徐源鴻 邵明廣 王天陽 李思強(qiáng) 李恩中

(黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 463000)

精子發(fā)生（Spermatogenesis）是由精原干細(xì)胞（Spermatogonial Stem Cells,SSCs）經(jīng)過嚴(yán)格調(diào)控的自我更新和分化成為成熟精子的過程[1]。同時，精子發(fā)生是一個復(fù)雜、精密調(diào)控的過程，一旦發(fā)生異常將會導(dǎo)致無精癥、弱精癥和少精癥等癥狀，引起雄性不育[1]。雄性不育不僅制約畜牧業(yè)的發(fā)展，還危及人類健康，世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，全球有10%～15%的育齡夫婦存在不孕不育問題，而男性不育占50%，已成為影響人類健康的第三大疾病[2]。目前，雄性不育的發(fā)病機(jī)制還不清楚，治療效果不理想，尚需對其原因、機(jī)制及治療手段等進(jìn)行更加深入的研究。但雄性不育動物模型的構(gòu)建與獲得是開展該類研究的基礎(chǔ)與前提。小鼠無精癥模型在研究雄性不育發(fā)病機(jī)制及相關(guān)保健或治療性藥物篩選方面發(fā)揮重要作用，是研究雄性不育的重要模型[3]。由于不同的構(gòu)建方法顯著影響小鼠無精癥模型的建立，如穩(wěn)定性差異較大、對其他器官的影響不同等[4-8]，甚至同一建模方法也會產(chǎn)生較大的個體差異[9-11]，顯著影響后續(xù)研究的準(zhǔn)確性。因此，本文從化學(xué)方法（化療藥物）、物理方法（放射性射線、隱睪手術(shù)）及生物方法（轉(zhuǎn)基因動物）建立小鼠無精癥模型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并分析具體方法的特點(diǎn)，以期為無精癥動物模型研究、產(chǎn)生機(jī)理及藥物篩選等方面的研究提供一定的參考。

1 化學(xué)方法

由于精子發(fā)生易受某些化療藥物（如抗癌劑）的抑制，所以以化療藥物構(gòu)建無精癥動物模型的方法有效可行[10]。此外，注射化療藥物簡單易行，對實(shí)驗人員的操作熟練度要求相對較低。因此，以化療藥物構(gòu)建無精癥模型已成為現(xiàn)在最主流的方法之一。

1.1 白消安

白消安（Busulfan,BU）又稱馬利蘭，為氮芥類烷化劑甲基磺酸酯類的代表藥物。臨床上主要用于治療慢性粒細(xì)胞白血病及造血干細(xì)胞移植預(yù)處理和抗腫瘤等[4,12]。由于白消安可以使DNA 單鏈和雙鏈交聯(lián)，精原干細(xì)胞在G0/G1 期發(fā)生阻斷，可用于無精模型的構(gòu)建。

常用的白消安建模濃度為10、20、30、40、50mg/kg[5,13-18]，通過試驗證實(shí)，單次腹腔注射50mg/kg 劑量為致死劑量[17]。Zhao 等單次腹腔注射30mg/kg 濃度的白消安后發(fā)現(xiàn)一重要糖酵解酶（PGAM1）的表達(dá)量下調(diào)[14]；由于P53、Caspase 3、Caspase 6 和Caspase 9 與細(xì)胞凋亡相關(guān)，并且當(dāng)PGAM1 表達(dá)量下降后，上述細(xì)胞凋亡信號被激活放大，故推測PGAM1 通過上述凋亡途徑來引起生精細(xì)胞凋亡。Olfati 等通過使用30mg/kg白消安成功構(gòu)建了小鼠無精癥模型，并使用促卵泡生成激素（Follicle-stimulating Hormone,FSH）和雌二醇（Estradiol2,E2）處理模型小鼠后發(fā)現(xiàn)，其在一定程度上使試驗小鼠恢復(fù)了精子發(fā)生的能力，表明促卵泡生成激素（FSH）和雌二醇（E2）可能具有降低白消安效應(yīng)的能力[15]。王得志優(yōu)化了白消安的最適濃度，通過構(gòu)建5 個濃度梯度的無精癥模型發(fā)現(xiàn)，注射30mg/kg 白消安后第4 周末絕大多數(shù)睪丸單倍體細(xì)胞被排除，少部分生精細(xì)胞仍留在體內(nèi)，且在該濃度下小鼠的死亡率（6.5%）在接受范圍內(nèi)，因而確定了30mg/kg 白消安濃度為最佳的小鼠無精癥建模濃度[17]。參見表1。后有關(guān)學(xué)者更改了40mg/kg 濃度白消安的注射方式，將單次腹腔注射改為3h 內(nèi)分兩次腹腔注射，且考慮到溶劑二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide,DMSO）的毒理性質(zhì)，將DMSO 濃度降為5%后，小鼠存活率顯著提升（存活率為100%）[19]。

