批號分別為11966025、10099141、25200056）；磷酸鹽緩沖（PBS，美國Hyclone公司，批號：SH3025601）；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Solarbio，批號：CA1020）；Hoechst 33342染色液（中國碧云天公司，批號分別為C0017、C1022）；中強(qiáng)度RIPA裂解液（弗德生物，批號：SBJ-0226）；BAC蛋白定量試劑盒（弗德生物，批號：FD2001）；PERK抗體（affinity，批號：AF5304）；PERK抗體（affinity，批號：DF7576）；eIF2α（affinity，批號：AF6087）；p-eIF2α（af?finity，批號：AF3087）。1500型全波長酶標(biāo)儀、371型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；超凈工作臺，蘇州精華安泰技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 蟲草菌液的準(zhǔn)備 對質(zhì)量濃度0.99 g/mL的蟲草菌液（購自杭州中美華東制藥有限公司）進(jìn)行過濾除菌，細(xì)胞干預(yù)之前用含10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基將蟲草菌液稀釋成10、50、100、200 mg/L［10-11］。

1.4 香煙煙霧提取物的制備 將3支去過濾嘴香煙依次連于自制的抽吸裝置［12］中點(diǎn)燃，負(fù)壓吸引，吸入的煙霧經(jīng)過入口3 mL的PBS中制成懸液，密閉搖勻，經(jīng)0.22濾膜濾器過濾除菌。為確保每次制備及干預(yù)所用CSE質(zhì)量濃度相同，在初次制備CSE時，使用分光光度儀在CSE最佳吸光波長（270～280 nm）范圍內(nèi)確定其初始吸光度值，保證每次制備的CSE吸光度值相同。制備好的CSE原液用含10%胎牛血清RPMI-MI-1640培養(yǎng)基按濃度0.5%、1%、2%、5%稀釋，為確保CSE中有效成分，每次干預(yù)前30 min制備，采用0.22 μm過濾器過濾。

1.5 MTT法測定CSE干預(yù)濃度和時間 分別接種A549細(xì)胞于5個96孔板中培養(yǎng)，每個培養(yǎng)板每孔分別加入100 μL用含10%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋的0.5%、1%、2%、5%CSE溶液，每個干預(yù)孔均設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)空白孔（不含細(xì)胞和CSE的培養(yǎng)基）和對照孔（含細(xì)胞的培養(yǎng)基，無CSE）。5個培養(yǎng)板分別培養(yǎng)6、10、16、24、48 h，PBS沖洗，每孔加10 μL MTT（5 mg/mL），于培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀震蕩，吸去上清，每孔加100 μL DMSO，用錫紙包裹避光，吸光度570 nm處測量各孔的吸光度值并記錄。計算細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)孔-空白組）/（對照組-空白組）×100%。根據(jù)存活率確認(rèn)后續(xù)實(shí)驗(yàn)最佳CSE質(zhì)量濃度和作用時間。

1.6 LDH法檢測冬蟲夏草菌液對A549細(xì)胞的損傷接種細(xì)胞至96孔板，每孔100 μL，密度大約為2×105個/mL，置培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h，分組設(shè)對照組（含細(xì)胞的培養(yǎng)基）、樣品最大酶活性對照組（用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔）和冬蟲夏草組（蟲草菌液濃度0、10、50、100、200 mg/L），各組細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，在檢測時點(diǎn)前1 h，在樣品最大酶活性對照孔中加入20 μL LDH釋放劑，培養(yǎng)箱中孵育1 h，離心，每孔取上清液120 μL至新的96孔板，按照LDH檢測說明書操作，測定490 nm波長處吸光度值（A490值）。LDH活力（%）=（A試驗(yàn)組-A對照組）/（A細(xì)胞最大酶活性對照-A對照組）×100%。

1.7 MTT法檢測蟲草菌液和CSE對A549細(xì)胞活力的影響 接種細(xì)胞至96孔板，每孔100 μL，密度大約為2×105個/mL。細(xì)胞分組設(shè)空白組（不含細(xì)胞的培養(yǎng)基）、對照組（含細(xì)胞的培養(yǎng)基）、CSE組、冬蟲夏草組（蟲草菌液含量10、50、100 mg/L）。CSE組加入100 μL 2%CSE，冬蟲夏草組加入100 μL蟲草菌液和100 μL 2%CSE，孵育24 h后，PBS沖洗，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），避光培養(yǎng)4 h，吸去上清，每孔加入100 μL DMSO，酶標(biāo)儀震蕩，吸光度570 nm處測量各孔的吸光度值并記錄。計算細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（對照組-空白組）×100%。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將A549細(xì)胞接種于含10%的DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和鏈霉素），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁達(dá)到80%～90%時，加入0.25%胰蛋白酶消化、傳代。將A549細(xì)胞分為空白對照組、CSE組、冬蟲夏草組?？瞻捉M加入培養(yǎng)基，CSE組加入2%CSE，冬蟲夏草組加入蟲草菌液（100 mg/L）和2%CSE。各組均孵育24 h。

1.9 Hoechst 33342染色檢測細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞根據(jù)以上方法進(jìn)行處理后，吸棄原有培養(yǎng)基，加入100 μL Hoechst 33342染色液。將細(xì)胞置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20～30 min，吸棄染色液，用PBS或培養(yǎng)液洗滌2～3次后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。A549細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)聚集，核固縮和凋亡小體的出現(xiàn)被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。各組細(xì)胞隨機(jī)挑選3個視野進(jìn)行凋亡細(xì)胞及總細(xì)胞計數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)儀檢測細(xì)胞凋亡 根據(jù)Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作。將處理后的各組細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、洗滌后置于流式管中，使用 400 μL 1×Annexin V 結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入 5 μL Annexin V染液，混勻，2～8℃避光孵育15 min；加入10 μL PI染液，2～8℃避光孵育5 min。使用流式細(xì)胞儀檢測凋亡。

1.11 Western blotting檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白表達(dá) 分組的各組細(xì)胞進(jìn)行以上干預(yù)后，PBS洗滌3遍細(xì)胞裂解液，置于冰上30 min。離心取上清液，BCA法測定蛋白濃度并定量，經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，50 mol/L脫脂牛奶封閉，分別加入 p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、BAX、Bcl抗體（1∶2 000），4 ℃過夜，TBST洗3次，加對應(yīng)1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，使用ECL-plus試劑盒發(fā)光，通過生化檢測系統(tǒng)成像并分析結(jié)果，以β-actin作為內(nèi)參照，檢測目的蛋白表達(dá)情況。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為（SD），多組間差異使用單因素方差分析進(jìn)行評估，LSD檢驗(yàn)比較兩組間的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSE對A549細(xì)胞存活率的影響 用不同濃度的CSE處理A549細(xì)胞不同時間，細(xì)胞的存活率均呈下降趨勢，且CSE干預(yù)的時間越長、濃度越大，細(xì)胞存活率下降越明顯。根據(jù)MTT法測定的細(xì)胞存活率繪制生存曲線（圖1），參照IC50和曲線下降趨勢，確定2%CSE干預(yù)24 h用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2 冬蟲夏草液對正常A549細(xì)胞的毒性作用 見表1。細(xì)胞上清LDH檢測結(jié)果顯示，200 mg/L蟲草菌液對正常培養(yǎng)的A549細(xì)胞可能存在毒性，其他質(zhì)量濃度的蟲草菌液（10～100 mg/L）對正常培養(yǎng)的A549細(xì)胞無明顯毒性。

表1 各組細(xì)胞上清LDH活性比較（U/L，±s）

表1 各組細(xì)胞上清LDH活性比較（U/L，±s）

注：與對照組比較，△P<0.05。

組別對照組冬蟲夏草組蟲草菌液質(zhì)量濃度（mg/L）0 10 50 100 200 n 666 6 6 LDH活性47.01±3.23 47.52±2.81 48.54±2.76 48.26±3.05 70.19±3.27△