表1 不同濃度白消安處理后小鼠的行為狀態(tài) [17]

由于白消安具有骨髓抑制作用，會導(dǎo)致血液中紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血細(xì)胞等數(shù)量減少，從而導(dǎo)致小鼠因缺血死亡[5]。為此，研究報道，在腹腔注射白消安時，同時注射同源骨髓細(xì)胞的方法可以顯著降低小鼠死亡率[20]。張茨等報道了在停藥4周后小鼠體內(nèi)血象趨于正常，這表明小鼠造血功能已趨于正常[5]；基于此種現(xiàn)象，張茨后又提出睪丸內(nèi)注射白消安的方法，發(fā)現(xiàn)該方法可降低白消安在血液循環(huán)中的濃度，顯著提高小鼠給藥后的存活率。

此外，利用白消安來構(gòu)建小鼠無精子癥模型還面臨著模型差異性的問題，相同劑量的白消安得到最終的死亡率結(jié)果也會出現(xiàn)差異[5,15,17,21]。造成這一顯著差異的原因在于部分白消安經(jīng)腹腔注射進(jìn)入血液循環(huán)后被消耗或被代謝掉，使得白消安濃度低于理論濃度[11]。此外，小鼠個體差異及生長環(huán)境的影響也會使模型具有差異性[6]。

1.2 環(huán)磷酰胺

環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide,CP）是一種光譜抗腫瘤藥，屬周期非特異性藥，與白消安所代表的氮芥的作用機(jī)制相同。臨床發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺會導(dǎo)致男性性腺功能衰退，睪丸縮小及精子減少[22]。伍歡等采用腹腔注射40mg/kg 的環(huán)磷酰胺的方法來構(gòu)建小鼠無精模型，環(huán)磷酰胺處理后小鼠睪丸重量顯著降低，睪丸標(biāo)志酶γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase,γ-GT，調(diào)節(jié)生精細(xì)胞周期）表達(dá)量顯著上升，同時乳酸脫氫酶（Lactic Dehydrogenase,LDH，睪丸生精細(xì)胞成熟的標(biāo)志酶之一）表達(dá)量較對照組顯著下降[7]。不難發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺處理后其睪丸內(nèi)大部分生精細(xì)胞的成熟過程被阻斷。

1.3 聯(lián)合應(yīng)用博來霉素、依托泊苷及順鉑

BEP（Bleomycin,Etoposide and Cis-platin,BEP）治療，即聯(lián)合博來霉素、依托泊苷及順鉑進(jìn)行治療惡性卵巢生殖細(xì)胞及性索間質(zhì)腫瘤[23]。臨床發(fā)現(xiàn)，該方法可以在一定程度上對這兩種疾病起到一定的治療作用，但患者在治療后短時間內(nèi)會出現(xiàn)少精子癥或無精子癥，這對青少年，尤其是對生育有一定需求的患者來說不利[24]。有研究表明，亞性和慢亞性BEP 治療雖然會導(dǎo)致模型鼠生精功能衰退，但這也只是一定程度上的衰退，未能使其精子發(fā)生的功能完全中斷[24]。Marcon 等將試驗鼠長期置于BEP 環(huán)境中來驗證該方法是否會對精原干細(xì)胞的形成產(chǎn)生影響，調(diào)整體重及表面積使其所使用的BEP 劑量等同于臨床上人體所需劑量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BEP 處理后其睪丸重量較正常試驗鼠偏低[25]。雖然BEP 處理會降低試驗鼠精原干細(xì)胞群落的大小及功能，但這種效應(yīng)是短暫的，甚至是可以完全恢復(fù)[26]。與前兩種方法相比，這種方法穩(wěn)定性較低，不為大多數(shù)學(xué)者所重視。

對試驗小鼠施以化療藥物處理后模型效果顯著。腹腔注射30mg/kg 白消安模型最為穩(wěn)定試驗動物在該濃度下的致死率在倫理上是可以接受的。但為了最大程度上利用試驗動物，盡可能減少浪費(fèi)，睪丸注射白消安不失為一個比較明智的做法，但該方法較腹腔注射而言較為煩瑣。環(huán)磷酰胺作用機(jī)制與白消安一致，這里不再贅述。聯(lián)合應(yīng)用博來霉素、依托泊苷及順鉑（BEP）模型穩(wěn)定性未達(dá)到可接受范圍，不被推薦。