2.3 冬蟲夏草液有效干預(yù)質(zhì)量濃度篩選 見表2。MTT法檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，CSE干預(yù)組細(xì)胞活力顯著降低（P<0.01）；與CSE干預(yù)組比較，蟲草50、100 mg/L可顯著提高細(xì)胞存活率（P<0.01），其中100 mg/L最為顯著，而10 mg/L無明顯影響，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用冬蟲夏草100 mg/L進(jìn)行。

表2 各組細(xì)胞存活率比較（%，±s）

表2 各組細(xì)胞存活率比較（%，±s）

注：與空白組比較，△P<0.05；與CSE組比較，*P<0.05。下同。

組別空白組CSE組冬蟲夏草組質(zhì)量濃度（mg/L）--1 0 50 100 n66666細(xì)胞存活率103.00±3.01 51.49±3.87△55.23±2.93△81.52±3.76*95.37±4.22*

2.4 Hoechst 33342染色檢測冬蟲夏草對細(xì)胞凋亡的影響 見圖2，表3。結(jié)果顯示，空白組的細(xì)胞較少有染色質(zhì)凝集，核萎縮現(xiàn)象，凋亡小體較少；與空白組相比，CSE組細(xì)胞出現(xiàn)核凝聚，細(xì)胞皺縮，Hoechst 33342染色明顯加深等，凋亡小體較多（圖2b），且凋亡率顯著升高，與空白組的凋亡率比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與CSE組相比，冬蟲夏草組細(xì)胞皺縮和凝集明顯減輕，凋亡小體也明顯減少（圖2c），與CSE組的凋亡率比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。

表3 各組Hoechst 33342染色檢測A549細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

表3 各組Hoechst 33342染色檢測A549細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

組別空白組CSE組冬蟲夏草組質(zhì)量濃度（mg/L）-2%100 n 666凋亡率4.26±0.97 54.21±1.13△10.33±1.02*

圖2 各組Hoechst 33342染色檢測A549細(xì)胞凋亡情況（200倍）

2.5 流式細(xì)胞檢測冬蟲夏草對細(xì)胞凋亡的影響 見圖3，表4。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，CSE組處理使細(xì)胞凋亡率升高至12.7%（P<0.05）；與CSE組比較，冬蟲夏草干預(yù)可使細(xì)胞凋亡率降低至3.8%，兩組細(xì)胞凋亡率相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。

圖3 各組流式細(xì)胞檢測A549細(xì)胞凋亡情況

表4 各組流式細(xì)胞檢測A549細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

表4 各組流式細(xì)胞檢測A549細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

組別空白組CSE組冬蟲夏草組質(zhì)量濃度（mg/L）-2%100 n 6 6 6凋亡率1.00±0.22 12.70±0.81△3.80±0.64*

2.6 冬蟲夏草對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子表達(dá)的影響 見圖4，表5。Western blotting結(jié)果顯示，與正常組相比，CSE組 p-eIF2α、p-PERK、Bax蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P<0.05），Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05）；與CSE組比較，冬蟲夏草組p-eIF2α、Bax蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P<0.05），Bcl-2表達(dá)上調(diào)（P<0.05），Bax/Bcl-2比值降低（P<0.05）。

表5 各組A549細(xì)胞PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、Bax、Bcl-2表達(dá)水平比較（%，±s）

表5 各組A549細(xì)胞PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、Bax、Bcl-2表達(dá)水平比較（%，±s）

組別空白組CSE組冬蟲夏草組n 6 6 6 p-PERK/PERK 0.05±0.03 0.45±0.04△0.39±0.05 p-eIF2α/eIF2α 0.07±0.05 0.99±0.07△0.51±0.06*Bax/β-actin 0.97±0.05 1.43±0.06△1.02±0.04*Bcl-2/β-actin 0.92±0.07 0.89±0.08 1.73±0.06*Bax/Bcl-2 0.92±0.06 1.41±0.07△0.43±0.05*

圖4 A549細(xì)胞PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)

3 討 論

ESR廣泛存在于應(yīng)激的真核細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)應(yīng)激過于強(qiáng)烈或持續(xù)時間長，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)不能恢復(fù)時，未折疊蛋白反應(yīng)可激活細(xì)胞內(nèi)凋亡信號上調(diào)凋亡分子表達(dá)，最終引起細(xì)胞內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13-14］。ESR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要有IRE1、PERK、ATF6 3條通路，PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時的首先活化途徑，主要促進(jìn)細(xì)胞的自噬和凋亡?；罨驪ERK可磷酸化其下游分子eIF2α，抑制促存活蛋白Bcl-2和抗凋亡基因Bcl-2相關(guān)的X蛋白（Bax）表達(dá)，改變細(xì)胞的氧化狀態(tài)，提高細(xì)胞對凋亡的敏感性［15］。細(xì)胞凋亡控制基因Bcl-2家族主要包含Bcl-2和Bax，研究表明，Bcl-2升高，抑制細(xì)胞凋亡，Bax增高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2和Bax的比值決定著細(xì)胞受凋亡刺激后的生存能力［16-17］。大量研究表明ERS介導(dǎo)的細(xì)胞過度凋亡參與了COPD肺結(jié)構(gòu)破壞［18-20］，提示調(diào)節(jié)ERS信號通路抵制細(xì)胞凋亡或?qū)⑹侵委烠OPD的有效途徑。

本研究采用2%CSE處理A549細(xì)胞24 h，與空白組比較，細(xì)胞凋亡顯著增加，且ERS信號通路蛋白peIF2α、p-PERK的表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax比值明顯降低，說明出現(xiàn)明顯ERS相關(guān)凋亡，和文獻(xiàn)［7，21］中CSE劑量和時間不完全一致，但結(jié)果具有一致性。

冬蟲夏草是中醫(yī)補(bǔ)益肺腎法治療COPD的一味名貴中藥，具有悠久的用藥歷史。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為冬蟲夏草性味甘、平，主要?dú)w肺、腎兩經(jīng)，功效主要有益肺腎，止咳嗽，補(bǔ)虛損，益精氣。冬蟲夏草被廣泛用于呼吸系統(tǒng)疾病治療，有研究提示其保護(hù)作用可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)［22］。為了證實(shí)冬蟲夏草的保護(hù)機(jī)制是否與調(diào)節(jié)ESR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，本研究采用CSE誘導(dǎo)的A549細(xì)胞作為COPD細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草100 mg/L可逆轉(zhuǎn)CSE誘導(dǎo)的A549細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白p-eIF2α、p-PERK的表達(dá)上調(diào)，抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路PERK-eIF2α的激活。

研究還發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，CSE組促凋亡蛋白BAX明顯增加，抗凋亡蛋白Bcl-2降低，Bax/Bcl-2比值升高，流式細(xì)胞和Hoechst 33342染色顯示凋亡率增加，表明香煙引起肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路PERK-eIF2α活化，并進(jìn)一步誘導(dǎo)了肺泡上皮細(xì)胞凋亡。與CSE組相比，蟲草組Bax/Bcl-2比值降低，流式細(xì)胞和Hoechst 33342染色顯示凋亡率下降，提示冬蟲夏草組可通過PERK-eIF2α通路，下調(diào)Bax/Bcl-2比值，減輕A549細(xì)胞凋亡。

綜上，本實(shí)驗(yàn)初步證明冬蟲夏草通過抑制過度ERS，發(fā)揮抗人肺泡上皮細(xì)胞凋亡作用，其作用機(jī)制涉及PERK-eIF2α信號通路，表現(xiàn)為冬蟲夏草可以降低p-eIF2α、p-PERK的表達(dá)，從而減輕ERS凋亡信號通路激活，減少細(xì)胞凋亡。