2 物理方法

2.1 放射性射線

放射性射線可導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡，引起精子衰退，甚至引發(fā)無精癥。射線照射后睪丸內(nèi)部精原干細(xì)胞迅速凋亡，而少數(shù)精原干細(xì)胞則活躍旺盛，以修補(bǔ)損傷系統(tǒng)[27]。輻射對生殖系統(tǒng)的損傷主要是通過產(chǎn)生活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，從而損傷未成熟生殖細(xì)胞的DNA 這一途徑來介導(dǎo)的[28]。低劑量照射睪丸即可誘導(dǎo)精原細(xì)胞數(shù)量減少（0.03Gy）和精原細(xì)胞與精母細(xì)胞染色體損傷（0.05Gy）。

2.1.1 X 射線

X 射線照射會引起睪丸生精上皮壞死、各級生精細(xì)胞排列混亂，組織分析發(fā)現(xiàn)有空腔出現(xiàn)及生精小管腔內(nèi)精子數(shù)量急劇下降等現(xiàn)象[29]。徐銳利用8GyX 射線（照射速率2.28Gy/min）對小鼠進(jìn)行全身照射，照射后小鼠食欲下降，體重減輕，活動減少但并未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象[30]。研究表明，西羅莫司靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin,mTOR 蛋白）參與細(xì)胞生長、增殖、分化與細(xì)胞凋亡自噬，mTORC1 作為其重要組成蛋白，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)重要靶點(diǎn)[31]。徐銳通過研究證實(shí)，X 射線可過度激活mTORC1 信號通路，進(jìn)而導(dǎo)致生精細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[30]。劉鳳華等[29]采用不同濃度X 射線局部照射睪丸10min。其結(jié)果提示，當(dāng)X 射線照射劑量達(dá)到1400cGy（14Gy）和1600cGy（16Gy）時可使小鼠不育。射線劑量過高則會導(dǎo)致小鼠死亡，過低會導(dǎo)致相應(yīng)的模型構(gòu)建失敗。Rowley 等報道，當(dāng)人體接受200～300cGy 劑量的射線后將導(dǎo)致生精障礙，需30 個月才可以恢復(fù)；在400～600cGy 時需要長達(dá)5 年的時間才可以恢復(fù)；當(dāng)劑量超過800cGy 時將導(dǎo)致終身不育[32]。

2.1.2 60Co-γ 射線

60Co-γ 射線多用于腫瘤的放射性治療，但由于其常會引起性腺生精功能損傷甚至喪失，亦會導(dǎo)致下丘腦、垂體的損傷，引起體內(nèi)激素分泌異常。同時，由于60Co-γ 射線的溫和性，多有學(xué)者采用60Co-γ 射線來構(gòu)建無精癥[33,34]。王磊等對小鼠進(jìn)行全身放射性照射，劑量為4Gy，劑量率為0.55/min，輻射完成后第14 天發(fā)現(xiàn)精子活力下降、畸形率升高、生精細(xì)胞壞死、生精上皮退化、結(jié)構(gòu)改變、生精小管出現(xiàn)萎縮等現(xiàn)象，且這一癥狀隨時間延長而加重[35]。

2.2 隱睪手術(shù)

隱睪癥（Cryptorchidism）是指一側(cè)或兩側(cè)睪丸未能下降到陰囊而滯留在體內(nèi)腹腔中，是目前臨床上常見的男性不育癥狀[36]。絕大多數(shù)小鼠睪丸處于陰囊中，陰囊中溫度較腹腔低3～8℃不等，為精子發(fā)生提供了良好的溫度環(huán)境，有助于精子生成[37]。精子對所處環(huán)境要求極其苛刻，不當(dāng)?shù)陌l(fā)育溫度會導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡及精子發(fā)生障礙[8]。隱睪癥不僅會影響男性生精，同時還增加男性罹患睪丸癌的危險[38]。構(gòu)建隱睪模型時需在小鼠腹腔外皮開一個約1cm 的切口，而后將肌肉層打開，找到兩側(cè)脂肪頭后將其拉出小鼠體內(nèi)，斷開睪丸引帶后將脂肪頭捆綁在一起，最后依次縫合肌肉層和外皮[39]。此時小鼠睪丸存在于腹腔中，利用這一方法可以構(gòu)建出隱睪無精模型。隱睪試驗時，睪丸越在腹腔上方，模型構(gòu)建的越成功。Li 等發(fā)現(xiàn)，精子形成在初級精母細(xì)胞階段即被阻斷，并驗證了抗氧化藥物白藜蘆醇對恢復(fù)精子生成起到了一定的促進(jìn)作用[3]。Yi 等通過構(gòu)建隱睪模型發(fā)現(xiàn)，隱睪誘導(dǎo)生精細(xì)胞發(fā)生凋亡與自噬，且凋亡發(fā)生在隱睪手術(shù)完成后的第3 天[40]，這一研究提示我們是否可以將精子減少機(jī)制的研究轉(zhuǎn)移到細(xì)胞自噬與凋亡的相互作用中。探索如何抑制生精細(xì)胞的自噬與凋亡或許會為治愈隱睪癥帶來希望。

放射性射線雖然簡單，但高昂的成本使得眾多實(shí)驗室無法利用該方法構(gòu)建模型，而且不當(dāng)?shù)牟僮鞣椒赡軙?dǎo)致輻射泄漏而傷害實(shí)驗人員，甚至導(dǎo)致男性生殖障礙。成本低廉且簡單易行的隱睪手術(shù)不失為一種好的方法，不少實(shí)驗室通過構(gòu)建隱睪模型而獲取了一些重要的實(shí)驗成果，發(fā)現(xiàn)了幾個重要的與精子發(fā)生有關(guān)的基因[41-43]。

3 生物方法

將外源基因在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)染及整合，并將其移植到受體動物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，此時受體動物稱之為轉(zhuǎn)基因動物。制作轉(zhuǎn)基因動物的方法有顯微注射法、反轉(zhuǎn)錄病毒法、胚胎干細(xì)胞法、電脈沖法、精子載體導(dǎo)入法等，其中顯微注射法是制作轉(zhuǎn)基因動物最成功也是最常用的方法[44]。無精癥實(shí)驗中常用的轉(zhuǎn)基因小鼠是W/Wv 和SL/SLd 突變鼠。W/Wv 和SL/SLd 小鼠是通過使W 和SL 基因出現(xiàn)等位突變，進(jìn)而影響基因表達(dá)的效果[45]。生精細(xì)胞受此影響而出現(xiàn)不育現(xiàn)象。二者無精機(jī)制不同，其中W/Wv 突變小鼠是因為精原干細(xì)胞的清除，而SL/SLd 突變鼠則是由于支持細(xì)胞缺陷導(dǎo)致的[46]。已知哺乳動物西羅莫司靶蛋白（mTOR）與精子發(fā)生有千絲萬縷的聯(lián)系，而Rictor 是其重要組分。因而，董合玲等構(gòu)建了cKO 敲除鼠（特異性敲除睪丸內(nèi)支持細(xì)胞Rictor 基因），敲除鼠較正常小鼠的睪丸質(zhì)量與睪丸內(nèi)生精細(xì)胞數(shù)量均降低[47]。

由于轉(zhuǎn)基因小鼠培養(yǎng)條件苛刻，基因表達(dá)水平難以預(yù)料，而且絕大多數(shù)的模型轉(zhuǎn)基因表達(dá)率低，但個別基因又過表達(dá)，使得該方法成本昂貴，不為大家所重視。但近幾年發(fā)展起來的CRISPR-Cas9 系統(tǒng)使基因編輯(2020 年諾貝爾化學(xué)獎頒給了Emmanuelle Charpentier 和Jennifer A，以表彰她們在開發(fā)基因組編輯技術(shù)中發(fā)揮的重要作用) 得到了空前關(guān)注[48]，該技術(shù)可對靶基因進(jìn)行特定修飾，有望促進(jìn)轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的研究進(jìn)展。

4 展望

小鼠無精癥模型在雄性哺乳動物生育障礙研究中扮演重要角色?，F(xiàn)雖已證明無精癥的發(fā)生與多種因素有關(guān)，如藥物、溫度、射線等，但具體機(jī)制尚不明確。在構(gòu)建模型過程中，尋找最佳的實(shí)驗條件顯得尤為重要（即使其睪丸內(nèi)生精細(xì)胞完全消失、完全耗盡內(nèi)源性精子）。近年來，以無精癥模型為基礎(chǔ)開展精子發(fā)生機(jī)制的研究日益受到人們青睞。同時，通過此模型已幫助研究者篩選到益精效果顯著的藥物，如白藜蘆醇[9]、番茄素[49]等?？傮w而言（表2），使用化療藥物及隱睪手術(shù)構(gòu)建的無精癥模型穩(wěn)定性最佳；放射性射線雖簡單但高昂的儀器成本使該方法難以普及；利用精子對溫度的不耐受性雖也可以構(gòu)建合適的模型，但其不穩(wěn)定性仍需研究者考慮；轉(zhuǎn)基因動物方法初顯成效，雖成本昂貴，伴隨著各種新興基因編輯方法，轉(zhuǎn)基因動物模型必將在模型構(gòu)建方面前景廣闊。

表2 常用模型制備方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較